【畢業(yè)學(xué)位論文】(Word原稿)短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX功能成分羥苯乙酯含量測(cè)定及其發(fā)酵條件優(yōu)化-生物化學(xué)與分子生物學(xué)

分類號(hào)： 單位代碼： 10389 密 級(jí)： 學(xué) 號(hào)： 1101652 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 短短芽胞桿菌 能成分羥苯乙酯含量測(cè)定及其發(fā)酵條件優(yōu)化 學(xué) 科 門 類： 理學(xué) 一級(jí)學(xué)科名稱： 生物學(xué) 二級(jí)學(xué)科名稱： 生物化學(xué)與分子生物學(xué) 研 究 方 向： 微生物分子生物學(xué) 研 究 生： 指 導(dǎo) 教 師： 博士、研究員 博士、副研究員 博士、教授 完 成 時(shí) 間：二 O 一三年四月 短短芽胞桿菌 能物質(zhì)羥苯乙酯含量測(cè)定及其發(fā)酵條件優(yōu)化 of its 2013 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明，所呈交的學(xué)位 （ 畢業(yè)）論文，是本人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下獨(dú)立完成的研究成果，并且是自己撰寫的。盡我所知，除了文中作了標(biāo)注和致謝中已作了答謝的地方外，論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同對(duì)本研究做出貢獻(xiàn)的同志，都在論文中作了明確的說明并表示了謝意，如被查有侵犯他人知識(shí)產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔(dān)應(yīng)有的責(zé)任。 學(xué)位 （ 畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 論文使用授權(quán)的說明 本人完全了解福建農(nóng)林大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位 （ 畢業(yè)）論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)送交論文的復(fù)印件，允許論文被查閱 和借閱； 學(xué)校可以公布論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。 保密，在 年后解密可適用本授權(quán)書。 不保密，本論文屬于不保密。 學(xué)位 （ 畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 指導(dǎo)教師親筆簽名： 日期 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 i 目 錄 中文摘要 . I . 一章 文獻(xiàn)綜述 . 1 1 尼泊金酯概述 . 1 用概況 . 1 化性質(zhì) . 2 用機(jī)理 . 2 2 固相萃取技術(shù) . 3 理 . 3 類 . 4 般步驟 . 5 3 高效液相 色譜技術(shù)及其應(yīng)用 . 5 述 . 5 點(diǎn) . 6 4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) . 6 因素輪換優(yōu)化設(shè)計(jì) . 7 驗(yàn)設(shè)計(jì) . 7 陡爬坡路徑法 . 7 應(yīng)面分析法 . 8 5 本研究的目的與意義 . 8 第二章 短短芽胞桿菌 能成分羥苯乙酯的測(cè)定 . 9 1 材料與方法 . 9 料 . 9 株 . 9 養(yǎng)基 . 9 法 . 9 品制備 . 9 譜條件 . 液體發(fā)酵條件 .測(cè)方法 . 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 . 系統(tǒng)適應(yīng)性 . 精密度 . 最低檢測(cè)限 .短芽胞桿菌 能物質(zhì)羥苯乙酯含量測(cè)定及其發(fā)酵條件優(yōu)化 穩(wěn)定性 . 回收率 . 11 2 結(jié)果與分析 . 11 動(dòng)相選擇 . 11 動(dòng)相為甲醇 醋酸 . 11 動(dòng)相為甲醇 . 流動(dòng)相為乙腈 . 流動(dòng)相為乙腈 .測(cè)波長(zhǎng)的選擇 .準(zhǔn)曲線的線性范圍研究 .統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) .密度試驗(yàn) .低檢測(cè)限度 .定性 .收率 .品測(cè)定 . 討論 .三章 短短芽胞桿菌 能物質(zhì)羥苯乙酯生產(chǎn)發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化 . 材料與方法 .料 . 菌株 . 培養(yǎng)基 .法 . 羥苯乙酯含量測(cè)定 . 菌體干重 . 液體發(fā)酵條件 . 單因素優(yōu)化 . 驗(yàn) . 最陡爬坡試驗(yàn) . 響應(yīng)面分析 . 驗(yàn)證試驗(yàn) . 結(jié)果與分析 .因素優(yōu)化 . 不同碳源的影響 . 不同氮源的影響 . 不同無機(jī)鹽的影響 .建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 酵主要影響因子的篩選 .陡爬坡路徑確定重要影響因子的最適濃度范圍 .應(yīng)面分析優(yōu)化 （ 培養(yǎng)基組成 . 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié) 果 . 二次響應(yīng)面回歸模型的建立 . 二次響應(yīng)回歸模型的評(píng)價(jià) . 二次回歸模型的脊嶺分析 . 培養(yǎng)基組分最適濃度的獲取 . 回歸模型的驗(yàn)證 . 討論 .考文獻(xiàn) .人簡(jiǎn) 歷 . 謝 .建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 I 中文摘要 短短芽胞桿菌 （ 本實(shí)驗(yàn)室自土壤中分離的對(duì)多種病原菌具有抗菌活性 的菌株 ，可以抑制青枯雷爾氏菌、大腸桿菌等細(xì)菌的 生長(zhǎng)，也可以抑制尖胞鐮刀菌等真菌的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)建立了 固相萃取 功能物質(zhì) 羥苯乙酯，并利用響應(yīng)面優(yōu)化其發(fā)酵條件。 首先 ， 建立了固相萃取 品發(fā)酵液經(jīng)過 相萃取小柱，經(jīng)過 譜柱進(jìn)行測(cè)定。流動(dòng)相為甲醇 體積比為 65:35），流速 1.0 mL/測(cè)波長(zhǎng)為 254 定溫度為 25 ，進(jìn)樣量 10 L。羥苯乙酯的線性范圍為 ， r=收率為 平均 最低檢測(cè)為 10S/N=6）。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于發(fā)酵液中羥苯乙酯含量 的檢測(cè)。 其次 ， 進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化。通過單因素篩選確定最佳碳源為 源為蛋白胨，最佳金屬離子為 采用二水平 計(jì)對(duì)影響羥苯乙酯產(chǎn)量的8 因素進(jìn)行顯著性篩選，獲得培養(yǎng)基成分中 3 個(gè)重要影響因子：豆餅粉、 用爬坡路徑法對(duì)這 3 種因子進(jìn)行試驗(yàn)，獲得 3 種重要因子的最適濃度范圍；通過響應(yīng)面分析法得到 3個(gè)重要因子的交互作用和最佳條件： 豆餅粉 g/L、 g/L、g/L、蛋白胨 2 g/L 、溫度 35 、接 種量 2 %、通氣量 100/250 速 170 r/化結(jié)果與實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合較好， 較基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 （ mg/高了 。說明響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析較成功地應(yīng)用于本培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)。發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化對(duì)菌種的優(yōu)化非常重要，本研究結(jié)果對(duì)該菌株的工業(yè)發(fā)酵和羥苯乙酯的生產(chǎn)具有重要意義。 關(guān)鍵詞 ：短短芽胞桿菌 ； 固相萃取 ； 高效液相色譜 ； 羥苯乙酯 ； 發(fā)酵 短短芽胞桿菌 能物質(zhì)羥苯乙酯含量測(cè)定及其發(fā)酵條件優(yōu)化 he a of to of of by 18. of 5:35. .0 mL/54 nm at 5 . 0 L. in ， r= on 10). It be be to in In to in to of it be a+， in of of to of of by . g/L g/L g/L g/L 35 2% 100/250 mL 70 in of mg/. of be to of is to of 建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 尼泊金酯概述 用概況 尼泊金酯于上世紀(jì) 20 年代首次報(bào)道了其抗菌活性， 1923 年尼泊金酯類就被建議作為食品和藥品的防腐劑。由于其毒性低，抑菌作用與 關(guān)，抑菌譜廣 （ 周家華， 2001） ，它廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、日用品、化妝品等許多領(lǐng)域，僅在化妝品行業(yè)全國(guó)每年需求量就達(dá) 50t 以 上。尼泊金乙酯和丙酯也是世界上用量較大的防腐劑，具有高效、低毒、廣譜、易復(fù)配的優(yōu)點(diǎn)。除對(duì)真菌有效外，由于它具有酚羥基結(jié)構(gòu)，所以抗細(xì)菌性能比苯甲酸、山梨酸都強(qiáng)。但是，由于水溶性比較低，用量過大時(shí)具有特殊的氣味，使其在食品防腐上的應(yīng)用受到限制。我國(guó)在 50代也曾經(jīng)把尼泊金酯作為主要的食品防腐劑，由于水溶性的問題沒有得到很好解決，加上苯甲酸鈉的大量生產(chǎn)，它在食品工業(yè)中作為防腐劑使用的量越來越小，到 80 年代，尼泊金酯主要用作藥品和化妝品，特別是化妝品的防腐劑， 90 年代以后，隨著改革開放的不斷深化，特別是加入 ，我國(guó)跟國(guó)際的接觸越來越廣，食品生產(chǎn)必須與國(guó)際接軌，食品安全性也越來越受到人們的重視。我國(guó)明確規(guī)定 許文苑等，2002）。 世界上許多地方均把尼泊金酯作為食品防腐劑。美國(guó)、日本、歐洲、澳大利亞、加拿大、韓國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家都允許在食品工業(yè)中添加應(yīng)用。目前，已在焙烤食品、脂肪制品、乳制品、水產(chǎn)品、肉制品、調(diào)味品、胞制品、醬制品、飲料、糖果、果蔬制品、淀粉糖制品、啤酒、果酒、果蔬保鮮及制藥、化妝品與飼料等多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用 （ 孫曉云，1986；林日高等， 2002）。我國(guó)也把其列為食品防腐劑，并應(yīng)用于醬油、醋、飲料、水果、蔬菜、果汁、果醬等行業(yè) （ 段杉等， 2002）。 食品防腐劑的主要發(fā)展趨勢(shì)之一是品種多樣化、使用微量化和應(yīng)用技術(shù)制劑化。從尼泊金酯的分子結(jié)構(gòu)看，它既有親水活性基團(tuán)羥基，通過適當(dāng)?shù)母男?，可以大幅度增加其水溶性，徹底改變不溶于水這一缺陷。另外，利用不同鏈長(zhǎng)烷基醇可以生產(chǎn)系列產(chǎn)品，特別是長(zhǎng)鏈尼泊金酯系列產(chǎn)品。而尼泊金酯類系列產(chǎn)品間的復(fù)配，特別是長(zhǎng)短鏈的搭配，可以復(fù)配出適用于各類食品的專用防腐劑，這些都是其它類食品防腐劑所難以達(dá)到的。因此，尼泊金酯類生產(chǎn)技 術(shù)今后主要發(fā)展趨勢(shì)為產(chǎn)品系列化，特別是長(zhǎng)烷基鏈尼泊金酯類的開發(fā)研究，而這些產(chǎn)品的開發(fā)又能使食品防腐劑使用微量化；其次是產(chǎn)品改性技術(shù)和復(fù)配技術(shù)的研究，提高產(chǎn)品的水溶性和穩(wěn)定性，增強(qiáng)抑菌效果，使產(chǎn)品使用制劑化和專業(yè)化。 目前對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)主要方法有超聲萃取液相色譜法、具氫火焰離子化檢測(cè)器的氣相色譜法、毛細(xì)管氣相色譜法、液相色譜 此之外還有生物傳感器、紅外光譜法等。利用這些比較精確的分析方法對(duì)食品中的尼泊金酯類防腐劑進(jìn)行定性、定量測(cè)定，嚴(yán)格限制此類防腐劑的最大添加量以盡量降低其對(duì)人 體所產(chǎn)短短芽胞桿菌 能物質(zhì)羥苯乙酯含量測(cè)定及其發(fā)酵條件優(yōu)化 2 生的毒副作用。 化性質(zhì) 尼泊金酯為無色結(jié)晶或白色粉末包括對(duì)羥基苯甲酸甲酯 （ 對(duì)羥基苯甲酸乙酯 （ 對(duì)羥基苯甲酸丙酯 （ 對(duì)羥基苯甲、對(duì)羥基苯甲酸丁酯 （ ，具體理化性質(zhì)見表 1 尼泊金酯是類酯化合物，無揮發(fā)性，受 的影響小。其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定， 在 酸性、堿性和中性溶液中均有較好的防腐效果，尤其在酸性溶液中的防腐效果最好 （ 趙萬詳，1982）。因其 用范圍廣 、殺菌性能穩(wěn)定而在果蔬、醬油、水果汁等食品和化妝品中應(yīng)用廣泛 （ 張群林 等， 2006）。 表 1泊金酯主要理化性質(zhì) （ 牛欣， 2011） of 2011） 名稱 分子式 分子量 在水中溶解度 （ g/100g） 在乙醇中溶解度 （ g/100g） 在丙酮中溶解 （ g/100g） 外 觀 對(duì) 羥 基 苯甲酸甲酯 52 2 64 無色結(jié)晶或白色粉末，無味、無嗅、口嘗有麻舌感 對(duì) 羥 基 苯甲酸乙酯 0 84 無色結(jié)晶或白色粉末，無味、無嗅、口嘗有麻舌感 對(duì) 羥 基 苯甲酸丙酯 5 105 無色結(jié)晶或白色粉末，無味、無嗅、口嘗有麻舌感 對(duì) 羥 基 苯甲酸丁酯 10 240 無色結(jié)晶或白色粉末，無味、無嗅、口嘗有麻舌感 用機(jī)理 尼泊金 酯類的抑菌機(jī)理是破壞微生物的細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變性，并抑制電子傳遞酶系的活性和細(xì)胞的呼吸酶系。基團(tuán)空間位阻是抗菌活性中心發(fā)揮抗菌活性的第一限制性因素 （ 袁海濤等， 2001）。尼泊金酯的抗菌活性主要是由分子態(tài)起作用，由于分子內(nèi)的羧基已被酯化，不再電離，而對(duì)位羥基的電離常數(shù)卻很小，在溶液 為 8時(shí)，仍有 60%以上呈分子狀態(tài)存在，結(jié)果見表 1 1楊壽清， 2003）。因此，尼泊金酯的抑菌作用在 寬的范圍內(nèi)均有良好的效果 （ 陳效貴， 2001；宋國(guó)勝等， 2002）。微生物在食品體系中僅僅出現(xiàn)在水 相中，一切與生命活動(dòng)相關(guān)的酶促生化反應(yīng)也均在水相中進(jìn)行，進(jìn)入酯相的防腐劑被認(rèn)為是無效的，防腐劑主要是通過抑制微生物的能量代謝，造成能量物質(zhì) 還原力 虧缺，代謝方向趨于水解，最后導(dǎo)致細(xì)胞自溶而發(fā)揮抑菌作用。因此，防腐劑分子必須具備親水基團(tuán)才能進(jìn)入相中的菌體中，與合成代謝酶系統(tǒng)起作用。 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 3 表 1泊金酯在溶液中的電離狀況 （ 楊壽清， 2003） of in 2003） 名稱 尼泊甲酯 尼泊乙酯 尼 泊丙酯 尼泊丁酯 a 109 1-3 尼泊爾金酯在溶液中分子態(tài)的影響 （ 楊壽清， 2003） of pH on of in 2003） 泊甲酯 尼泊乙酯 尼泊丙酯 尼泊丁酯 3 100 100 100 100 4 00 100 5 物系統(tǒng)是微生物進(jìn)行能量轉(zhuǎn)化和物質(zhì)代謝等生命活動(dòng)的主要場(chǎng)所，其結(jié)構(gòu)的完整性保證了對(duì)物質(zhì)選擇透過性和細(xì)胞能量代謝等生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。防腐劑分子中 的疏水基團(tuán)具有易溶于生物膜相且能夠動(dòng)態(tài)踞留于生物膜相，結(jié)果一方面破壞了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，擾亂了微生物的正常生命活動(dòng)，另一方面由于生物膜中的脂溶性成分代謝速率較低，不易被微生物自身的酶系分解，延長(zhǎng)了防腐劑的抑菌時(shí)間。因此，防腐劑分子必須同時(shí)具備易溶于生物膜相的疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)。其透過細(xì)胞壁進(jìn)入菌體的能力與水相中的溶解度息息相關(guān)，防腐劑的抑菌性則取決于防腐劑在菌體細(xì)胞雙磷脂層中的溶解度。尼泊金酯的烷基酯鏈越長(zhǎng)，抑菌效果越好。說明疏水基團(tuán)中的存在可以增強(qiáng)防腐劑分子的抑菌效果。 2 固相萃取技術(shù) 理 固相萃 取 （ 一個(gè)包括液相和固相的物理萃取過程，是基于液相色譜理論的一種分離、純化方法，由液固萃取和液相柱色譜技術(shù)結(jié)合發(fā)展而來。其吸附劑即為固相，通過固相萃取劑對(duì)液相中被分析物的吸附作用進(jìn)行萃取，當(dāng)樣品溶液通過萃取劑時(shí)，被分析物就吸附到萃取劑上，然后采用適宜的選擇性溶劑將其洗脫下來，即可得到富集和純化了的目標(biāo)化合物。 術(shù)自上世紀(jì) 70 年代后期問世以來，以其高效、可靠及耗用溶劑量少等優(yōu)點(diǎn)，短短芽胞桿菌 能物質(zhì)羥苯乙酯含量測(cè)定及其發(fā)酵條件優(yōu)化 4 在環(huán)境、藥物分析等許多領(lǐng)域得到了快速的發(fā)展 （ ， 1993； 200