【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）抗原基因密碼子及其表達(dá)載體的優(yōu)化增強(qiáng)H5亞型禽流感DNA疫苗的免疫保護(hù)效果預(yù)防獸醫(yī)學(xué)論文定稿

密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 抗原基因密碼子及其表達(dá)載體的優(yōu)化增強(qiáng) 苗的免疫保護(hù)效果 5 A D. 5 A 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 摘要 - I - 摘 要 禽 高致病力禽流感（ 被國際獸醫(yī)局列為 年來發(fā)現(xiàn)， 7亞型高致病力禽流感病毒 (但可給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大損失，而且可以感染人并致人死亡， 有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義，對(duì) 苗 是 防 制 禽 流 感 最 具 潛 力 的 基 因 工 程 疫 苗 之 一 。 以 (（ 野生型 含 強(qiáng)子的 5亞型 別以 100g、 500行免疫后 攻毒保護(hù)試驗(yàn)及保護(hù)性抗體持續(xù)期研究。試驗(yàn)結(jié)果表明， 00g、50 D/1/96（ 擊形成 100的完全免疫保護(hù)（不發(fā)病、不排毒），免疫后誘導(dǎo)的有效保護(hù)性 10傳統(tǒng)的全病毒滅活疫苗相比， 5亞型高致病力禽流感具有免疫保護(hù)期長、不干擾常規(guī)血清學(xué)免疫監(jiān)測(cè)的突出優(yōu)點(diǎn)，但也存在免疫劑量大、使用成本高的缺陷。 免疫原基因的密碼子及其真核表達(dá)載體的優(yōu)化是提 高 碼氨基酸密碼子的搖擺性導(dǎo)致了不同物種間細(xì)胞在蛋白翻譯過程中具有密碼子使用的偏嗜性。雞與哺乳動(dòng)物細(xì)胞在蛋白翻譯過程中具有相同的密碼子偏嗜性，但與 此，利用寡核苷酸合成及重疊延伸 D/1/96( 作為 以及野生型 別插入 子表達(dá)載體 建的93 5亞型 種表達(dá)質(zhì)粒均可獲得正確表達(dá)；間接免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染后 24 48小時(shí) 293碼子優(yōu)化的 一結(jié)果為進(jìn)一步開展 選優(yōu)化的 為評(píng)估 5亞型禽流 感 000周齡 4周后分別用 100( 5/01(鼻腔途徑進(jìn)行攻擊，觀察發(fā)病與死亡情況，分別于攻毒后第 3、 5、 7采集喉頭及泄殖腔拭子進(jìn)行病毒分離、滴定檢測(cè)排毒情況，同時(shí)檢測(cè)免疫后、攻毒前及攻毒后血清 四種疫苗單次免疫的免疫保護(hù)效果進(jìn)行比較評(píng)估 。結(jié)果， 100可對(duì)免疫雞形成 100 完全保護(hù)（不發(fā)病、不致死、不排毒）， 種 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 摘要 - 10對(duì)免疫雞形成 100完全保護(hù)（不發(fā)病、不致死、不排毒）， 種 0 為進(jìn)一步評(píng)估二次免疫條件下 因密碼子優(yōu)化及不同表達(dá)載體對(duì) 型 苗免疫效果的影響，質(zhì)粒 別以 100g 和 10g 肌肉注射免疫3 周齡 ，免疫后第 4 周以同樣劑量和途徑加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫 2 周以 100 N/45/01(腔感染攻毒，對(duì)三種疫苗加強(qiáng)免疫后的免疫保護(hù)效果進(jìn)行比較 評(píng)估 。 結(jié)果，100g 劑量加強(qiáng)免疫組中， 可對(duì)免疫雞形成 100 完全保護(hù)（不發(fā)病、不致死、不排毒）；三種 苗加強(qiáng)免疫所誘導(dǎo)的平均 體水平由高到低依次為 10g 劑量加強(qiáng)免疫組中， 00 完全保護(hù)（不發(fā)病、不致死、不排毒）， 形成對(duì)免疫雞的部分免疫保護(hù)；比較三種 苗 10g 加強(qiáng)免疫所誘導(dǎo)的平均 體反應(yīng)水平 ， 近，而顯著高于 本研究首次證實(shí) 苗在雞體內(nèi)可誘導(dǎo)長期持續(xù)的高水平保護(hù)性 體，并首次證明 動(dòng)子表達(dá)載體 著提高 型禽流感 苗誘導(dǎo)的保護(hù)性抗體免疫反應(yīng)水平，增強(qiáng)免疫保護(hù)效果，同時(shí)證明，通過密碼子和載體的優(yōu)化，可使 型禽流感 苗有效免疫保護(hù)劑量降低至 10g 水平，其推廣應(yīng)用已具備充分的經(jīng)濟(jì)可行性。 為免疫效果良好、成本低廉的優(yōu)化 苗，有望成為 預(yù)防 型高致病力禽流感的高效、安全新型基因工程疫苗。 關(guān)鍵詞： 型禽流感， 苗，密碼子優(yōu)化中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 英文摘要 - i - as H5 7 in is of 5 by A (MV PF 00g, 50g 0g in a 3 by I 00g 0g I no no I 0g 00g of of of of NA be by or of It is in in in CR we a 5 A by of of A s as A as 93T by A by A A in in in To PF 00g 0g of 00l A of 00l as I 00of (5/01(, 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 英文摘要 - , 5 of in in 00g I I to in no no no in of 0g of I I to in no no no in To NA or PF 00g 0g of in a 4 A of 00l as of I 00of N/45/01( , 5 of in in 00g I I to In 0I of in no no no in in 2 In 5 A NA I in NA be a a 5HA in 5N1 at 0g, of NA in H5 目錄 - i - 目 錄 引言 . 1 1 禽流感流行歷史及現(xiàn)狀 . 1 . 1 . 2 國 行歷史 . 4 2 公共衛(wèi)生意義 . 5 人流感相關(guān)的禽流感事件 . 5 生導(dǎo)致人流感大流行病 毒株的可能機(jī)制 . 6 3 禽流感的疫苗防制 . 7 流感疫苗的研究與應(yīng)用歷史 . 7 種主要的禽流感疫苗 . 8 4 苗研究進(jìn)展 . 11 動(dòng)物病原相關(guān)的 苗 . 12 苗的免疫機(jī)理 . 13 苗的優(yōu)化 . 17 小結(jié) . 20 實(shí)驗(yàn)一 表達(dá) 型 因的 苗對(duì) 擊的免疫保護(hù)效果及保護(hù)性抗體持續(xù)期研究 . 22 1 材料與方法 . 23 毒 . 23 胚和 . 23 苗質(zhì)粒 . 23 I 陽性抗原 . 23 苗質(zhì)粒的大量制備及其純化 . 23 疫 . 24 毒 . 24 體測(cè)定 . 24 毒分離 . 25 體持續(xù)期測(cè)定 . 25 2 結(jié)果 . 26 同劑量 疫對(duì) 型 擊的免疫保護(hù)結(jié)果 . 26 2.3 疫后誘導(dǎo)產(chǎn)生的 體至少可以持續(xù)一年 . 28 3 討論 . 29 實(shí)驗(yàn)二 密碼子優(yōu)化的 型 因構(gòu)建及其 苗表達(dá)載體優(yōu)化與體外表達(dá)研究 . 31 1 材料與方法 . 32 種及質(zhì)粒 . 32 及相關(guān)試劑 . 33 養(yǎng)液 . 33 5 亞型陽性血清 . 33 抗 . 33 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 目錄 - 5 亞型 因雞體偏嗜性密碼子的改寫與序列分析 . 34 于 寡核苷酸片段和引物的合成 . 36 1.8 因 11 個(gè)小片段的 增 . 36 1.9 因 11 個(gè)小片段的克隆 . 37 因 構(gòu)建策略 . 38 因 定及酶切分析 . 39 因 測(cè)序驗(yàn)證 . 39 達(dá)質(zhì)粒 構(gòu)建 . 39 粒 293T 細(xì)胞中的表達(dá) 40 2 結(jié)果 . 42 因 段酶切位點(diǎn) . 42 2.2 因小片段的 增 . 42 2.3 因小片段的克隆與測(cè)序 . 43 因 定及酶切分析 . 43 因 測(cè)序驗(yàn)證 . 44 粒 構(gòu)建 . 47 粒轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞的間接免疫熒光結(jié)果 . 49 A 蛋白在 293T 細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物檢 測(cè) . 49 3 討論 . 53 實(shí)驗(yàn)三 抗原基因密碼子及其表達(dá)載體的優(yōu)化增強(qiáng) 型禽流感 苗免疫保護(hù)效果 . 55 1 材料與方法 . 56 毒 . 56 胚和 . 57 苗質(zhì)粒 . 57 I 陽性抗原 . 57 苗質(zhì)粒的大量制備及其純化 . 57 的免疫 . 57 毒 . 58 體檢測(cè) . 58 毒分離與滴定 . 58 2 結(jié)果 . 58 次免疫試驗(yàn) . 58 強(qiáng)免疫試驗(yàn) . 69 3 討論 . 79 結(jié)論 . 82 參考文獻(xiàn) . 83 致謝 . 98 . 100 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 引言 - 1 - 引 言 禽流感（ 由正粘病毒科、流感病毒屬、 或疾病綜合征。 100多年前人類首次在意大利證實(shí)該病的存在，目前已經(jīng)在全世界廣泛流行。 所有的禽類均對(duì)禽流感病毒易感，但不同類種的禽對(duì)該病的抵抗力不同。禽流感的感染在禽類有很寬的癥狀譜，從輕微的發(fā)病到迅速感染和快速致死，并引起嚴(yán)重的流行。因而，根據(jù)其致病力的不同，禽流感可以分為低致病力禽流感（ 高致病力禽流感（ 速發(fā)病，并迅速引起禽群的大批死亡，其致死率通?？梢赃_(dá)到 100，因而被 類動(dòng)物傳染病。 近年來， 反， 別是 2003年底到 2004年年初在亞洲流行的 及到 10多個(gè)國家和地區(qū)，我國也不例外。這次 且在越南和泰國引起人的感染并死亡。 的嚴(yán)重威脅人畜健康的病毒亞型隨時(shí)可能出現(xiàn)，由它們引起的新興疫?。?一種長期存在的潛在威脅。因此， 其防制將是各國政府和疫病控制及研究機(jī)構(gòu)長期而艱巨的任務(wù)。 雖然用疫苗控制 疫苗結(jié)合其他控制措施的應(yīng)用在控制 而，疫苗接種仍然是當(dāng)前世界范圍內(nèi)控制 一。在對(duì)疫苗的使用保持樂觀的同時(shí)，我們不能忽略當(dāng)前使用的疫苗所引起的負(fù)面影響和潛在威脅。為克服這些缺點(diǎn)，新型的 中 可能成為未來控制 1 禽流感流行歷史及現(xiàn)狀 人類對(duì)禽流感的認(rèn)識(shí)始于十九世紀(jì)七十年代， 1878年 后，禽流感在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，許多國家和地區(qū)均有禽流感暴發(fā)流行的歷史，禽流感疫情給養(yǎng)禽業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì) 損失。 于眾多的 至目前為止，除 5亞型的一些毒株外，大部分 且迄今為止，除鴨、鵝外（ et 1987），還沒有從外表健康的水禽中分離到至對(duì)一種鳥表現(xiàn)為高致病性的 其它禽種來說卻有可能是低致病性的（ et 1986），一般來講，對(duì)于雞是高致病力的病毒往往對(duì)鴨表現(xiàn)為低致病性。由 I，死亡率遠(yuǎn)沒有 而其存在卻相當(dāng)廣泛，僅 1998年，就從美國活禽市場(chǎng) 的雞中中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 引言 - 2 - 分離到 415株 中 372株 33株 1株 1株 1株 1株 株 僅僅引起輕微的發(fā)病。如 981)報(bào)道的 2的火雞產(chǎn)白殼蛋。其他同期的火雞中暴發(fā)的 0 40和呼吸道疾病，但引起的死亡率不高。 在一些特殊的 毒也引起了嚴(yán)重的疾病和死亡。如 1975年美國阿拉巴 馬州暴發(fā)的由 有記錄的雞群中引起的死亡率為 69（ et 1977）。 1995年美國猶他州暴發(fā)的由 中 0至 4周齡火雞的致死率為 40（ et 1998）。在多數(shù)情況下，這種高的致死率都是與其他細(xì)菌病混合感染有關(guān)，如埃希氏大腸桿菌和巴氏桿菌感染。在 1997年意大利由 雞被大量感染。肉用火雞的臨床和死后癥狀的嚴(yán)重程度有顯著的變化，臨床癥狀以呼吸困難為主，根據(jù)感染雞年齡的不同，死亡率從 5到 97。在幼齡肉雞，臨床癥狀通常都很嚴(yán)重，致死率為 40 90。在種火雞，觀察到了相同的溫和的臨床癥狀，表現(xiàn)為肺部有水泡音、咳嗽、眼瞼腫脹、高燒伴隨食欲廢絕。在急性期，產(chǎn)蛋量下降了 30 80，但是一部分患雞從發(fā)病開始算起 3周后恢復(fù)到亞正常狀態(tài)。致死率從 5 20（ et 2000）。同樣，近些年在巴基斯坦和伊朗報(bào)道的由 于雞和火雞，特別是散養(yǎng)雞和火雞，當(dāng)出現(xiàn) 之后，就會(huì)迅速出現(xiàn)大量的禽只死亡，死亡率通常會(huì)在幾天內(nèi)達(dá)到 100。除高致死率外，所表現(xiàn)的臨床癥狀可能有：產(chǎn)蛋停止、呼吸道癥狀、肺部水泡音、大量流淚、鼻竇炎、頭臉部腫大、皮下出血、皮膚蒼白（特別是頭和肉髯）和腹瀉，有時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。當(dāng)出現(xiàn)這些癥狀時(shí)，禽通常即將死亡。 自 1959年，蘇格蘭首次暴發(fā)由 1993； et 2002； et 2001； et 1998）。每次 表 1)。例如，美國政府為了消滅 1983年賓夕法尼亞州暴發(fā)的 資 6000萬美元，撲殺了 1700萬只雞，而消費(fèi)者更是支出了 巴基斯坦 1994年的 220萬只雞感染了 亡率高達(dá) 51 1995年墨西哥政府為了撲滅和凈化由 及 12個(gè)州的 汰了 1800萬只雞，封鎖了 3200萬只雞，緊急接種 接經(jīng)濟(jì)損失達(dá) 10億美元，之后，墨 西哥政府在三年內(nèi)又接種了 接損失無法估計(jì)；在轟動(dòng)世界的 97年香港禽流感事件中，特區(qū)政府耗資 1億港幣，撲殺了 150萬只雞； 2001年，香港再度發(fā)現(xiàn) 區(qū)政府又斥資 8000萬港幣撲殺 120萬只雞，并且至今沒有辦法將 1985年澳大利亞 00萬美元。值得注意的是，從 2003 2004年年初， 及歐洲荷蘭、德國、丹麥；亞洲韓國、日本、中國、臺(tái)灣、越南、巴基斯坦、柬埔寨 、泰國、老撾等；美洲加拿大、美國等，不但對(duì)暴發(fā)國家的養(yǎng)禽業(yè)和經(jīng)濟(jì)造成了重大損失，同時(shí)對(duì) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 引言 - 3 - 表 1. 1959 年以來全世界 發(fā)情況 . in 959 時(shí)間 國家 /地區(qū) 感染動(dòng)物種類 亞型 1959 蘇格蘭 雞 963 英格蘭 火雞 966 加拿大 火雞 976 澳大利亞 雞 979 德國 雞 979 英格蘭 火雞 983 1985 美國 雞 , 火雞 983 愛爾蘭 火雞 985 澳大利亞 雞 991 英格蘭 火雞 992 澳大利亞 雞 994 澳大利亞 雞 994 1995 墨西哥 雞 994 巴基斯坦 雞 997 澳大利亞 雞 997 香港 雞 997 意大利 雞 999 2000 意大利 火雞 002 香港 雞 002 智利 雞 003 荷蘭 雞 003 比利時(shí) 雞 003 德國 雞 003 韓國 雞 、喜鵲 004 越南 雞 、豬 004 日本 雞 、烏鴉 004 臺(tái)灣 雞 004 泰國 雞 、鴨、火雞、鵝、駝鳥、孔雀