植物組織培養(yǎng)中的褐變現(xiàn)象及其防止措施.doc

植物組織培養(yǎng)中的褐變現(xiàn)象及其防止措施 摘要：細胞受損后，由于細胞區(qū)隔作用被破壞，毒性酚類或其氧化物醌類物質(zhì)毒害細胞，導致組織褐變，植物組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)低效或失敗。目前認為組織培養(yǎng)中褐變程度主要受外植體材料的基因型、生理狀態(tài)、種類、大小、預處理、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式的影響。在目前的研究中控制褐變的有效方法主要有低溫培養(yǎng)、暗培養(yǎng)、勤轉種、添加抗氧化劑、增效劑或吸附劑于培養(yǎng)基中等。關鍵詞:植物;組織培養(yǎng);褐變;防治方法褐變是植物組織培養(yǎng)中一種普遍存在的現(xiàn)象，是由于組織中多酚氧化酶被激活，使細胞酚類物質(zhì)被氧化而產(chǎn)生棕褐色醌類物質(zhì)，這種褐變現(xiàn)象又被稱為酚污染。多酚類物質(zhì)及其氧化物醌類物質(zhì)會抑制其它酶的活性，從而毒害整個外植體，嚴重影響外植體的脫分化、再分化和生長。褐變這種現(xiàn)象與菌類污染和過度含水化(即玻璃化)并稱植物組織培養(yǎng)的3大難題。目前褐變已成為植物組織培養(yǎng)發(fā)展的一大障礙1。 1褐變現(xiàn)象的原因1.1 非酶促褐變 非酶促褐變是由于細胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細胞程序化死亡或自然發(fā)生的細胞死亡，即壞死形成的褐變現(xiàn)象，并不涉及酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。諸多不利條件都可以造成細胞的程序化死亡，但這種褐變?nèi)舨扇∵m當措施或者愈傷組織適應了脅迫環(huán)境就不再發(fā)生。1.2 酶促褐變 多數(shù)認為，植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象主要是由酶促褐變引起的，即由多酚氧化酶( PPO，Polyphenol Oxidase)作用于天然底物酚類物質(zhì)而引起的。在正常條件下,細胞中的酚和醌之間保持一種動態(tài)平衡,醌類物質(zhì)水平較低;而酚氧化酶及其底物分布在正常組織的不同部位，酚類物質(zhì)分布在細胞的液泡內(nèi)，酶則分布在各種質(zhì)體或細胞質(zhì)內(nèi)，這種區(qū)域性分布致使底物與酶被質(zhì)膜分隔開來；但當外植體或培養(yǎng)材料處于機械損傷等逆境，或細胞受傷或衰老時，細胞膜結構或細胞 中物質(zhì)區(qū)域化分布的破壞會導致酚氧化酶釋放或合成，如果此時在合適的pH和溫度等條件下，酚氧化酶、酚類(底物)和氧發(fā)生酶促氧化反應，形成有毒的棕褐色醌類物質(zhì),從而使組織發(fā)生褐變。此外，組織的老化或病變也可激活酚氧化酶而引起褐變。一般認為,褐化是指外植體或培養(yǎng)材料接種后在組織培養(yǎng)過程中， 由于切割造成機械損傷,傷口處分泌出酚類化合物，在有氧的條件下，切面細胞中的酚類物質(zhì)為多酚氧化酶催化,氧化為醌,醌再通過非酶促反應產(chǎn)生有色物質(zhì)而導致組織褐變,變成棕褐色或暗褐色,并逐漸擴散到培養(yǎng)基中,抑制細胞內(nèi)其它酶的活性,影響細胞的正常代謝,毒害整個組織,甚至導致組織死亡。尤其是木本植物組織的外植體褐變死亡是其培養(yǎng)難度較大的主要因素。因此,探討褐化發(fā)生的機制及其影響因素,采取有效的防止褐化的措施,是保證植物組織培養(yǎng)成功 的關鍵所在。 2影響褐變的因素 2.1基因型 不同種植物、同種植物的不同類型或品種，在組織培養(yǎng)中發(fā)生褐變的頻率和程度都存在差異。這是由于各種植物表達的多酚類物質(zhì)種類、含量以及酚氧化酶的種類、活性存在差異，有些植物種類組織培養(yǎng)較易成功，有些則很困難。一般木本植物的酚類化合物含量比草本植物高，因而在組培過程中更容易發(fā)生褐變。例如在相同的培養(yǎng)基上誘導培養(yǎng)，孝順竹比小佛肚竹和風尾竹更易褐變2。2.2外植體生理狀態(tài) 材料本身的生理狀態(tài)不同，接種后褐變的程度也不同。通常分生部位接種后形成醌類物質(zhì)少而分化的部分形成醌類物質(zhì)較多，褐變隨著材料的組織木質(zhì)化程度和年齡而增加。 植物體內(nèi)酚類化合物的含量受到取材時間的影響。例如，柿的嫩芽莖尖的多酚氧化酶活性顯著高于休眠芽，以嫩枝莖尖為外植體進行培養(yǎng)時易褐變死亡3。同年6月份所取的核桃半木質(zhì)化新植莖芽萌發(fā)率高于冬季休眠芽和4月份嫩枝莖芽腋芽，且褐變率及褐變死亡率都較后兩者低4。2.3外植體的種類和大小 一般認為，木本植物較草本植物的外植體在培養(yǎng)過程中更容易發(fā)生褐變。外植體小的材料，由于切口所占比例較大而較易發(fā)生褐變。切口越大，酚類物質(zhì)被氧化的面積就越大， 褐變程度越嚴重5。2.4材料的預處理 材料在接種前經(jīng)過一定預處理可減輕外植體在培養(yǎng)中的褐變。預處理一般有低溫或黑暗條件下預培養(yǎng)；外植體在水或抗氧化劑中切割或浸泡，以減少外植體與氧的接觸和使水溶性多酚和醌類物質(zhì)充分的滲出外植體。例如竹在培養(yǎng)時外植體在無菌水或半胱氨酸(100mg/L) 溶液中浸泡 24 h有利于控制褐變6；魔芋培養(yǎng)過程中，在1%的檸檬酸溶液中切割外植體，可有效抑制外植體褐變；黑暗預處理能減輕蝴蝶蘭R4品種葉片外植體的褐變程度，其中以預處理10d的褐變最輕;未經(jīng)暗處理的褐變最重且多酚氧化酶(PPO)活性最大7。2.5培養(yǎng)條件 培養(yǎng)過程中,低溫比高溫有利于抑制褐變，高溫會促進酚類氧化;而低溫抑制酚類合成， 降低多酚氧化酶的活性,減少酚類氧化。暗培養(yǎng)或弱光培養(yǎng)對抑制褐變也有一定的作用。例如小佛肚竹在暗培養(yǎng)和弱光(800Lx)下培養(yǎng)的莖尖和莖段的褐變率比在強光(200Lx)下培養(yǎng)有所下降。2.6培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式 培養(yǎng)基中過高的糖、絲氨酸濃度會加劇褐變8。在相同濃度下，蔗糖對褐變的抑制效果要優(yōu)于葡萄糖。礦質(zhì)元素也對褐變存在影響，在蝴蝶蘭初代過程中，培養(yǎng)基中Fe3+、Cu2+,濃度越高，褐變越嚴重。這是由于Fe3+、Cu2+可作為催化劑加速多酚與活性氧(ROS)作用而被氧化為醌類物質(zhì)。棉花胚性愈傷組織培養(yǎng)基中，氮源配比不合適也會引起褐變。曼地亞紅豆杉愈傷組織誘導及繼代過程中，培養(yǎng)基pH值的變化可引起酚類與酚氧化酶結合部位的改變， 從而影響酚類的氧化程度。而細胞分裂素類激素能促進酚類化合物的合成或刺激多分氧化酶活性提高,加速褐變。例如，隨著6-BA使用濃度增加，可增加牡丹培養(yǎng)中腋芽外植體的褐變和死亡數(shù)。在培養(yǎng)基中加入抗氧化物質(zhì)可有效降低褐變，例如在對東方杉愈傷組織培養(yǎng)基中加入抗壞血酸250mg/L，亞硫酸鈉250mg/L，檸檬酸5000mg/L組合能有效降低褐變;茶條槭帶芽莖段進行芽增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入1/2該組合也能有效降低污染和控制褐變。在蝴蝶蘭無菌苗培養(yǎng)基中添加200mg/L谷胱甘肽對分化生長和減少褐變綜合效果好;Vc和硫代硫酸鈉對褐變抑制作用強,同時也抑制外植體生長分化;活性炭抑制褐變效果好,但抑制分化。不同的培養(yǎng)方式引起褐變的程度不同，提高愈傷組織和培養(yǎng)基接觸面的氧氣供給有利于抑制褐變，減少多酚分泌型外植體材料四周的多酚類物質(zhì)也有利于減少褐變。有利抑制褐變的培養(yǎng)方式，對不同植物是不同的。例如曼地亞紅豆杉以珍珠巖基質(zhì)上覆蓋濾紙條培養(yǎng)效果最好；而核桃采用液態(tài)培養(yǎng)基可減輕外植體的褐變。在蝴蝶蘭培養(yǎng)中 1015d轉瓶,更換新鮮培養(yǎng)基,褐變的比率可明顯降低。在桑樹培養(yǎng)中,當轉種周期為15d時褐變率為10%，轉種周期為30d褐變率為66%9。3防止褐變的措施 3.1選擇適宜的外植體和培養(yǎng)條件 成功的經(jīng)驗表明，選擇適當?shù)耐庵搀w并建立最佳的培養(yǎng)條件是克服材料褐變的最主要手段10。選擇適宜的外植體，材料的年齡、取材部位、材料的大小及外植體受傷害程度等均能對褐變產(chǎn)生影響。外植體材料應有較強的分生能力，在最適宜的細胞脫分化與再分化的條件下，使外植體處于旺盛的生長狀態(tài)，便可大大減輕褐變。一般情況下，取幼齡樹新萌發(fā)嫩枝條的帶芽莖段、嫩葉或莖尖作為外植體，也可采用幼胚來培養(yǎng)。另外對于某個種的植物進行培養(yǎng)前，在不影響培樣目的的情況下，應篩選褐變低的基因型個體。在培養(yǎng)條件的許多因子中，較為重要的是適宜的元機鹽成分、適宜的蔗糖濃度及激素水平。培養(yǎng)早期的培養(yǎng)基中應含較低濃度的元機鹽，降低Fe和Cu濃度或不用這兩種離子； 在保證正常培養(yǎng)的需求下使用低濃度細胞分裂素；愈傷組織或細胞培養(yǎng)物為異養(yǎng)型，應使培養(yǎng)物獲得充足的氧氣，以利于分化和生長。 適宜的溫度及在黑暗條件下進行培養(yǎng)也可減輕材料的褐變。易發(fā)生褐變的外植體，可先于低溫(420)預培養(yǎng)數(shù)小時，也可于黑暗或弱光照下預培養(yǎng)數(shù)日后再轉入正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。外植體受傷害程度直接影響褐變，切割時應盡可能減小傷口面積，并縮短切口在空氣中的暴露時間。隨著pH增高，多酚被氧化的作用增強，因此培養(yǎng)基pH值應控制在6.0以下。組織培養(yǎng)的一些材料產(chǎn)生水解型多酚，這類外植體在培養(yǎng)過程中會由于多酚類物質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中使培養(yǎng)基的顏色加深，并進一步氧化為醌類物質(zhì)，而多酚類物質(zhì)及相應的醌類物質(zhì)會抑制多種酶的活性，從而阻礙外植體對營養(yǎng)物質(zhì)的主動吸收和轉化。對于培養(yǎng)初期多酚類物質(zhì)合成分泌的材料可以在液體培養(yǎng)基中預培養(yǎng)一段時間，使酚類物質(zhì)充分分泌到培養(yǎng)基中，減少外植體內(nèi)和外植體周圍的多酚物質(zhì)。對于培養(yǎng)過程中多酚類物質(zhì)不斷合成的材料在培養(yǎng)中要進行轉移外植體到新鮮培養(yǎng)基中，一般轉移周期在2周左右。3.2使用抗氧化劑或增效劑 組織培養(yǎng)時，在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑、增效劑培養(yǎng)或預培養(yǎng)，使用抗氧化劑和增效劑對材料進行預處理，可抑制外植體的酶促褐變。目前在培養(yǎng)基中一般單獨或組合添加VC、VE、-胡蘿卜素、硫代硫酸鈉、巰基乙醇、酒石酸、檸檬酸、亞硫酸鹽、植酸、二硫蘇糖醇等。VC和檸檬酸主要在早期起作用，隨培養(yǎng)時間延長作用消退，亞硫酸鈉在中后期作用較好，但亞硫酸鹽對植物具有一定毒害作用，不宜單獨添加。也可在有抗氧化劑或增效劑的無菌溶液中切割材料后再接種，這類處理適用于外植體切割后快速氧化的材料?？寡趸镔|(zhì)對外植體的培養(yǎng)會起到一定的副作用，培養(yǎng)基添加濃度不宜過高，一般在200mg/L以下,且多用于初期培養(yǎng)而不宜長期培養(yǎng)。還原性抗氧化劑在使用時應注意保持其還原性，因此一般最好過濾除菌使用，而不與培養(yǎng)基一起高溫滅菌。3.3使用吸附劑在培養(yǎng)基中加入吸附劑可以抑制褐變。吸附劑有聚乙烯吡略烷酮(PVP)和活性炭(AC) 等，活性炭是吸附性較強的元機吸附劑，但在使用過程中，應盡量使用最小濃度來防止褐變，因為活性炭的吸附作用是無選擇性的，活性炭濃度一般在0.10.5%之間。PVP是酚類物質(zhì)的專一吸附劑，其對酚的結合強于酶蛋白的結合，因而可使酶從多酚 一酶復合物中結合出來，從而使酶的抑制消除。但隨著 PVP用量的增加，大部分組織培養(yǎng)物之增殖率也隨之下降，這可能是由于PVP在吸附培養(yǎng)基中引起褐變的物質(zhì)之外，還吸附了部分植物激素。PVP濃度一般在0.3%左右11。3.4其它3.4.1改變培養(yǎng)基的狀態(tài) 如采用濾紙橋培養(yǎng)可使外植體溢出的有毒物質(zhì)很快擴散到液體培養(yǎng)基中，對外植體危害較輕；或采用液體培養(yǎng)、半固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)與固體培養(yǎng)交替進行培養(yǎng)等也能減輕褐變的危害。3.4.2選擇適宜的接種方式 把培養(yǎng)體切面浸入培養(yǎng)基中，減少了褐化發(fā)生的表面積，且較大組織切塊的創(chuàng)傷面積相對較小，有利于保持轉培初期切塊淺表層細胞或組織處于原來的生長發(fā)育狀態(tài)，從而減輕了因切面褐變帶來的毒害作用。3.4.3通過試驗選擇適宜的消毒方式可減少對外植體的傷害程度，從而減輕褐化程度。3.4.4添加天然附合物有試驗表明，添加10%椰子水可提高洋蘭原球莖的存活率，減少褐變死亡現(xiàn)象12。4抗褐變研究展望 目前對于多酚類物質(zhì)系統(tǒng)的研究及應用主要集中在植物化學，食品、制革、精細化工領域，集中于對多酚的生產(chǎn)應用，而在活細胞中的生化動態(tài)代謝機理及其對細胞的作用研究很少。目前國內(nèi)植物組織培養(yǎng)關于褐變的研究文獻中，多數(shù)是針對具體材料進行試驗性處理，處理的抗褐變物質(zhì)種類多樣，且各種試劑配比、濃度、及具體作用差別較大。部分研究開始對總酚含量、多酚氧化酶活性、過氧化物酶活性、可溶糖含量、可溶蛋白含量進行測定。測定褐變組織中具體多酚類物質(zhì)種類及其相關基因研究的報道極少。由于植物種甚至品種，由于基因型不同所產(chǎn)生的酚類物質(zhì)種類和量都有不同，而不同的酚類物質(zhì)對細胞的毒害作用機理不一樣且比較復雜，從而造成在培養(yǎng)過程中解決辦法的多樣化。因此，可著手于測定分析引起褐變的多酚類物質(zhì)的種類，分析其危害細胞的生化原理，從根本上找出合理的解決方法，以形成完整體系。參考文獻1 石碧,狄瑩.植物多酚M.北京:科學出版社2000.2 顧小平,蘇夢云等.幾種從生竹愈傷組織誘導與防褐變技術研究J.林業(yè)科學研究.2005,19 (1).3 張妙霞.柿樹組織培養(yǎng)防止外植體褐變的研究J.河南農(nóng)業(yè)大學學報,1999,33(1).4 Bonga J M,Durzan D J著.樹木組織培養(yǎng).闕國寧等譯M.北京:中國林業(yè)出版社1988.5 張小紅,代侃韌等.核桃離體培養(yǎng)中外植體褐變的研究J .陜西林業(yè)科技 ,2005,4.6 孫敬三,桂耀林.植物細胞工程技術M.北京:科學出版社1995.7 趙伶俐,范崇輝