【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）青海血蜱cDNA表達文庫的構(gòu)建和“隱藏抗原”基因的篩選、克隆與表達預(yù)防獸醫(yī)學(xué)碩士論文

密級 : 論文編號 : 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 青海血蜱 達文庫的構(gòu)建和“隱藏抗原”基因的篩選、克隆與表達 of s of 海血蜱 達文庫的構(gòu)建和“隱藏抗原”基因 的篩選、克隆與表達 摘 要 青海血蜱 （ 及其傳播的血液原蟲病嚴(yán)重威脅著我國畜牧業(yè)的發(fā)展。目前對蜱的防治主要以藥物防治為主。但隨著蜱耐藥性的產(chǎn)生以及環(huán)境污染和藥物殘留等嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題的出現(xiàn)迫使人們尋求防治的新途徑。在眾多控制蜱的方法中，免疫學(xué)防制是前景最誘人的方法。本研究采用兩種不同的免疫途徑制備了羊抗青海血蜱唾液腺蛋白陽性血清和羊抗青海血蜱唾液蛋白陽性血清。應(yīng)用 法，將上述兩種血清分別與青海血蜱唾液腺蛋白提取物雜交以進行蛋白的差異 顯示。結(jié)果表明 羊抗青海血蜱唾液腺蛋白陽性血清能識別青海血蜱唾液腺更多的蛋白帶。這些差異蛋白的分子量分 別為 4931 通過制備性電泳，將所發(fā)現(xiàn)的差異條帶切取回收并免疫家兔，獲得兔抗青海血蜱差異蛋白陽性血清。以 半飽血青海血蜱的唾液腺、馬氏管和卵巢等器官為材料，構(gòu)建青海血蜱的 達文庫 ,庫容量約為 2 106 利用兔抗青海血蜱差異蛋白陽性血清對青海血蜱 達文庫進行免疫學(xué)篩選 ,共獲得 5 個陽性克隆 。經(jīng)鑒定這 5 個基因均為青海血蜱所固有的新發(fā)現(xiàn)基因，它們的大小 依次為 1085726617847 1178在大腸桿菌中分別對 因進行了表達，利用表達產(chǎn)物免疫 羊所得陽性血清能與青海血蜱天然蛋白發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)。說明表達產(chǎn)物具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。這為研制青海血蜱的分子疫苗奠定了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞 ：青海血蜱 ,兔抗青海血蜱差異蛋白陽性血清 ,達文庫 ,免疫學(xué)篩選 ,誘導(dǎo)表達 he of to is of a of as of as as of by In by By to by of of 931by A a 06 as . of 085726617847bp 178bp to to be by of be a of V 目 錄 第一章 緒論 1 究目的和意義 1 內(nèi)外研究現(xiàn)狀 2 能性抗原的選擇 2 商業(yè)化的抗蜱疫苗 6 蜱免疫的評價標(biāo)準(zhǔn) 7 究內(nèi)容和方法 7 第二章 青海血蜱唾液腺及其分泌物中蛋白組分的差異顯示及兔抗青海血蜱差異蛋白陽性血清的制備 9 10 料 10 驗方法 11 驗結(jié)果 20 20 20 20 21 第三章 青海血蜱 達文庫的構(gòu)建 23 料與方法 24 料 24 驗方法 25 果 33 33 鏈 測結(jié)果 34 片段 選擇 34 庫基礎(chǔ)庫容量 34 增文庫庫容量 35 論 35 第四章 青海血蜱 達文庫的免疫學(xué)篩選和陽性克隆的克隆與鑒定 39 方法 40 料 40 法 40 果 47 陽性克隆的篩選結(jié)果 47 性克隆的鑒定 48 用 48 論 49 第五章 陽性克隆的誘導(dǎo)表達及其免疫原功能的初步分析 52 料與方法 53 料 53 法 53 果 56 組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達的結(jié)果 56 組蛋白的免疫活性分析 56 論 56 第六章 結(jié)論 59 參考文獻 60 附錄 66 致謝 76 作者簡歷 77 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 究目的和意義 蜱 (于節(jié)肢動物門（ 蛛形綱（ 蜱螨目 (蜱亞目（ 蜱總科（ 該總科又分為三個科，即硬蜱科（ 軟蜱科 (納蜱科 ( 孔 繁瑤， 1981；汪明， 2003）。目前世界已知蜱總科的種類約 800 余種，其中硬蜱科 (最大多數(shù)，包括 3 個亞科共 13 屬約 650 種，其次為軟蜱科，包括 4 屬共約 100 種，納蜱科種類最少，截止目前，只記錄了一屬一種（ 鄧國藩， 1978）。在我國，已記錄的蜱有 101 個種和亞種，分別隸屬于 9 個屬，其中以血蜱屬的種類最多，共 43 種，約占總數(shù)的 2 5，硬蜱屬 20 種，約占總數(shù)的 1 5，牛蜱屬種類最少，只有一種（ 鄧國藩等， 1991）。蜱是家畜體表的一種吸血外寄生蟲，少數(shù)寄生于鳥類、爬蟲類，個別寄生于兩棲類。其生 活史為不完全變態(tài)，可分為卵、幼蟲、若蟲和成蟲四個時期（ 孔繁瑤， 1981）。蜱是許多脊椎動物的吸血寄生蟲，它能引起被感染動物貧血、食欲減退、體重下降、血液成分變化等。如日本和澳大利亞學(xué)者(et 1993)的研究表明微小牛蜱（ 使被感染牛的外周血淋巴細(xì)胞中的 T 淋巴細(xì)胞減少，而重度感染的牛的 B 淋巴細(xì)胞也會減少，也能抑制牛的免疫應(yīng)答。正是由于這種免疫抑制才使得蜱的存活及蜱傳病的發(fā)生成為可能。蜱及其傳播的血液原蟲病是人和家畜疾病的重要來源，同時它還傳播多種 病毒、立克次氏體、原蟲、蠕蟲、螺旋體及細(xì)菌類疾病。其中大多數(shù)是重要的自然疫源性疾病和人畜共患病，嚴(yán)重危害人畜健康，制約著畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展。青海血蜱（ 1978 年由鄧國藩命名的一個新種，分布于青海、甘肅、寧夏、四川、云南等海拔高度在 1， 600 4， 200 米的區(qū)域，國外未有記錄。該蜱主要寄生于綿羊、山羊。成蜱和若蜱 4 7 月份活動， 5 月份最多，隨后逐漸消失， 9 月份又出現(xiàn)， 11 月份消失。該蜱生活于山區(qū)草地或灌木叢，屬三宿主蜱，在自然界（高寒地區(qū)） 3 年完成 1 個世代 ，在實驗室內(nèi) 1 年能完成一個世代（袁改玲等， 2002）。已證實青海血蜱是羊泰勒蟲（ 和中華泰勒蟲 (及羊的巴貝斯蟲（ 的傳播媒介 (et 2002；et 2002a, 2002b, 2004)，同時也能傳播一種感染牦牛的泰勒蟲（ （ et 2002c）。 傳統(tǒng)防治蜱的方法是化學(xué)防治，由于化學(xué)藥物需恰當(dāng)使用加之成本昂貴使得該法耗資巨大，許多小農(nóng)場主也因不能 接受防治成本是該病長期反復(fù)感染的原因之一。然而，更主要的問題是蜱不斷出現(xiàn)抗藥性及藥物造成的環(huán)境污染。例如，在澳大利亞，微小牛蜱已對砷、有機磷農(nóng)藥、氨基甲酸等多種藥物產(chǎn)生抗藥性（ et 1994）。從社會和科學(xué)關(guān)注的角度看，完全依賴化學(xué)藥物預(yù)防不是長久之計，需研制一種能替代化學(xué)防治的方法，這樣才能符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求。而且隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，使對蜱實施可持續(xù)控制（綠色控制）成為可能。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 蜱宿主病原間存在著復(fù)雜的免疫反應(yīng)（ 薄新文等， 1998；袁改玲， 2002）。其 一，蜱及其傳播的病原體對抗宿主的免疫應(yīng)答。蜱通常通過繞行、偏離或者抑制等手段來對抗宿主的免疫防御系統(tǒng)。蜱傳播的病原體為了生存、擴散和防御宿主對其的消除作用直接導(dǎo)致了病原體對宿主先天或后天特異性獲得性免疫的多種防御機制的產(chǎn)生。其中免疫逃避機制包括：抗原變異、抑制某些分子對微生物的殺傷作用、對主要組織相容性復(fù)合物分子的負(fù)調(diào)節(jié)和破壞抗原提呈、調(diào)節(jié)補體系統(tǒng)、偏離 T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)、改變由細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用和產(chǎn)生偽裝趨化因子及細(xì)胞因子等。而且，通常一種病原體常能形成多重免疫逃避機制（ et 2001）。其二，宿主對蜱感染的免疫，包括非特異免疫和特異免疫，兩者經(jīng)常協(xié)同作用。非特異性免疫又稱天然免疫，是動物在長期演化過程中所形成遺傳特征，它在一定程度上反映了動物被感染后迅速提高免疫反應(yīng)水平的能力，品種不同，甚至個體不同，其在天然條件下對感染的反應(yīng)能力也不同。例如，2002）通過對非洲的大量羚羊進行調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，雖然在野外受到很多蜱的侵襲，但在羊體上蜱的數(shù)量極少，這可能是羚羊經(jīng)常受到蜱的侵襲，在進化過程中逐漸形成了對蜱的非特異性抵抗力。另外，趙忠芳等（ 1998）對不同體況動物自身抗蜱能力 作了研究，發(fā)現(xiàn)以卡介苗作為免疫增強劑能提高兔對蜱的抵抗力，提出在蜱活動季節(jié)滅蜱時，應(yīng)該考慮動物身體狀況，加強動物營養(yǎng)，對種用動物以免疫增強劑進行接種，以減少疾病的發(fā)生。特異性免疫又稱獲得性免疫，為后天所獲得。這種免疫是由于作為抗原的寄生蟲激發(fā)宿主機體所產(chǎn)生的一系列識別與排斥的復(fù)雜的生物學(xué)反應(yīng)。特異性免疫清除相應(yīng)抗原的能力，顯著強于非特異性免疫力，是進行人工免疫的基礎(chǔ)。這種后天獲得的特異性免疫不能遺傳（童競亞， 1996）。蜱吸血能誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答，當(dāng)宿主獲得抗蜱免疫后可導(dǎo)致蜱吸血量減少，飽血程度下降，吸血 時間延長，產(chǎn)卵量下降，以及蜱和卵的死亡率升高等。蜱叮咬的部位常會有顯著的病理變化，當(dāng)宿主再次被蜱叮咬時，就會發(fā)生獲得性免疫應(yīng)答。宿主經(jīng)蜱誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)可使皮膚產(chǎn)生癢覺，刺激宿主的清除反應(yīng)，使宿主減少荷蜱量。由此可見，宿主對蜱的抵抗力可以有效地控制蜱的感染。如果通過疫苗免疫使宿主從易感變成有抵抗力必然有助于對蜱種群的控制。此種良好前景使得人們開始致力于對宿主免疫機理和疫苗的研究?？跪缫呙缈捎嗅槍π缘南麥缣禺愋则绶N，有利于環(huán)境保護和人類健康，易于管理且成本低廉。本研究的對象是巴貝斯蟲病和泰勒蟲病的傳播媒介 青海血蜱，其研究結(jié)果對于蜱及蜱傳病的防治都具有重要意義。 內(nèi)外研究現(xiàn)狀 疫苗免疫是畜禽病蟲害可持續(xù)控制技術(shù)中最為有效的方法之一，家畜外寄生蟲病的防治也是如此。 能性抗原的選擇 藏抗原”概述 疫苗的開發(fā)首先在于功能性抗原的選擇，盡管人們多次證實用半飽血微小牛蜱雌蜱的提取物免疫牛能增強?？乖擈绲哪芰?(et 1986; et 1996; et 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 1988a;1988b)，但這與疫苗的實際發(fā)展相距甚遠(yuǎn)，因 為研制理想疫苗的前提是保護性抗原的尋找和詳細(xì)分析。常規(guī)的抗原是正常的寄生蟲與宿主作用過程中與宿主相接觸的寄生蟲分子，由于寄生蟲與宿主間的選擇相容性在進化過程中得以發(fā)展，使這些抗原所誘導(dǎo)的保護性免疫在寄生蟲控制中的效力不足。上述缺陷使得人們開始尋求內(nèi)在的生理目標(biāo) 新的抗原或“隱藏抗原”。這些抗原通常情況下可能不與宿主接觸，很可能有較好的免疫原性，能誘導(dǎo)對寄生蟲損害更大的宿主的免疫應(yīng)答。采用不同于傳統(tǒng)疫苗研究的技術(shù)路線，篩選出外寄生蟲在正常發(fā)育過程中從未與宿主免疫系統(tǒng)接觸的“隱藏抗原”，由這些“隱藏抗原”誘導(dǎo) 的宿主免疫保護可避開寄生蟲的免疫逃避機制，因此其免疫原性良好的組分可作為疫苗候選抗原，并可用于研究外寄生蟲的免疫機理，探討以分子疫苗防制外寄生蟲感染的新方法，提高對外寄生蟲及其傳播的傳染性疾病及血液原蟲病防治的水平，減少有害化學(xué)藥物對環(huán)境及肉、蛋、奶的危害，提高畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展能力。而且事實也證明科學(xué)家們在尋找“隱藏抗原”方面已有很多成功的實踐。例如， （ 1972）的研究表明飼喂于用斯蒂芬斯瘧蚊（ 腸抗原免疫的兔體上的蚊子比飼喂于未免疫或用整個蚊子的研磨物免 疫的兔體上的蚊子有較高的死亡率，這也許就是“隱藏抗原”的雛形。盡管 (1979a)沒有給出“隱藏抗原”的確切定義，但他們還是第一次記錄了“隱藏抗原”能顯著提高家畜抵抗吸血節(jié)肢動物侵襲的能力。 （ 1989; 1995）對微小牛蜱提取物進行組分純化，并進行免疫攻擊試驗，利用這種方法已經(jīng)分離到截止目前最為有效的“隱藏抗原”，如微小牛蜱的 原，并利用該抗原研制成功了抗微小牛蜱的重組疫苗。已發(fā)現(xiàn)的“隱藏抗原”還有麗蠅屬銅綠蠅的 et 1993)和 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的 et 1993)。 發(fā)現(xiàn)的功能性抗原 免疫學(xué)、分子生物學(xué)和信息技術(shù)的迅速發(fā)展為蜱的功能性抗原的發(fā)現(xiàn)及研究提供了有力的手段。截止目前，已從微小牛蜱、長角血蜱、小亞璃眼蜱等多種蜱的唾液腺、腸道、馬氏管、卵巢和肌肉等組織與器官中分離和鑒定出多種重要的功能性抗原。利用這些功能性抗原免疫的動物均能產(chǎn)生不同程度的抗蜱免疫。 微小牛蜱有關(guān)的功能性抗原 在蜱的免疫學(xué)防治方面，對微小牛蜱研究較多也較早，而且 成為最著名的保護性抗原。 原是 (1989)從半飽血微小牛蜱雌蜱腸道中分離出的一種膜結(jié)合糖蛋白，分子量為 89000，等電點為 微克級的抗原免疫牛所產(chǎn)生的抗體即對牛有抗蜱保護作用，當(dāng)微小牛蜱吸食了用 原免疫的牛的血液時，血液中的抗體即與蜱腸道表面的相應(yīng)糖蛋白結(jié)合，從而使蜱腸道受到嚴(yán)重?fù)p傷，當(dāng)牛血液滲入蜱的血淋巴后，能更進一步引起蜱的大規(guī)模死亡及繁殖和生存能力的下降等。并已證明 一種“隱藏抗原”。但天然 原在微小牛蜱體內(nèi)含量甚微，限制了從蜱中大量分離和純化該類蛋白，于是人們尋求 用分子生物學(xué)手段來獲得重組蛋白。 (1994)證實 原在不同株的微小牛蜱腸道細(xì)胞膜上均有存在，用重組蛋白 備的疫苗對不同株的微小牛蜱以及已經(jīng)對有機磷農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的微小牛中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 4 蜱都能產(chǎn)生免疫抵抗。該結(jié)果提示可用重組 疫牛來防制微小牛蜱。于是 (1989) 構(gòu)建了一個庫容量為 8 105 微小牛蜱 庫 , 并根據(jù) 內(nèi)切蛋白酶 化序列設(shè)計了 4 個寡脫氧核苷酸探針，用此探針從文庫中分離和鑒定出一個編碼 其序列包 含一個 1982 個堿基的開放閱讀框 , 預(yù)測的 組蛋白含有 650 個氨基酸 , 其中包括 19 個氨基酸的信號序列和近 C 端 23 個氨基酸的疏水區(qū)。推測的蛋白結(jié)構(gòu)含有由 6 個半胱氨酸殘基構(gòu)成的多次重復(fù)區(qū)，提示該蛋白含有多個表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域。大腸桿菌中對 599 個氨基酸的 白和 651 個氨基酸的 該包涵體免疫的牛對微小牛蜱具有明顯的抵抗力。然而，原核表達的重組 函體對動物的免疫保護作用不如天然 是澳大利亞墨爾本大學(xué)的 (1990) 利用真菌的 動子系統(tǒng)對微小牛蜱的 因在絲狀真菌 進行了高效表達和分泌。表達產(chǎn)物包含 泌信號及其全部成熟多肽，但無疏水碳端。所分泌的 重組蛋白分子量約為 83到 87根據(jù)氨基酸序列推測的分子量為 69表達水平約為 ，未在細(xì)胞內(nèi)檢測到該重組蛋白。在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中檢測到了高水平的編碼 巴的 1994) 和1996) 等對在畢赤酵母（ 表達的重組蛋白 生化特性進行了研究，結(jié)果顯示在該系統(tǒng)中表達的 7到 40的是 1997) 的研究恰恰證實了正是因為這種顆粒狀的結(jié)構(gòu)才提高了 原的免疫原性及其在控制微小牛蜱方面的巨大潛力。但可惜的是盡管以重組蛋白 基礎(chǔ)的抗微小牛蜱疫苗好多試驗中以其對牛的強大保護力征服了廣大用戶，但在阿根廷 A 株 微小牛蜱面前它卻顯得蒼白無力。于是古巴科學(xué)家 (2000) 利用反轉(zhuǎn)錄 微小牛蜱 A 株中分離了 因，并在畢赤酵母（ 進行了表達，表達產(chǎn)物為一顆粒狀糖蛋白。試驗表明以該重組蛋白為基礎(chǔ)的疫苗對不同地域的微小牛蜱具有更廣譜的抗性。然而通常以單一抗原為基礎(chǔ)的抗蜱疫苗往往不如以幾種靶抗原為基礎(chǔ)的抗蜱疫苗的保護效果，于是人們也在不停地尋找微小牛蜱的其它保護性抗原。例如， （ 1991）從半飽血微小牛蜱雌蜱中分離出 的一種羧基二肽酶，是在微小牛蜱的唾液腺和腸道中大量分布的一種“隱藏抗原”。 （ 1996）證實 增強 為疫苗抗原對微小牛蜱的抵抗作用。（ 1998）也從半飽血的微小牛蜱雌蜱中分離出 原，盡管該抗原對動物的免疫保護性不如 么顯著，但當(dāng)其與 合應(yīng)用時，能增加后者的免疫性。研究還發(fā)現(xiàn)微小牛蜱自然感染宿主不能產(chǎn)生針對 免疫應(yīng)答，提示它又是一種“隱藏抗原”。免疫熒光分析顯示該抗原在蜱腸道、唾液腺和卵巢等的表面廣泛分布。另一方面，一些細(xì)胞因 子能調(diào)節(jié)動物的免疫應(yīng)答， （ 1999）曾嘗試用編碼 列與一些羊的細(xì)胞因子基因聯(lián)合應(yīng)用，最后輔以一次 組蛋白來免疫綿羊，并獲得了強烈的抗體應(yīng)答。單克隆抗體技術(shù)在尋找抗蜱保護性抗原和評價抗蜱抗體是否對蜱具有損傷性等方面也發(fā)揮著重要作用。 (1995) 利用 18 種抗微小牛蜱中腸抗原的單克隆抗體作探針分別與不同發(fā)育階段的微小牛蜱的各種器官雜交，結(jié)果證實了常規(guī)抗原存在于成蜱的腸道表面、唾液腺型腺泡和馬氏管及幼蜱的腸道中，但在成蜱的卵巢和發(fā)育中的卵中不存在。在此之前， 他們用單克隆抗體 淀了一種抗原，當(dāng)用 10 日齡微小牛蜱幼蜱攻擊用該抗原免疫的牛時，該蜱的產(chǎn)卵量減少 62%且對牛的保護率達 99%以上。對抗微小牛蜱中腸和生殖管組織的單克隆抗體篩選時發(fā)現(xiàn)，有一種單中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 5 克隆抗體能與不同發(fā)育階段的微小牛蜱的組織中的不同大小的蛋白反應(yīng)，有一種只與 中腸提取物反應(yīng)（ et 1991）。在巴西 , (1997) 用微小牛蜱的胚和腸道提取物免疫 c 小鼠，將該小鼠的脾細(xì)胞和 骨髓瘤細(xì)胞雜交，制備了 四種單克隆抗體。這些單克隆抗體均能識別不同發(fā)育階段的微小牛蜱的組織或器官。當(dāng)他們將這些單克隆抗體注射入飽血微小牛蜱雌蜱的下腹后，發(fā)現(xiàn)單抗 使該蜱的產(chǎn)卵量顯著下降。 長角血蜱有關(guān)的功能性抗原 (1999)測定了一個能編碼分子量為 29胞外基質(zhì)樣蛋白的 隆，所編碼蛋白 長角血蜱唾液腺相關(guān)，此胞外基質(zhì)樣蛋白的結(jié)構(gòu)類似于膠原蛋白。該蛋白能在飽血或未飽血的長角血蜱成蜱或非成蜱中表達，重組蛋白對兔具有明顯的免疫保護作用 ，曾被作為抗長角血蜱疫苗的候選抗原。然而， 組蛋白只能刺激家兔產(chǎn)生抗長角血蜱幼蜱和若蜱的免疫，而對成蜱無任何抗性。于是 (2001) 又對所構(gòu)建的長角血蜱成蜱的 達文庫進行了免疫學(xué)篩選，并結(jié)合 和 3末端快速擴增技術(shù)克隆了兩個編碼該蜱唾液腺蛋白的 別命名為 析表明此二基因也能在蜱的其它器官中表達。他們在大腸桿菌中成功表達了重組 白，并對其作為抗蜱疫苗抗原的可行性也做了分析，結(jié)果顯示 種重組蛋白均可作 為抗長角血蜱“雞尾酒”疫苗的有效成分。蜱的肌肉組織在蜱吸血時發(fā)揮著重要作用，自然也有人將尋找保護性抗原的目光盯到了蜱的肌肉組織。 (2001)用經(jīng)長角血蜱反復(fù)叮咬的家兔的陽性血清從該蜱的 達文庫中篩選出了 0 基因。其預(yù)測的氨基酸序列與黑腹果蠅（ 的肌原蛋白 I 亞基的 隆同源。免疫化學(xué)分析結(jié)果顯示，天然 0 蛋白廣泛存在于長角血蜱的各種組織中。同樣，一些酶類如幾丁質(zhì)酶、抗氧化酶和絲氨酸蛋白酶及其抑制劑在蜱的生活史中也是非常重要的。幾 丁質(zhì)酶與蜱的蛻皮、調(diào)控新陳代謝和圍食膜孔隙度等密切相關(guān)。 (2003) 首次從長角血蜱 庫中克隆了一個蜱的幾丁質(zhì)酶分子，并在昆蟲桿狀病毒中對之進行了成功的表達。重組的幾丁質(zhì)酶 有效降解幾丁質(zhì)。該研究預(yù)示此重組蛋白可作為抗長角血蜱疫苗的候選抗原。同時由于重組的昆蟲桿狀病毒能感染蜱，也啟發(fā)人們?nèi)パ兄埔环N新的生物殺蟲劑?？寡趸改芗皶r清除真核生物在有氧代謝過程中產(chǎn)生的氧自由基，從而消除氧自由基對真核生物的毒性作用。 2001) 首次克隆和表達了長角血蜱的一種有酶活性的過氧化物還 原酶 酶在蜱吸血時大量表達，提示它可能是蜱正常生活史中的一種重要解毒酶。對 能的闡明能幫助我們更好的理解蜱唾液腺的生理特性和蜱在吸血時與宿主間的相互作用。絲氨酸蛋白酶及其抑制劑能參與許多生物的發(fā)育和生理功能的調(diào)節(jié)，所以它們或許也是抗蜱疫苗的候選抗原 (1984, 1986; et 1998; et 2001a)。 (2001b)利用 端快速擴增技術(shù)（ 隆了長角血蜱的兩個絲氨酸蛋白酶基因 （ 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 6 它功能性抗原 1988) 的研究表明，美洲花蜱（ 叮咬家兔的過程中能向兔體分泌一些物質(zhì)，在這些分泌物中有三種分子量分別為 41、 40 和 39蛋白能刺激家兔產(chǎn)生抗美洲花蜱的抗體。 （ 1986） 用免疫印跡法證實超敏兔血清能與吸血 96 小時的小亞璃眼蜱（ 蜱唾液中的 9 種蛋白和唾液腺中的 17 種蛋白反應(yīng)。將從唾液中提取的抗原、和 注入經(jīng)小亞璃眼蜱叮咬的家兔皮內(nèi)后，三者均能刺激機體產(chǎn)生速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，同時后兩者能刺激機體產(chǎn)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。實驗結(jié)果解釋了影響抗蜱免疫的機理。 (1996) 用蛔蟲提取物（ 種型變態(tài)反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)劑）和蜱唾液腺提取物（ 弗氏不完全佐劑免疫雜交牛（ 結(jié)果表明當(dāng)作為免疫調(diào)節(jié)劑的蛔蟲提取物與蜱的唾液腺提取物聯(lián)合應(yīng)用時，能明顯增強?？剐喠а垓珧绲拿庖吡Α?2001) 用 認(rèn)了一種分子量為 39蛋白，它能引發(fā) 牛對不同階段小亞璃眼蜱的抗性。 (2003) 利用 端快速擴增技術(shù)（ 隆了附尾扇頭蜱（ 四個絲氨酸蛋白酶抑制劑基因（ (2003) 克隆和表達了兩種蜱的鐵蛋白酶。周金林 (2004) 等也克隆到了鐮形扇頭蜱和微小牛蜱的多個酶和酶的抑制劑分子新基因。 商業(yè)化的抗蜱疫苗 目前 ,已商業(yè)化的預(yù)防寄生蟲的疫苗只有預(yù)防微小牛蜱的 et 1995; et 1992）和 (et 1995a)。 抗原成分是 1994年在澳大利亞注冊，并進行了大范圍的評價，通過生產(chǎn)者的調(diào)查，用戶的接受程度已很高。在巴西的一項病原管理的項目中進行了野外評價。該疫苗能使免疫牛所感染的蜱的數(shù)量下降 89%。古巴生產(chǎn)的抗微小牛蜱疫苗 根據(jù)已發(fā)表的 列而生產(chǎn)的。截止目前，該疫苗已在古巴、哥倫比亞、 多米尼加共和國、巴西、玻利維亞和巴拉圭等國家注冊，在墨西哥、巴西、哥倫比亞和古巴進行了條件試驗，并在古巴、巴西、阿根廷和哥倫比亞等國家進行了田間試驗 (et 1997)。 (1995b) 在巴西的田間試驗顯示重組疫苗奶牛、肉牛及雜交牛均有很好的保護作用。且當(dāng)該疫苗與口蹄疫疫苗和和狂犬病疫苗一起使用時，三者不會互相影響，也不會對被免疫動物產(chǎn)生不良影響。他們建議每 6 周重復(fù)免疫一次能一直維持 保護作用。因微小牛蜱是牛巴貝斯蟲（ 無漿體（ 的傳播媒介，所以抗微小牛蜱疫苗 應(yīng)用也降低了牛巴貝斯蟲病和無漿體病的發(fā)病率 (et 1995c; et 1995)。同時，也因該疫苗的使用從總體上增強了牛的體質(zhì)，從而提高了牛對蠅蛆病等其它疾病的抵抗力 (et 1995)。另一方面，也因該疫苗的使用而節(jié)省了對蜱的傳統(tǒng)化學(xué)療法及用于治療蜱傳病的巨大開支 (et 1997)。因為計算機模擬可以為疫苗免疫控制方法提供 快速而簡便的方式，故用疫苗進行大規(guī)?？跪缑庖叱绦虻挠嬎銠C模擬工作正在古巴進行，但程序還有待于進一步完善和優(yōu)化。另外，因許多蜱種之間存在交叉反應(yīng)，故多價免疫將是更有效的疫苗，目前澳大利亞人正在尋求其他抗原，以便與合使用來加強疫苗的效果。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 7 蜱免疫的評價標(biāo)準(zhǔn) （ 1994）認(rèn)為抗蜱疫苗在田間并不一定在一代內(nèi)就直接將蜱殺死，而是要在連續(xù)的幾代內(nèi)通過降低蜱的繁殖能力而從總體上循序漸進地控制蜱的數(shù)量?？跪缫呙绲闹饕Ч峭ㄟ^減少每只飽血雌蜱的產(chǎn)卵量從而減少幼蜱總量，只對少量動物 免疫所得到的保護效果相對于對蜱種群的控制計劃來說只是杯水車薪。目前，限制抗外寄生蟲疫苗進入市場的主要因素可能還是源于人們對寄生蟲疫苗通過免疫攻擊試驗來評價的誤區(qū)。 議，對寄生蟲疫苗的評價應(yīng)以動物系統(tǒng)中的經(jīng)濟效益及其他可持續(xù)農(nóng)業(yè)的指標(biāo)為準(zhǔn)，而不應(yīng)僅僅以疫苗免疫和攻擊研究中的保護率水平為準(zhǔn)。僅僅中度有效的疫苗可能在降低寄生蟲數(shù)量方面很有作用。從長遠(yuǎn)角度來看，將免疫保護期延長至 5 10 年在寄生蟲控制中的作用要遠(yuǎn)比將保護率提高到 50 70的作用大得多。必須看到，外寄生蟲疫苗只能減少外寄生蟲數(shù)量而不是只 保護單個動物，而且還需連續(xù)幾代在一定范圍內(nèi)科學(xué)管理才能見效。所以， （ 1995）認(rèn)為一個良好的蜱的防控計劃應(yīng)該做到： 1，對一個畜群中所有動物都要進行抗蜱免疫。 2，接受抗蜱免疫的畜群要封閉管理，因為引入未免疫的個體會使蜱在整個畜群中又死灰復(fù)燃。 3，應(yīng)該明確抗蜱疫苗對蜱的損害是從吸食了被免疫動物血液的蜱的下一代開始的，并在逐代加強。 綜上所述，疫苗免疫是畜禽病蟲害可持續(xù)控制技術(shù)中最為有效的方法之一，家畜外寄生蟲病的防治也是如此。而設(shè)計寄生蟲疫苗的關(guān)鍵是：（ 1）確認(rèn)保護性抗原；（ 2）使該抗原的 生產(chǎn)達到足以使用的量；（ 3）用最有效的方法去管理和實施。然而，多少年來，這三個因素仍象一條不可逾越的鴻溝阻礙著人類利用免疫學(xué)方法防治蜱的進程。直到最近十幾年來，人類才揭開了抗寄生蟲疫苗免疫的神秘面紗之一角?，F(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，使得人們對保護性抗原的尋找變的更加方便可靠。各種克隆表達系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，使得科學(xué)家們能夠得到足量的用于分析的保護性抗原，并使該種抗原的商業(yè)化批量生產(chǎn)成為可能。新型佐劑的出現(xiàn)和利用生物復(fù)制載體（如細(xì)菌和病毒）將抗原導(dǎo)入宿主已開辟了預(yù)防接種的新途徑 (et 1991)。免疫新概念正在完善我們對免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)機制的理解，而對抗原的研究已拉開了人類理解各種免疫細(xì)胞激活機理的新序幕。目前，盡管抗寄生蟲疫苗還相對甚少，而且還存在著種種缺陷，如果將人類當(dāng)前對寄生蟲免疫的研究成果看成是寒夜中的啟明星，則利用疫苗來徹底防治寄生蟲的曙光離我們并不遙遠(yuǎn)。 究內(nèi)容和方法 盡管我國是蜱及蜱傳病危害最為嚴(yán)重的國家之一，但在蜱的免疫學(xué)方面的研究工作開展甚少。本研究以青海血蜱這一我國特有的蜱種為研究對象，采用不同于傳統(tǒng)疫苗研究的技術(shù)路線，從蜱的唾液腺篩選出外寄生蟲在正常 發(fā)育中從未與宿主免疫系統(tǒng)接觸的“隱藏抗原”，由這些“隱藏抗原”誘導(dǎo)的宿主免疫保護可防止寄生蟲的免疫逃避機制。試驗中將通過比較用蜱叮咬和用蜱唾液腺研磨物免疫動物所得抗血清的差異