【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）紫莖澤蘭EaCBF1基因的克隆及其在不同地理種群的遺傳差異分析生物安全碩士論文

I 密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 紫莖澤蘭 理種群的遺傳差異分析 要 紫莖澤蘭是我國為害最嚴(yán)重的惡性外來入侵雜草之一，原產(chǎn)于墨西哥至哥斯達黎加一帶，后作為觀賞植物引入歐洲，目前已廣泛分布于世界 30 多個國家和地區(qū)。該草于 20 世紀(jì) 40 年代經(jīng)緬甸傳入我國，短短幾十年間已經(jīng) 遍布我國西南地區(qū) 6 個省市，并以每年幾十公里的速度向我國北方地區(qū)擴散。 植物在長期進化中普遍形成了可誘導(dǎo)激活的抗逆境潛能。植物響應(yīng)低溫逆境形成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并受多種調(diào)控基因和功能基因的控制，這種信號互作關(guān)系在先前的研究中已經(jīng)得到證實。紫莖澤蘭作為一種熱帶亞熱帶植物有逐步向溫帶蔓延的趨勢，必然有其特殊的抗寒機制，這很可能與調(diào)控因子的控制有關(guān)。在擬南芥、番茄、棉花等多種植物中發(fā)現(xiàn)的 錄因子是植物應(yīng)答低溫逆境的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，一直倍受重視。在綜述了紫莖澤蘭入侵機制及國內(nèi)外關(guān)于低溫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子 究進 展的基礎(chǔ)上，本文從紫莖澤蘭低溫調(diào)控因子 克隆入手，進行了了紫莖澤蘭 列分析比對、誘導(dǎo)表達分析、種群間遺傳差異及遺傳轉(zhuǎn)化等一系列研究，為從分子層面上解釋紫莖澤蘭低溫適應(yīng)性機制奠定了基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下： 1通過分析擬南芥、番茄等植物的 基酸核心區(qū)設(shè)計簡并引物，以 模板，獲得了 4 個同源性在 70以上的核心區(qū)片段。根據(jù)已知片段設(shè)計特異引物，運用 術(shù)從低溫誘導(dǎo)下的紫莖澤蘭 獲得一個全長 800 因，定名為 物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼一個由 219 個氨基 酸組成的蛋白，預(yù)測分子量為 蛋白具有 7 個非連續(xù)氨基酸構(gòu)成的核定位信號， 60 個氨基酸組成的保守 合域，以及一個 3的酸性轉(zhuǎn)錄激活域。不同植物 因比對顯示， 蘋果 因親緣關(guān)系最近其次是番茄，和葡萄的 遠(yuǎn)。 2由于 因家族成員間同源性高且多半為單拷貝基因，我們以 探針通過交確定了紫莖澤蘭基因組內(nèi)至少有 4 個 族成員，與核心區(qū)克隆測序結(jié)果一致。 3運用半定量 術(shù)分析了 不同逆境脅迫下的表達水平 。結(jié)果顯示，低溫下表達量最高，其次是干旱和外源 高鹽脅迫也會誘導(dǎo)該基因的微弱表達。表明各種逆境信號間有串話現(xiàn)象。為了進一步研究 功能，我們構(gòu)建了一個含有動子的組成型植物表達載體 ,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將該基因轉(zhuǎn)化到煙草中，已獲得了轉(zhuǎn)基因植株，生理生化檢測正在進行中。 4應(yīng)用等位基因 術(shù)檢測了 15 個地理種群 碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性。通過測序比對發(fā)現(xiàn)，目前我國西南幾個受紫莖澤蘭危害較大的省市所采集的植物樣本的 核苷酸水平上有 11 個堿基的 差異，而由于密碼子的簡并性，其氨基酸水平上有 3 處差異。這些結(jié)果表明該基因的核苷酸序列已經(jīng)形成一定程度的遺傳分化，主要表現(xiàn)在云南、四川及貴州種群相對于重慶和廣西百色種群具有更高的多態(tài)性。從整體趨勢看云南種群與四川和貴州種群親緣關(guān)系近，與重慶和廣西種群相對較遠(yuǎn)。 本研究以 溫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子為對象從溫度這個限制物種分布的關(guān)鍵環(huán)境因子入手，分析并推測了紫莖澤蘭在逆境適應(yīng)性方面的分子機制。這些研究對闡明紫莖澤蘭的入侵?jǐn)U張機理，預(yù)測適生范圍具有重要的理論價值和現(xiàn)實意義。 關(guān)鍵詞： 紫莖澤蘭 外來入侵植物 轉(zhuǎn)錄因子 遺傳差異 is of It is as an in 9th it be in 0 940s, it to a to a It is a in is by of in a of to is of as BF a in on of of in is is as to BF of 0% A BF a 24a as a a NA an as a in of of at BF in of in to It by BA on It A to is in by CR to 5 to of 1 in 80of on of It IV of 5 in We as of In we on of us to of V 目 錄 第一章 前言 . 1 來生物入侵機制研究進展 . 1 外來生物入侵機制的探詢：從宏觀到微觀 . 1 侵生物抗逆適應(yīng)機制的研究現(xiàn)狀 . 2 莖澤蘭入侵機制 . 3 錄因子 植物抗寒適應(yīng)性研究中的重要意義 . 4 物低溫脅迫應(yīng)答基因 . 4 用元件的發(fā)現(xiàn)以及 碼基因的克隆 . 4 控途徑及其在植物低溫馴化中的作用 . 5 種環(huán)境脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的串話現(xiàn)象 . 6 研究的目的與意義 . 7 術(shù)路線 . 8 第二章 低溫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子的克隆 . 9 試材料 . 9 物材料 . 9 要試劑和耗材 . 10 株與質(zhì)粒 . 10 要儀器設(shè)備 . 10 法 . 10 提取紫莖澤蘭基因組 量） . 10 計簡并引物 得 心區(qū) . 11 物的純化 . 11 接 . 11 化測序 . 11 理 . 12 取 . 12 端 . 13 端 . 13 因全長的拼接和測通 . 16 果與分析 . 16 莖澤蘭 因核心區(qū)克隆 . 16 莖澤蘭 因核心區(qū)序列分析 . 17 段 全長克隆 . 19 論 . 21 第三章 紫莖澤蘭家族成員數(shù)檢測 . 22 料 . 22 驗材料 . 22 要試劑和耗材 . 22 要儀器設(shè)備 . 22 法 . 22 提紫莖澤蘭基因組 量） . 22 切、電泳： . 23 印跡轉(zhuǎn)移 . 23 雜交 . 24 針 放射性標(biāo)記 . 24 交 . 24 膜 . 25 影原理： . 25 果與分析 . 25 論 . 26 第四章 紫莖澤蘭 達及功能分析 . 27 料 . 27 試材料 . 27 試菌株和植物 . 28 器設(shè)備 . 28 法 . 28 參基因 克隆 . 28 板定量 . 28 組載體的構(gòu)建 . 28 物表達載體的構(gòu)建 . 29 擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 . 30 法轉(zhuǎn)化野生型煙草 . 30 果與分析 . 31 同環(huán)境脅迫對 達量的影響 . 31 達載體的構(gòu)建 . 32 物表達載體的鑒定 . 34 組載體的遺傳轉(zhuǎn)化 . 34 基因植株的篩選及生理檢測 . 35 論 . 35 第五章 不同地理種群單核苷酸多態(tài)性分析 . 37 料與方法 . 37 品采集信息 . 37 位基因單核苷酸多態(tài)性的獲得 . 38 果與分析 . 38 論 . 40 第六章 結(jié)論與展望 . 42 論 . 42 研究的創(chuàng)新點 . 42 望 . 43 參考文獻 . 44 附錄 . 51 1 培養(yǎng)基配方 . 51 2 緩沖液 . 52 3 交所 用試劑 . 52 致謝 . 55 個人簡介 . 56 略 詞 表 縮寫 英文全稱 中文名 落酸 旱應(yīng)答元件 溫應(yīng)答元件結(jié)合蛋白 嘧啶重復(fù)序列結(jié)合元件 嘧啶重復(fù)序列結(jié)合蛋白 胎晚期豐富蛋白 導(dǎo)物 透應(yīng)答高表達基因 溫應(yīng)答基因 ,4,5磷酸肌醇 分裂原活化蛋白激酶 依賴型蛋白激酶 端快速擴增法 表 目 錄 圖 1溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控機制 6 圖 1 起的信號串話原理 6 圖 1有 式元件的 逆境響應(yīng)基因的激活途徑 7 圖 2莖澤蘭叢生芽組培苗 9 圖 2-2 端快速擴增法原理圖 12 圖 2莖澤蘭基因組 取效果圖 17 圖 2同方法下紫莖澤蘭總 提取效果圖 17 圖 2并引物 物電泳檢測 17 圖 2擬南芥和番茄 心區(qū)相似性比較分析結(jié)果 18 圖 2心區(qū)翻譯產(chǎn)物的比較 18 圖 2 個紫莖澤蘭 族成員核心區(qū)多肽同源關(guān)系樹 19 圖 2因特異引物 物電泳檢測 19 圖 2莖澤蘭 整氨基酸序列 19 圖 2其它植物 系統(tǒng)遺傳樹 20 圖 3針回收結(jié)果 25 圖 3:紫莖澤蘭總 切結(jié) 果； B:紫莖澤蘭 交檢測紫莖澤蘭 族成員數(shù) 26 圖 4同環(huán)境脅迫下 達差異 32 圖 4物表達載體的構(gòu)建 32 圖 4 切的 物表達載體 33 圖 4建好的 物表達載體的鑒定 33 圖 4 切的 序載體 34 圖 4組載體 酶切鑒定結(jié)果 34 圖 4草遺傳轉(zhuǎn)化 35 圖 55 個紫莖澤蘭地理種群采樣點分布圖 38 圖 55 個不同地理種群擴增產(chǎn)物電泳檢測 39 圖 5:廣西南寧種群 序圖 B:云南大理種群 序圖 39 表 2莖澤蘭、擬南 芥和番茄 心區(qū)同源性分析 19 表 4驗處理 27 表 5莖澤蘭采樣地點及相關(guān)地理信息 37 表 55 個不同地理種群 源性矩陣 41 X 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 前言 1 第一章 前言 來生物入侵機制研究進展 外來生物入侵機制的探詢：從宏觀到微觀 隨著經(jīng)濟全球化，貿(mào)易自由化的進一步延伸，與人類生存戚棲相關(guān)的生物和環(huán)境受到了前所未有的巨大威脅。生物多樣性保護和生態(tài)安全逐漸成為當(dāng)今國際社會關(guān)注的焦點，而外來入侵生物所造成的生物安全問題也已經(jīng)成為各國國家安全的重要組成部分（萬方浩等， 2005）。有別于物種的引進與交流，生物入侵是指生物由原生存地經(jīng)自然的或人為的途徑侵入到另一個新環(huán)境，并對入侵地的生物多樣性、農(nóng)林牧漁業(yè)生產(chǎn)或人類健康造成經(jīng)濟損失或生態(tài)災(zāi)難的過程。每年由于外 來入侵生物造成的經(jīng)濟損失觸目驚心。據(jù)不完全調(diào)查顯示，美國每年直接或間接用于主要