薄層層析操作要點(diǎn).doc

薄層層析操作要點(diǎn)鋪板鋪板用的勻漿不宜過稠或過稀：過稠，板容易出現(xiàn)拖動(dòng)或停頓造成的層紋；過稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G:水=1：23，硅膠G:羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。研磨勻漿的時(shí)間，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來定，與空氣濕度有關(guān)，一般通過拿起研棒時(shí)勻漿下滴的情況來判斷，越稠越難下滴。勻漿的稀稠除影響板的平滑外，也影響板涂層的厚度，進(jìn)一步影響上樣量。涂層薄，點(diǎn)樣易過載；涂層厚，顯色不那么明顯。通常，板的質(zhì)量對(duì)薄層鑒別的影響不是很大，影響最大的是展開劑的配制和展開系統(tǒng)的飽和。鋪層時(shí)防止起泡,可加幾滴乙醇.嘗試刮邊點(diǎn)樣盡量用小的點(diǎn)樣管。如果有足夠的耐性，最好只用1微升的點(diǎn)樣管。這樣，點(diǎn)的斑點(diǎn)較小，展開的色譜圖分離度好，顏色分明。樣品溶液的含水量越小越好，樣品溶液含水量大，點(diǎn)樣斑點(diǎn)擴(kuò)散大。樣品溶液的溶劑一般是無水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。點(diǎn)好樣的薄層板用電吹風(fēng)的熱風(fēng)吹干或放入干燥器里晾干。點(diǎn)樣是造成TLC定量誤差的主要來源。實(shí)驗(yàn)證明：定量毛細(xì)管更適合較小體積的點(diǎn)樣；微量注射器更適合較大體積的點(diǎn)樣。這主要是因?yàn)槲⒘孔⑸淦魇苄馀荨⑷芤夯嘏垃F(xiàn)象的影響較大。為避免不同定量毛細(xì)管間的點(diǎn)樣誤差、建議一塊薄層板上最好用同一只定量毛細(xì)管。但應(yīng)注意更換樣品時(shí)，應(yīng)將毛細(xì)管用超聲波或不同極性溶劑清洗干凈。在制備樣品時(shí)，溶樣溶劑黏度不能過高，以便于點(diǎn)樣；溶劑沸點(diǎn)過低則進(jìn)樣體積易變，過高則會(huì)改變展開劑組成；對(duì)樣品溶解度過高會(huì)使樣點(diǎn)發(fā)生空心現(xiàn)象；常用的溶劑為甲醇、乙醇、丙酮。經(jīng)典TLC樣點(diǎn)原點(diǎn)一般為直徑3mm點(diǎn)間距1-2cm 底邊距1.5cm；HPLC樣點(diǎn)原點(diǎn)一般為直徑1mm點(diǎn)間距5mm 底邊距1cm。展開劑配制選擇合適的量器把各組成溶劑移入分液漏斗，強(qiáng)烈振搖使混合液充分混勻，放置，如果分層，取用體積大的一層作為展開劑。絕對(duì)不應(yīng)該把各組成溶液倒入展開缸，振搖展開缸來配制展開劑?；旌喜痪鶆蚝蜎]有分液的展開劑，會(huì)造成層析的完全失敗。各組成溶劑的比例準(zhǔn)確度對(duì)不同的分析任務(wù)有不同的要求，盡量達(dá)到實(shí)驗(yàn)室儀器的最高精確度，比如：取1ml的溶劑，應(yīng)使用1ml的單標(biāo)移液管，移液管應(yīng)符合計(jì)量認(rèn)證要求，盡管多數(shù)時(shí)候這不是必須的。展開系統(tǒng)的飽和一般使用的是雙槽的展開缸，一槽用來放展開劑，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展開的板放入兩槽間的平臺(tái)，斜架著，蓋上展開缸的蓋子。讓展開劑的蒸氣充滿展開缸，并使薄層板吸附蒸氣達(dá)到飽和，防止邊沿效應(yīng)，飽和時(shí)間在半個(gè)小時(shí)左右。展開時(shí)難免要打開蓋子把薄層板放入展開劑中，不過對(duì)薄層板與蒸氣的吸附平衡影響不大，當(dāng)然動(dòng)作應(yīng)該盡量輕、快。 溫濕度的控制溫濕度對(duì)薄層影響都很大。不凍結(jié)的前提下，通常溫度越低分離越好，較難的分離需在低溫下分離，例如人參皂苷。濕度的影響，估計(jì)主要是影響薄層板的吸附能力，導(dǎo)致選擇性（容量因子）的變化，濕度應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況確定。溫度控制使用空調(diào)器或冰柜，濕度控制是通過在另一展開槽放置相應(yīng)濃度的硫酸。展開劑的選擇TLC與HPLC相比，一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)就是流動(dòng)相的選擇具有更大的靈活性。流動(dòng)相的選擇的目的是使絕大部分樣品的RF值位于0.1-0.7之間并達(dá)到較好的分離，與此對(duì)應(yīng)的是流動(dòng)相要有適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度和組成。流動(dòng)相強(qiáng)度越大，溶質(zhì)RF值越大，但很可能降低分離能力；另外單一溶劑很難分離較復(fù)雜的混合物，根據(jù)相似相溶原理，要使用多元溶劑體系。一般展開劑體系選擇如下：根據(jù)分離樣品性質(zhì)、薄層色譜板性質(zhì)選擇一個(gè)二元溶劑體系，通過調(diào)節(jié)溶劑比例以尋求適合RF值，適合的RF值找到后，再尋求極性參數(shù)相同的二元溶劑體系兩個(gè)，以這三個(gè)組成為三點(diǎn)組成一個(gè)三角形，則可看到：三角形頂點(diǎn)是二元體系，邊是三元體系，三角形內(nèi)是四元體系，并且極性一致，可根據(jù)幾何原理得出任一點(diǎn)組成。這種方法較為直觀，也較簡單。顯色噴顯色劑顯色最重要是有好的霧化器。TLC的通用顯色方法理想的顯色希望靈敏度高、斑點(diǎn)顏色穩(wěn)定、斑點(diǎn)與背景間的對(duì)比度好、斑點(diǎn)的大小及顏色的深度與物質(zhì)的量成正比。在樣品組成并不完全已知的情況下，通用顯色方法顯得成尤為重要。通用顯色法主要有： （1）紫外照射法：方便，不破壞樣品； （2）碘蒸氣法：通用性強(qiáng)，與紫外法結(jié)合靈敏度高于該兩法單獨(dú)使用； （3）熒光試劑：制造熒光背景，使原來紫外下無熒光物質(zhì)被鑒別，有熒光物質(zhì)更明顯； （4）硫酸溶液：對(duì)絕大多數(shù)有機(jī)物有效，但有破壞性。薄層層析(thin layer chromatography)，也叫薄層色譜、薄板色譜或薄板層析，屬層析技術(shù)中的一類，常用TLC代表。如同柱層析一樣，按其作用機(jī)理可分為吸附薄層層析，分配薄層層析等。其中應(yīng)用最廣泛的是吸附薄層層析。其原理見第97100頁和第102104頁。薄層層析具有微量、快速、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，但不適合于較大量的樣品的分離，通?？煞蛛x的量在0.5g以下，最低可達(dá)10 g。以下介紹吸附薄層層析的相關(guān)問題，其他類型薄層層析可參照處理。 1.薄層層析的用途在實(shí)驗(yàn)室中，薄層層析主要用于以下幾種目的。 (1)作為柱層析的先導(dǎo)。一般說來，使用某種固定相和流動(dòng)相可以在柱中分離開的混合物，使用同種固定相和流動(dòng)相也可以在薄層板上分離開。所以常利用薄層層析為柱層析選擇吸附劑和淋洗劑。 (2)監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)程。在反應(yīng)過程中定時(shí)取樣，將原料和反應(yīng)混合物分別點(diǎn)在同一塊薄層板上，展開后觀察樣點(diǎn)的相對(duì)濃度變化。若只有原料點(diǎn)，則說明反應(yīng)沒有進(jìn)行；若原料點(diǎn)很快變淡，產(chǎn)物點(diǎn)很快變濃，則說明反應(yīng)在迅速進(jìn)行；若原料點(diǎn)基本消失，產(chǎn)物點(diǎn)變得很濃，則說明反應(yīng)基本完成。 (3)檢測其他分離純化過程。在柱層析、結(jié)晶、萃取等分離純化過程中，將分離出來的組分或純化所得的產(chǎn)物溶樣點(diǎn)板，展開后如果只有一個(gè)點(diǎn)，則說明已經(jīng)完全分離開了或已經(jīng)純化好了；若展開后仍有兩個(gè)或多個(gè)斑點(diǎn)，則說明分離純化尚未達(dá)到預(yù)期的效果。 (4)確定混合物中的組分?jǐn)?shù)目。一般說來，混合物溶液點(diǎn)樣展開后出現(xiàn)幾個(gè)斑點(diǎn)，就說明混合物中有幾個(gè)組分。 (5)確定兩個(gè)或多個(gè)樣品是否為同一物質(zhì)。將各樣品點(diǎn)在同一塊薄層板上，展開后若各樣點(diǎn)爬升的高度相同，則大體上可以認(rèn)定為同一物質(zhì)，若上升高度不同，則肯定不是同一物質(zhì)。 (6)根據(jù)薄層板上各組分斑點(diǎn)的相對(duì)濃度可粗略地判斷各組分的相對(duì)含量。 (7)迅速分離出少量純凈樣品。為了盡快從反應(yīng)混合物中分離出少量純凈樣品作分析測試，可擴(kuò)大薄層板的面積，加大薄層的厚度，并將混合物樣液點(diǎn)成一條線，一次可分離出數(shù)十毫克到五百毫克的樣品。 2.薄層層析的儀器和藥品 (1)薄板薄層層析所用的基板通常為玻璃板，也有用塑料板的，根據(jù)用途的不同而有不同的規(guī)格。作分析鑒定用的多為7.5cm2.5cm的載玻片。若為分離少量純樣品，可將普通玻璃板裁成20cm15cm的大小，將棱角用砂紙稍加打磨，以免割破手指，然后洗凈干燥即可使用。近年來，有些廠商將吸附劑涂在大張金屬箔片上出售。購回后只需用剪刀剪成合適大小即可點(diǎn)樣展開。用完后可以適當(dāng)溶劑將箔片上樣點(diǎn)浸萃掉，經(jīng)干燥后即可重復(fù)使用，但吸附劑涂層很薄，一般只可作分析鑒定用。 (2)展開槽展開槽也叫層析缸，規(guī)格形式不一。圖3-39繪出了其中的幾種，圖中的a為立式，b為臥式，c和d為斜靠式，e為下行式，f為制備純樣品所用的大型展開槽，亦為斜靠式。a,b,c,d,f統(tǒng)稱上行式。 下載 (5.57 KB)2009-6-7 21:08 圖3-39薄層板在不同的層析缸中展開(3)吸附劑薄層層析中所用吸附劑最常見的有硅膠和氧化鋁兩類。其中不加任何添加劑的以H表示，如硅膠H，氧化鋁H；加有煅石膏(CaSO1/2 HO)為粘合劑的用G表示(gypsum )，如硅膠G，氧化鋁G；加有熒光素的用F表示(fluorescein)，如硅膠HF ，意思是其中所加熒光素可在波長254 nm的紫外光下激發(fā)熒光；同時(shí)加有煅石膏和熒光素的用GF表示，如硅膠GF ，氧化鋁GF 。如在制板時(shí)以羧甲基纖維素鈉的溶液調(diào)和，則用CMC表示(carboxymethyl cellulose)，如硅膠CMC。添加粘合劑是為了加強(qiáng)薄層板的機(jī)械強(qiáng)度，其中以添加CMC者機(jī)械強(qiáng)度最高；添加熒光素是為了顯色的方便。習(xí)慣上把加有粘合劑的薄層板稱為硬板，不加粘合劑的薄層板稱為軟板。 供薄層層析用的吸附劑粒度較小，通常為200目，標(biāo)簽上有專門說明，如Silica gel H for thin layer chromatography,使用時(shí)應(yīng)予注意，不可用柱層析吸附劑代替，也不可混用。 薄層層析用的氧化鋁也有酸性、中性、堿性之分，也分五個(gè)活性等級(jí)。選擇原則與柱層析類同。 (4)展開劑在薄層層析中用作流動(dòng)相的溶劑稱為展開劑，它相當(dāng)于柱層析中的淋洗劑，其選擇原則也與淋洗劑類同，也是由被分離物質(zhì)的極性決定的，被分離物極性小，選用極性較小的展開劑；被分離物極性大，選用極性較大的展開劑。環(huán)己烷和石油醚是最常使用的非極性展開劑，適合于非極性或弱極性試樣；乙酸乙酯、丙酮或甲醇適合于分離極性較強(qiáng)的試樣，氯仿和苯是中等極性的展開劑，可用作多官能團(tuán)化合物的分離和鑒定。若單一展開劑不能很好分離，也可采用不同比例的混合溶劑展開。 選擇展開劑的一條快捷的途徑是在同一塊薄層板上點(diǎn)上被分離樣品的幾個(gè)樣點(diǎn)，各樣點(diǎn)間至少相距1cm，再用滴管分別汲取不同的溶劑，各自點(diǎn)在一個(gè)樣點(diǎn)上，溶劑將從樣點(diǎn)向外擴(kuò)展，形成一些同心的圓環(huán)。若樣點(diǎn)基本上不隨溶劑移動(dòng)(見圖3-40a)，或一直隨溶劑移動(dòng)到前沿(見圖3-40d)，則這樣的溶劑不適用。若樣點(diǎn)隨溶劑移動(dòng)適當(dāng)距離，形成較寬的環(huán)帶(見圖3-40b)，或形成幾個(gè)不同的環(huán)帶(見圖3-40c)，則該溶劑一般可作為展開劑使用。 下載 (2.85 KB)2009-6-7 21:10下載 (3.1 KB)2009-6-7 21:10 圖3-40選擇展開劑 圖3-41載玻片浸漬涂層 3.薄層層析的操作 (1)制板制板也稱鋪板或鋪層，有“干法”和“濕法”兩種，由于干燥的吸附劑在玻璃板上附著力差，容易脫落，不便操作，所以很少采用，此處只介紹濕法鋪板。 a.供分析、鑒定、監(jiān)控用的載玻片的鋪制。首先將吸附劑用溶劑調(diào)成糊狀，所用溶劑可以是低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑，也可以是蒸餾水。有機(jī)溶劑中應(yīng)用較廣的是氯仿，一般按照每克硅膠3mL氯仿的比例在廣口瓶中調(diào)成糊狀，立即以帶螺旋的蓋子蓋緊備用。在鋪板時(shí)用力搖勻，旋開蓋子，將兩塊載玻片疊在一起，以食指和拇指捏住它們的側(cè)面靠近一端處，緩慢平穩(wěn)地浸入瓶中的糊狀吸附劑里，使糊狀物浸沒至離載玻片頂端約1cm處，然后緩緩提起(見圖3-41)，在空氣中握持片刻，使氯仿大部分揮發(fā)掉。將兩塊載玻片拆開，浸涂面向上，平放在桌上，干燥后即可使用。每次浸涂后應(yīng)立即將廣口瓶蓋緊密封，以免溶劑揮發(fā)。這樣制得的薄層板機(jī)械性能稍差。為了提高薄層強(qiáng)度，可用甲醇代替氯仿，或?qū)⒓状寂c氯仿按不同的比例混合使用。 以蒸餾水作溶劑時(shí)，首先將待鋪的載玻片平放在水平臺(tái)面上，將吸附劑置于干凈研缽內(nèi)，按照每克硅膠G23mL蒸餾水(或34mL羧甲基纖維素鈉溶液)，或每克氧化鋁12mL蒸餾水的比例加入溶劑，立即研磨成糊狀。用牛角匙舀取糊狀物倒在載玻片上迅速攤布均勻，也可輕敲載玻片邊緣，或?qū)⑤d玻片托在手中前后左右稍稍傾斜，靠糊狀物的流動(dòng)性使之分布均勻。然后再平放在臺(tái)面上，使其固化定型并晾干。固化的過程是吸附劑內(nèi)的煅石膏吸收水形成新固體的過程，反應(yīng)式為： CaSO41/2H2O + 3/2H2O CaSO42H2O 所以研磨糊狀物和涂鋪薄層板都需盡可能的迅速。若動(dòng)作稍慢，糊狀物即會(huì)結(jié)成團(tuán)塊狀無法涂鋪或不能涂鋪均勻，即使再加水也不能再調(diào)成均勻的糊狀。通常研磨糊狀物需在1min左右完成，鋪完全部載玻片也只需數(shù)分鐘，最多在十?dāng)?shù)分鐘內(nèi)完成。每次鋪板都需臨時(shí)研磨糊狀物。以蒸餾水作溶劑制得的薄層板具有較好的機(jī)械性能，如欲獲得機(jī)械性能更好的薄層板，可用1%的羧甲基纖維素鈉水溶液來調(diào)制糊狀物。將1g羧甲基纖維素鈉加在100mL蒸餾水中，煮沸使充分溶解，然后用砂芯漏斗過濾。用所得濾液如前述方法調(diào)糊鋪板，這樣的薄層板具有足夠的機(jī)械性能，可以用鉛筆在上面寫字或作其他記號(hào)，但需注意在活化時(shí)嚴(yán)格控制烘焙溫度，以免溫度過高引起纖維素碳化而使薄層變黑。 圖3-42 薄層涂布器 1鋪好的薄層板；2涂布器；3，5厚玻板；4玻璃板 b.涂布器制板法。圖3-42為薄層涂布器。將幾塊玻璃板放在涂布器中間擺好，兩邊是兩塊比前者約厚0.5mm的玻璃板，向涂布器槽中倒入預(yù)先調(diào)好的糊狀吸附劑，將涂布器自左向右推去即能將糊狀物均勻地涂在玻璃板上。待晾干定型之后，將幾塊玻璃板分開，刮去邊上多余的吸附劑即得到一定厚度的薄層層析板。 c.較大薄層板的鋪制。供分離純化用的薄層板具有較大的尺寸，通常都是用蒸餾水來調(diào)制糊狀物的，方法同前。鋪板的方法如下： 傾注法將玻璃板平放在臺(tái)面上，把研好的糊狀物迅速傾倒在玻璃板上，用干凈玻璃棒攤平，或手托玻璃板微微傾斜，并輕輕敲擊玻璃板背面，使之流動(dòng)，即可獲得平整均勻的薄層。 刮平法將待鋪玻璃板平放臺(tái)面上，在其長條方向的兩邊各放一條比玻璃板厚1mm的玻璃板條。將調(diào)好的糊狀物倒在中間的玻板上，用一根有機(jī)玻璃尺將糊狀物沿一個(gè)方向刮平，即形成厚1mm的均勻薄層。待固化定型后抽去兩邊的玻璃板條即可。 大薄層板的活化及存放方法與載玻片相同。 不管以何種方法鋪板，都要求鋪得的薄層厚薄均一，沒有紋路，沒有團(tuán)塊凸起。紋路或團(tuán)塊的產(chǎn)生原因是糊狀物調(diào)得不均勻，或鋪制太慢，或在局部固化的板子上又加入新的糊狀物，所以為獲得均勻的薄層，應(yīng)動(dòng)作迅速，一次研勻，一次傾倒，一次鋪成。 (2)活化 將晾干后的薄板移入烘箱內(nèi)“活化”?；罨臏囟纫蛭絼┎煌煌９枘z薄板在105110烘焙0.51h即可；氧化鋁薄板在200220烘焙4h，其活性約為級(jí)，若在150160烘焙4h，活性相當(dāng)于級(jí)?；罨蟮谋影寰驮诤嫦鋬?nèi)自然冷卻至接近室溫，取出后立即放入干燥器內(nèi)備用。(3)點(diǎn)樣固體樣品通常溶解在合適的溶劑中配成1%5%的溶液，用內(nèi)徑小于1mm的平口毛細(xì)管吸取樣品溶液點(diǎn)樣。點(diǎn)樣前可用鉛筆在距薄層板一端約1cm處輕輕地畫一條水平橫線作為“起始線”。然后將樣品溶液小心地點(diǎn)在“起始線”上。樣品斑點(diǎn)的直徑一般不應(yīng)超過2mm。如果樣品溶液太稀需要重復(fù)點(diǎn)樣時(shí)，須待前一次點(diǎn)樣的溶劑揮發(fā)之后再點(diǎn)樣。點(diǎn)樣時(shí)毛細(xì)管的下端應(yīng)輕輕接觸吸附劑層。如果用力過猛，會(huì)將吸附劑層戳成一個(gè)孔，影響吸附劑層的毛細(xì)作用，從而影響樣品的值。若在同一塊板上點(diǎn)兩個(gè)以上樣點(diǎn)時(shí)，樣點(diǎn)之間的距離不應(yīng)小于1cm。點(diǎn)樣后待樣點(diǎn)上溶劑揮發(fā)干凈才能放入展開槽中展開。 (4)展開 展開劑帶動(dòng)樣點(diǎn)在薄層板上移動(dòng)的過程叫展開。展開過程是在充滿展開劑蒸氣的密閉的展開槽中進(jìn)行的。展開的方式有直立式、臥式、斜靠式、下行式、雙向式等。 直立式展開是在立式展開槽中進(jìn)行的，如圖3-39a。先在展開槽中裝入深約0.5cm的展開劑，蓋上蓋子放置片刻，使蒸氣充滿展開槽，然后將點(diǎn)好樣的薄層板小心地放入其中，使點(diǎn)樣端向下(注意展開劑不可浸及樣點(diǎn))，蓋好蓋子。由于吸附劑的毛細(xì)作用，展開劑緩緩向上爬升。如果展開劑選得合適，樣點(diǎn)也隨之展開。當(dāng)展開劑前沿升至距薄層板上端約1cm處時(shí)取出薄層板并立即標(biāo)記出前沿位置。分別測量各樣點(diǎn)中心及前沿到起始線的距離，計(jì)算各組分的比移值。如果樣品中各組分的比移值都較小，則應(yīng)該換用極性大一些的展開劑；反之，如果各組分的比移值都較大，則應(yīng)換用極性小一些的展開劑。每次更換溶劑，必須等展開槽中前一次的溶劑揮發(fā)干凈后，再加入新的溶劑。更換溶劑后，必須更換薄層板并重新點(diǎn)樣、展開，重復(fù)整個(gè)操作過程。直立式展開只適合于硬板。 臥式展開如圖3-39b所示，薄層板傾斜15放置，點(diǎn)樣端向下，涂層向上，操作方法同直立式，只是展開槽中所放的展開劑應(yīng)更淺一些。臥式展開既適用于硬板，也適用于軟板。 斜靠式展開如圖3-39c，d，f所示，薄層板的傾斜角度在3090 之間，一般也只適合于硬板。 下行式展開如圖3-39e所示。 薄層板豎直懸掛在展開槽中，一根濾紙條或紗布條搭在展開劑和層析板上沿，靠毛細(xì)作用引導(dǎo)展開劑自板的上端向下展開。 此法適合于比移值較小的化合物。 雙向式展開是采用方形玻璃板鋪制薄層，樣品點(diǎn)在角上，先向一個(gè)方向展開，然后轉(zhuǎn)動(dòng)90再換一種展開劑向另一方向展開。此法適合于成分復(fù)雜或較難分離的混合物樣品。 用于分離的大塊薄層板，是在起點(diǎn)線上將樣液點(diǎn)成一條線，使用足夠大的展開槽展開，如圖3-39f所示，展開后成為帶狀，用不銹鋼鏟將