【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）祁連山地區(qū)修長高原鰍譜系地理學(xué)研究

蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 祁連山地區(qū)修長高原鰍譜系地理學(xué)研究 1 第一章 前言 物地理學(xué)與隔離分化 生物地理學(xué)是研究生物的分布及其規(guī)律的科學(xué) ,研究領(lǐng)域涉及物種的起源、擴(kuò)散、分化和 分布 ,與生態(tài)學(xué)、 地理學(xué)、古生物學(xué)、 進(jìn)化 學(xué) 、分類 學(xué) 和分子系統(tǒng)學(xué)密切相關(guān) ， 是一門交叉學(xué)科 （陳領(lǐng) 2005）。 現(xiàn)今分布在地球表面的大大小小的生物，其分布格局和種群大小等并不是隨機(jī)的，那么，它們是如何起源的？為何會分布在現(xiàn)有的區(qū)域中 ？其種群大小和格局與其分布環(huán)境和歷史環(huán)境變化有什么樣的關(guān)系？伴隨著這些問題，生物地理學(xué)應(yīng)運而生 （ 010)。 1761年， 從歷史發(fā)展過程來看，生物地理學(xué)分為 3個主要的時期，即古典時期、華萊士期和現(xiàn)代期。第一個階段也被成為前達(dá)爾文時期，主要是指林奈（ 范 洪堡 (生物物種和分布區(qū)系的早期基本描述， 形成了一些感性的初步認(rèn)識， 提出了一些基本的動植物知識和概念。 第二個階段也被稱為達(dá)爾文時期，達(dá)爾文的擴(kuò)散學(xué)說和隔離分化思想占據(jù)了主導(dǎo)地位，在古典時期思想的引導(dǎo)下，這一時期的科學(xué)家對生物物種分化等問題進(jìn)行了更加 深入的探索，正式形成了生物地理學(xué)的概念。第三階段就是 1960年以來的現(xiàn)代生物學(xué)時期，由于板塊漂移學(xué)說 的復(fù)興，人們對生物演化、隔離分化又有了新的認(rèn)識，一些舊的觀點遭到懷疑，新的理論得到認(rèn)可，使得生物地理學(xué)能夠很快的發(fā)展。從另一角度來說，生物地理學(xué)又可被分為生態(tài)生物地理學(xué)和歷史生物地理學(xué)。前者是指生物分布環(huán)境中的生態(tài)因素對生物分布模式的影響，如溫度的變化，水分的多少，海拔的高低等等；后者 主要是指過去和現(xiàn)在大規(guī)模的歷史事件和環(huán)境格局變化與生物種群分布模式的關(guān)系，如地質(zhì)變化山脈的隆升和大尺度的氣候變化等 （ 2007） 。 另外， 根據(jù)研究對象和范圍的不同， 生 物地理學(xué)還可以劃分為 植物生物地理學(xué)、動物生物地理學(xué) 、 海洋生物地理學(xué)、島嶼生物地理學(xué)等分支。 在我國來說，生物地理學(xué)依然是個比較新興和年輕的學(xué)科，從研究對象來說，植物生物地理學(xué)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于動物生物地理學(xué)，總體研究力度比較小，因此，在此方面相對空白領(lǐng)域的研究尤為有意義和價值 （ 周志炎 1997） 。 伴隨著板塊漂移學(xué)說的興起，激烈的探討和探索開始展開，生物地理學(xué)中隔離分化的理論和思想站穩(wěn)了腳跟，傳統(tǒng)的物種起源中心學(xué)說和擴(kuò)散理論 受到質(zhì)疑。隔離分化是指，基于生物本身 的基因進(jìn)化，在地質(zhì)歷史事件的影響下，地球蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 祁連山地區(qū)修長高原鰍譜系地理學(xué)研究 2 上的生物分布形成了一定的模式格局 （ 010)。隔離分化并不否定擴(kuò)散學(xué)說和起源中心學(xué)說，他們承認(rèn)生物種群的擴(kuò)散的存在現(xiàn)實性 （ 陳領(lǐng) 2005） 。相比較擴(kuò)散學(xué)說只是適用于解釋單一特定生物種群的分布格局來說，隔離分化 學(xué)說試圖通過分析多個類群的分布規(guī)律來找到此生物分布模式下共同的關(guān)系和特征。隨著研究的不斷深入，它已經(jīng)形成了一套相對成熟完整的工作方法，首先，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，對生物種群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育的分析，根據(jù)其不同區(qū)系不同分布環(huán)境的特點和親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近， 確定進(jìn)化位置 （ W. 1981） 。然后，將系統(tǒng)發(fā)生結(jié)果的不同分支 用相對應(yīng)的生存環(huán)境資料替換，產(chǎn)生出一個地區(qū)分支圖。最后。通過疊加多個生物類群的地區(qū)分支圖進(jìn)行整合分析，得到它們共同的進(jìn)化規(guī)律和分布特征，即產(chǎn)生一個隔離分化事件。 在生物地理學(xué)的研究領(lǐng)域中，隔離分化思想得以脫穎而出最主要的優(yōu)勢就是擺脫了之前擴(kuò)散學(xué)說的不確定性和不可重復(fù)性，它的可檢驗性使其更加嚴(yán)密，更加具有說服力 （ 2008） 。在近年來，由于相關(guān)新穎技術(shù)的進(jìn)步和改進(jìn)，這方面的工作已經(jīng)得到了很大的進(jìn)展，但是由于隔離分化需要多 個生物類群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育的構(gòu)建，相關(guān)研究人員對此類工作的探討還相當(dāng)有限，空白領(lǐng)域依然很多，因此，依然需要不停地探索和改進(jìn)。 系地理學(xué)和第四紀(jì)冰期綜述 譜系地理學(xué) （ 生物地理學(xué)的一門分支學(xué)科。 1987 年， 一次提出“ 個概念，我們把它翻譯成親緣地理學(xué)或者系統(tǒng) 發(fā)生地理學(xué)等，它 作為一個新的學(xué)科將系統(tǒng)分類學(xué)和種群遺傳學(xué)緊密的聯(lián)系了起來。 主要研究世系分支上的物種，尤其是親緣關(guān)系很近的物種的地理分布格局和演化過程 ，是對生物親緣世系在空間尺度 和時間尺度的變化的探討 （ 1988） 。 通過重建系統(tǒng)發(fā)生的譜系結(jié)構(gòu)，分析相關(guān)歷史地質(zhì)事件與種群遺傳結(jié)構(gòu)的關(guān)系，從而探討現(xiàn)有種群分布結(jié)構(gòu)的起源演化歷史和進(jìn)化過程。 在譜系地理學(xué)中，隔離分化和擴(kuò)散學(xué)說作為兩派相對立的假說來解釋產(chǎn)生地理隔離的種群的起源。 結(jié)合相關(guān)化石資料記錄證據(jù)，利用種群內(nèi)不同單倍型的系統(tǒng)發(fā)育分析，可推算出世系分支時間，種群在歷史上發(fā)過的擴(kuò)張和遷移等重要的事件。 歸納之前的研究成果，將 當(dāng)前生物種群的分布格局分為了五大類型： 1、系統(tǒng)大分支異域化，高度遺傳分化。就是說，在構(gòu)建 的系統(tǒng)分化樹中，主要的分支結(jié)構(gòu)都是分布在不同區(qū)域的種群，并且不同地理分布的單倍型發(fā)生了很大的遺傳分化，這是較長時間的地理隔離導(dǎo)致的結(jié)果。 2、系統(tǒng)大分支同域化，高度遺傳分化。即分布在同一大范圍區(qū)域的生物種群具有很大的遺傳分化 ，主要是由于在此地理分蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 祁連山地區(qū)修長高原鰍譜系地理學(xué)研究 3 布地區(qū)有著很大的祖先種群個體數(shù)，由于某些原因，一些近緣譜系的種群遭到滅絕，從而使其他的分支存活了下來，產(chǎn)生了很大的分化結(jié)果。 3、系統(tǒng)大分支異域化，低度遺傳分化。譜系結(jié)構(gòu)中所有分支的單倍型都具有很近的親緣關(guān)系，這是由于種群之間基因流很低，促進(jìn)了遺傳分化的產(chǎn)生。 4、系統(tǒng)大 分支同域化，低度遺傳分化 （ 1997)。此類地理模式就是說，小分支同區(qū)域內(nèi)的 分化程度小于大分支地理區(qū)之間的分化程度。一般發(fā)生在一些生活史規(guī)律的物種譜系結(jié)構(gòu)中，由于洄游等一些特定的生理特征導(dǎo)致遺傳分化很低。 5、系統(tǒng)大分支多樣化，低度遺傳分化。即樹狀結(jié)構(gòu)中大分支分布在不同的地理區(qū)域中，且每個大分支中，細(xì)微的分支結(jié)構(gòu)都有其特定的支系結(jié)構(gòu) 。這種模式一般是由于此類種群分布區(qū)域相對復(fù)雜，在歷史上有過高頻率的基因流 （ C. 2008） 。 譜系地理學(xué)得以出現(xiàn)并日漸受到研究人員的 青睞 主要是 基于 一定的基礎(chǔ)之上，首先，溯祖理論分析群體遺傳學(xué)是譜系地理學(xué)中最為成功的基礎(chǔ)概念并將受到越來越多的重視 （ 2005） 。其次，各類分子遺傳標(biāo)記的大量使用在系統(tǒng)發(fā)育的研究中，得到的系統(tǒng)分支結(jié)果 具有顯著的地理分布格局。最后，分子生物技術(shù)的普及，主要是 擴(kuò)增序列測定技術(shù)也為譜系地理學(xué)的析提供了便捷和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目萍际侄?。相比較歐美國家，我國的譜系地理學(xué)發(fā)展起步較晚，但是，近幾年來，國內(nèi)的動植物譜系地理學(xué)相關(guān)研究得到了迅猛發(fā)展，如柏科植物的 在世界范圍的譜系地理學(xué)分析，取得了很顯著的成績并得到了國際的重 視，還有青藏高原區(qū)域的動植物尤其是植物的譜系地理學(xué)研究也得到了深入。 關(guān)于第四紀(jì)冰期的研究近年來成為一個新的熱點，尤其是青藏高原地區(qū)在冰期作用影響下氣候的劇變，水量的 增減，對此區(qū)域的生物譜系地理結(jié)構(gòu)有著深層次的影響。 第四紀(jì)冰期 發(fā)生在最近的 3百萬年內(nèi)， 在此過程中，冰川的擴(kuò)張（冰期 致一部分生物種群滅絕，一部分種群退縮到適宜生存的區(qū)域即避難所 （張榮祖 2004） 。當(dāng)氣候變暖氣溫回升時，冰川消融，一部分生物種群就會回遷或擴(kuò)張到其他新的適宜的生存環(huán)境中 。在冰期與間冰期的反復(fù)更替和變化影響 下，生物類群經(jīng)過了遷移，擴(kuò)張，再遷移，再擴(kuò)張的過程，結(jié)果一些種群形成了一些特有的 分布模式和遺傳格局。當(dāng)然這些并不是憑空的猜測，在歐洲和北美的相關(guān)孢粉化石中得到了證據(jù) 。在本研究中，樣品采集地點集中于祁連山脈地區(qū)，祁連山第四紀(jì)冰期中，山體隆升和氣候變化，祁連山地區(qū)發(fā)生了兩次大規(guī)模的冰期，當(dāng)時冰川覆蓋范圍比較大，冰融時期，大量融水匯集到山底平原，如此反反復(fù)復(fù) 使得 祁連山區(qū)域 生物形成特定的分布格局。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 祁連山地區(qū)修長高原鰍譜系地理學(xué)研究 4 連山地質(zhì)歷史 及冰期影響 祁連山山脈位于青藏高原東北邊緣， 在河西走廊地區(qū)又被稱作南山，無論是它孕育的冰 山積雪、草原 牧場還是沙漠戈壁，都是大自然的資源寶庫。對祁連山的地質(zhì)歷史研究和冰期氣候影響的考察 著手 相對比較晚 ， 1946 年第一次開始討論祁連山地區(qū)關(guān)于古冰川的問題?，F(xiàn)代的祁連山溝壑起伏，分布范圍很廣，祁連山山 系分布著大大小小數(shù)條西北至東南走向的平行山峰和寬窄不同的谷地 。山峰 海拔 高度大多在 40005000 米 左右 ， 最高點團(tuán)結(jié)峰海拔 5808 米，四千米以上的高山終年積雪，由于整個祁連山脈是處于青藏高原這樣一個大環(huán)境中，因此，即使是山峰間的谷地，海拔也在 3000 米以上 （ 1981） 。祁連山脈水系分 布呈網(wǎng)狀中心發(fā)散的模式， 包含河西走廊三大內(nèi)陸河水系，黃河支流和達(dá)木盆地內(nèi)流水系，這些河流大多發(fā)源于祁連山冰川，主要水量靠冰川雪水融化供給。因此水量變化年變化較小，受氣候溫度季節(jié)變化很大。 關(guān)于祁連山脈 確定的地質(zhì)年齡，科學(xué)們展開了深入的研究，主要是從巖石地貌，冰川沉積等方面提供了大量的證據(jù)。根據(jù)考察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，祁連山山脈 在地質(zhì)歷史上依 然是一個相對 比較年輕的山脈，追溯它確切的構(gòu)造歷史， 直到現(xiàn)在總共發(fā)生了兩次大規(guī)模的地質(zhì)構(gòu)造活動 （李吉均 1063） 。第一次發(fā)生在 上新世時期，此地區(qū)開始了顯著大規(guī)模的抬升， 也是至此開始 進(jìn)入了一個新的地質(zhì)時期，此前的平原過程結(jié)束，展開了現(xiàn)在依然在進(jìn)行沒有停止的高山隆升過程。第二次發(fā)生在第四紀(jì)初期的一次強(qiáng)烈的隆升，此次的地殼抬升是波及整個祁連山脈的，造就了整個此地區(qū)的成片的 高山分布。由此可以得出，現(xiàn)在祁連山地區(qū)的水系分布格局是由第二次的抬升運動造就的結(jié)果。不能否認(rèn)的是，除了以上兩次大規(guī)模的地殼運動以外，中間摻雜著很多次小范圍小規(guī)模的抬升等運動。地殼的抬升、山脈的多次隆升在河流的河床，山谷間出口上留下了很明顯的歷史痕跡和證據(jù)（ S. 2000） 。但是，顯而易見，小的河流和小 的抬升運動 留下的痕跡相對不明顯，而大的河流甚至于洪水在大的運動中留下了很明顯的痕跡，這種現(xiàn)象在階地中表現(xiàn)的很明顯。 對于祁連山脈地區(qū)古冰川問題的研究和探討，前輩學(xué)者們將此地區(qū)冰期劃分為四次， 更有學(xué)者認(rèn)為， 整個山脈的北坡曾經(jīng)發(fā)生過兩次冰期，第一次相對規(guī)模很大，在不到 3000 米的山峰都有冰川痕跡影響，而第二次的冰期相對很小，只分布在海拔較高的高山地帶 （李吉均 1063） 。對于高原山地地區(qū)來說，多雨期即導(dǎo)致水量的增加， 冰川的擴(kuò)大，即冰期的到來，隨后干燥溫暖的氣候使得雨量減少，山間冰川融化，即間冰期的到來，但同時這 種溫暖的氣流又會導(dǎo)致新的一輪的多雨期的到來，這樣反反復(fù)復(fù)的冰期與間冰期的變化，對當(dāng)?shù)氐暮恿髯兓?，生蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 祁連山地區(qū)修長高原鰍譜系地理學(xué)研究 5 物種群變化等造成了很大的不可忽略的影響。因此，我們選擇此區(qū)域作為實驗的樣品采集范圍，同時選擇修長高原鰍這樣一種分布范圍相對廣泛并且與河流相依存的生物體作為研究對象，得到了與預(yù)期基本一致的結(jié)果。 藏高原動物譜系地理學(xué)研究進(jìn)展 新生代印度和亞洲板塊的撞擊事件可以說是目前地球上最大和最積極的造山運動，在亞洲由此引發(fā)了一系列重要的地質(zhì)地殼運動和氣候變化，重新塑造著新生代的亞洲大陸板塊，如青藏高原的抬升、東南亞地 區(qū)（主要為馬來半島）的側(cè)向逃逸、以及亞洲季風(fēng)氣候的盛行等，對于這樣一個全球一級板塊區(qū)域，和地質(zhì)學(xué)家一樣，生物學(xué)家也有著濃厚的研究興趣 。 喜馬拉雅地區(qū)、中國西部山脈、緬甸 化的天然實驗室 （李吉均 1063） 。 在漸新世后期， 隨著中國西部地形的抬升，包括現(xiàn)在的喜馬拉雅山，青藏高原和它們的周圍區(qū)域，成為中國西部典型的地貌特征。相關(guān)的地質(zhì)學(xué)事件的發(fā)生引發(fā)了氣候的改變，并且隨后導(dǎo)致了亞洲生物的重組。 青藏高原作為“ 世界屋脊 ” 和“第三極”，是最大最年輕的高 原，生物多樣性非常豐富，是研究生物資源的“寶庫”， 選擇此區(qū)域生物做譜系地理學(xué)研究，可以 讓我們 對青藏高原地區(qū)生物模式更加了解，對這一地區(qū)生物種群在第四紀(jì)冰期的環(huán)境變化中受到的影響有更深的認(rèn)識。 青藏高原 物種多樣性很高，造成現(xiàn)有生物種群類型異常豐富的原因首先是 在第四紀(jì)冰期氣候劇烈變化的情況下，山脈隆升，河流凍結(jié)，使得生境片斷化，大量生物種群退縮到或滅絕，當(dāng)環(huán)境恢復(fù)適應(yīng)，生物重新擴(kuò)散演化。其次就是此地區(qū)復(fù)雜的地理環(huán)境為 物種的退縮提供了避難所，當(dāng)間冰期來臨時，又成為新的擴(kuò)散輻射中心。 目前來說，青藏高原地區(qū)譜系地理學(xué) 相對來說還比較少，動物方面的研究更是少于植物，但是已經(jīng)有了一定的進(jìn)展 。植物方面如青海云杉、 祁連圓柏、 馬先蒿、麻黃 、 露蕊烏頭 等譜系地理學(xué)方面的研究 表明第四紀(jì)冰期劇烈的氣候變化對這些植物種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了很重要的影響 ，更新世以來，橫斷山區(qū)和青藏高原的隆升對這些植物的遺傳結(jié)構(gòu)和種群分化產(chǎn)生了不可磨滅的影響。相對于植物來說，動物方面此地區(qū)的研究顯得有些少，目前只有棘蛙族、裸鯉等少量物種的系統(tǒng)發(fā)生結(jié)構(gòu)得到了研究。前輩學(xué)者對橫斷山區(qū)的魚類 譜系結(jié)構(gòu) 以及云貴高原的魚類 系統(tǒng)分化 等做出了 越來越多的深入探索 （ 011） 。 綜上所述，青藏高原地區(qū)譜系地理學(xué)研究仍然需要更深一步的探索 ，一些分子進(jìn)化方面的問題，如基因流和種群遷移率、世系分化的估算問題、全球遺傳多樣性的重要區(qū)域和重要意義等等一系列的問題，都需要我們不停地探索。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 祁連山地區(qū)修長高原鰍譜系地理學(xué)研究 6 研究所采用的分子標(biāo)記 分子標(biāo)記的產(chǎn)生，解決了以前生態(tài)學(xué)研究中其他方法難以處理的問題。 分子標(biāo)記是生物基因組的一小段片段，選取的標(biāo)準(zhǔn)是 容易被識別的等位基因及相關(guān)序列，并且 期望可以代表整段 其他延伸部分。 現(xiàn)在以來最為常見的分子標(biāo)記有： 衛(wèi)星、 位酶及 。 其主要優(yōu) 點就是分子標(biāo)記可以比其他原始的生態(tài)學(xué)測量更加精確和有說服力。 共顯性的分子標(biāo)記在物種種群研究中是最為有效的 ，因為其高度的多態(tài)性并且非常易于結(jié)果的統(tǒng)計計算，但也有一定的缺點。事實上，不經(jīng)過重組的 應(yīng)用范圍上是非常有限的，但是最重要的一點，這些母系遺傳或者父系遺傳的分子標(biāo)記可以很有效的表達(dá)出種群中性別的差異信息。以溯祖理論為基礎(chǔ)的最大似然法可以得到更加豐富的信息，使得種群遺傳的研究可以更近一步。 上個世紀(jì)學(xué)者們用分子的方法第一次來解決進(jìn)化問題，當(dāng)時物種之間復(fù)雜的化學(xué)分子分界被用來確定種群的分界 線 （ 004） 。迄今為止， 現(xiàn)代的生態(tài)學(xué)學(xué)科分子標(biāo)記 包括了很多新的方向。雖然不斷出現(xiàn)的新的分子標(biāo)記和分子技術(shù)在一定的方面會取代舊的標(biāo)記和技術(shù)，但是沒有一個分子標(biāo)記是完全是用于任何物種的。因此，分子標(biāo)記的時代不會結(jié)束還會繼續(xù)發(fā)揮很重要的作用。 在 譜系 地理學(xué) 研究 中， 各類分子標(biāo)記被廣泛的應(yīng)用。動物的線粒體 仍然被應(yīng)用于親緣地理學(xué)中。 般是母系遺傳的，在 生殖遺傳中不經(jīng)歷明顯的重組，且線粒體 散的存在于細(xì)胞內(nèi)，在分離純化的時候比較容易 （ 1997） 。即使其優(yōu)勢地位被近年來新出現(xiàn)的微衛(wèi)星標(biāo)記等一部分取代有一定的下降，但大部分的學(xué)者依然選擇運用 行相關(guān)的研究。線粒體 為分子標(biāo)記 在動物種群 譜系地理學(xué)研究中具有以下幾大優(yōu)點： 1、現(xiàn)在 需要的一些通用引物不需要將基因組總 行 列 （ 2001） 。 2、在大多數(shù)的物種個體組織中有很多的線粒體 貝，我們可以相對很容易的得到目的片段的大量擴(kuò)增。 3、線粒體 對于核基因來說有較高的突變率，因此我們可以通過譜系地理的分析得到 較高的遺傳分化。 4、種群核苷酸多態(tài)性是中性的。 5、因為線粒體 有效種群數(shù)大小是二倍體物種核基因的 1/4，因此， 單種群會在相對短的時間里發(fā)生遺傳分化。 6、動物線粒體 分子水平上沒有經(jīng)過重組，因此，每一個單倍型只有一個祖先倍型。 綜合上邊所說，我們選擇了修長高原鰍線粒體 個片段 為分子標(biāo)記，對祁連山地區(qū)的此物種譜系地理學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 祁連山地區(qū)修長高原鰍譜系地理學(xué)研究 7 原鰍屬簡介及研究背景 高原鰍屬 是目前適宜分布海拔最高的物種之一， 主要分布在青藏高原及其毗鄰 地區(qū)，但往南不超過喜馬拉雅山，在北京永定河也有發(fā)現(xiàn) （ W. 1981） 。 目前在我國分布有 70多個種，并且不斷有新的物種被發(fā)現(xiàn)。屬于高原冷水魚，主要分布在高海拔冷水環(huán)境中，是青藏高原魚類區(qū)系一個很重要的類群。最初，將高原鰍類群分為高原鰍屬和赫氏鰍屬，后來朱松泉教授將這兩個屬又合并成一個屬，成為高原鰍屬，把之前兩個屬設(shè)置成相應(yīng)的亞屬。 高原鰍 屬魚類身體延長，前驅(qū)呈近圓筒形，后驅(qū)漸側(cè)扁或者靠近尾鰭處側(cè)扁，頭部稍微扁平前后鼻孔鄰近，前鼻孔位于鼻瓣膜之中，有三對須，一對內(nèi)吻須，一對外吻須和一對頜須 （ 2000） 。上頷正常，下頷呈匙狀或者 鏟狀，大多數(shù)物種身體表面裸露無鱗（除少數(shù)幾種身體被有小鱗片），體色花紋變化豐富，一般呈灰色或黑色，規(guī)律排布的斑狀條紋。鰾的前室由左右兩個側(cè)室組成，鰾的后室發(fā)達(dá)或者退化，鰾的形狀和發(fā)育程度因種類的不同而不同。胃呈“ U”型，腸的長短和環(huán)繞方式也因種類不同而不同。 屬內(nèi)每個物種雄性吻部兩側(cè)和胸鰭背面有小刺突區(qū)域 （ 2004） 。目前對高原鰍屬的研究大部分集中于形態(tài)學(xué)、生活習(xí)性的描述以及新種的發(fā)現(xiàn)，譜系地理學(xué)比較系統(tǒng)的研究幾乎沒有，因此，對高原鰍親緣地理學(xué) 的研究對了解此區(qū)域分布模式和環(huán)境對物種分布的影響 有很重要的意義。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 祁連山地區(qū)修長高原鰍譜系地理學(xué)研究 8 第二章 實驗材料及研究方法 言 青藏高原及其邊緣地區(qū)一直被譽為“天然實驗室”，本實驗選擇的研究對象修長高原鰍具有此地區(qū)地理分布范圍廣泛，海拔分布跨度大等天然優(yōu)點。祁連山脈位于青藏高原東北邊緣地區(qū)， 在地質(zhì)運動中，原為古生代的大地槽，后來經(jīng)過加里東運動和華力西運動，形成了褶皺帶，白堊紀(jì)以來，祁連山主要處于斷塊的升降運動中，直到最后形成一系列的平行地壘（或山嶺）和地塹（或谷地和盆地）。關(guān)于祁連山脈地區(qū)古冰川的探討， 一般認(rèn)為 北坡有兩次，第一次規(guī)模很大，第二次僅分布在高山地帶 （ Y. 1991） 。祁連山脈水系呈輻射狀分布，中心區(qū)域位于北大河 和布哈河源頭，由此毛毛山一帶沿大通山至青海南山成為內(nèi)外流域的分界線，東南方向是黃河支流的莊浪河和大通河等外流水系 （ L. 1992） 。西北方向是河西走廊內(nèi)流水系石羊河水系、黑河水系和疏勒河水系。南側(cè)是柴達(dá)木內(nèi)流水系的魚卡河、塔塔棱河、托來河等。 修長高原鰍（ 于高原鰍亞屬的一個種，分布廣泛，局部有少量的捕撈。 于 長江、 黃河上游、西藏北部、柴達(dá)木盆地、青海湖以及河西走廊等地都有采集。 根據(jù)野外觀察和相對有限的文獻(xiàn)支持，高原鰍對于生活環(huán)境的要求比較高，水溫、渾濁度、水質(zhì)、流速等都是影響因素，所以，它的分布范圍和種群的擴(kuò)散速度也會因此變得緩慢。 體色淺黃或者黃色，背鰭前后各有47 條褐色橫狀條紋。 身體延長，前驅(qū)近似于圓筒形，后驅(qū)低而寬，尾柄高度向尾鰭方向基本不 減 。 尾柄長是尾柄高的 ， 頭部稍微平扁，吻部尖，口下位。唇偏厚，上唇邊緣多為 短的 乳頭狀突起 ，流蘇形狀，下唇表面多為褶皺或乳頭狀突起，下頷匙狀，不外露，須中等 長度， 前后兩鼻孔緊緊相鄰，前鼻孔呈瓣狀。 身體表面無鱗，側(cè)線完全 （ 1992） 。 背鰭分枝鰭條為七根， 腹鰭基部起點相對于背鰭基部起點或者第一根或者第二根鰭條根部 ， 腹鰭尾端伸及肛門 。鰾后室基本退化，腸短，胃呈“ U”形。本種 一般棲息在流速湍急的河段，于河道等開始解凍即開始 產(chǎn)卵 繁殖，且主要以昆蟲幼蟲等為食。 根據(jù)野外觀察和相對 有限的文獻(xiàn)支持，高原鰍對于生活環(huán)境的要求比較高，水溫、渾濁度、水質(zhì)、流速等，所以，它的分布范圍和種群的擴(kuò)散速度也會因此變得緩慢。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 祁連山地區(qū)修長高原鰍譜系地理學(xué)研究 9 料和方法 品采集 及形態(tài)學(xué)鑒 定 本研究選取 祁連山水系 及附近 范圍內(nèi)進(jìn)行樣品采集， 樣點 分布范圍包括祁連山北側(cè)河西走廊區(qū)域、祁連山南側(cè)柴達(dá)木盆地自流 水系、祁連山西側(cè)肅北地區(qū)及祁連山東側(cè)石羊河流域地區(qū)，總共 16 個樣點， 216 個樣品 。 本實驗選擇的研究對象修長高原鰍具有此地區(qū)地理分布范圍廣泛，海拔分布跨度大等天然優(yōu)點。 涵蓋石羊河水系、黑河水系、疏勒河水系、黃河大通河水系和柴達(dá)木盆地自流水系，統(tǒng)計采集到 16 個 自然 種群 ，樣品采集原則保持基本的種群隔離，分布在有一定地理隔離的河流水體中 （圖 2。 野外采集過程中，采樣點用 位采集了經(jīng)緯度、海拔高 度等信息，并且對修長高原鰍種群生境進(jìn)行了記錄，具體包括河寬、水深、流速、濁度、 等等。 樣品經(jīng)過初步的形態(tài)學(xué)鑒定后 立即 用無水乙醇 浸泡 在收集管中保存，隨后放入 時間保存。 樣品形態(tài)學(xué)的初步鑒定參照朱松泉老師編著的中國條鰍志，初步進(jìn)行形態(tài)學(xué)的分類。在此基礎(chǔ)之上，請教中科院武漢水生研究所何德奎老師進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)。實驗結(jié)果中對樣品進(jìn)行拍照（圖 2 圖 2修長高原鰍 的 形態(tài)特征示意圖 he 州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 祁連山地區(qū)修長高原鰍譜系地理學(xué)研究 10 圖 2修長高原鰍 的分布范圍和種群分布 （綠色圓點代表樣點位置） of 因組 取 將所有樣品進(jìn)行總 提取， 選取海洋動物組織基因組 取試劑盒提取樣品基因組總 提取的總 過檢測 ,濃度比較高，足夠進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。 具體實驗操作步驟如下： （ 1）將實驗所用的槍頭、離心管、鑷子、手術(shù)剪等進(jìn)行滅菌處理。 （ 2） 稱取最多不超過 30樣品尾柄處肌肉組織材料，放入裝有 200渦震蕩 15 秒。 （ 3）加入 20白酶 K（ 20mg/液，漩渦混勻，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠， 56C 水浴 12 小時，中間每隔半小時震蕩一次，直至組織完全溶解，簡短離心以去除管壁的水珠，再進(jìn)行下一步驟。 （ 4）加入 200沖液 分顛倒混勻， 70C 水浴放置 10 分鐘 ，溶液應(yīng)變清亮，簡短離心以去除管壁的水珠。（一般加入 液會產(chǎn)生白色沉淀，蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 祁連山地區(qū)修長高原鰍譜系地理學(xué)研究 11 70C 放置后會消失） （ 5）加入 200水乙醇，充分顛倒混勻，此時可能出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心去除管蓋的水珠。 （ 6）將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱內(nèi)， 12000心 30秒，倒掉廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 （ 7）向吸附柱中加入 500用前先加入無水乙醇）， 12000心30 秒，倒掉廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 （ 8）向吸附柱中加入 700用前先加入無水乙醇 ），室溫放置 3 分鐘，12000心 30 秒，倒掉廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 （ 9）向吸附柱中加入 500用前先加入無水乙醇）， 12000心30 秒，倒掉廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 （ 10）將吸附柱放回收集管中， 12000離心 2 分鐘，倒掉廢液，將吸附柱放置 數(shù)分鐘，徹底晾干吸附材料的殘余液體。 （ 11）將吸附柱轉(zhuǎn)入一個干凈的新的離心管中，向吸附柱中間部位懸空滴加50200脫緩沖液 溫放置 5 分鐘， 12000心 2 分鐘將溶液收集到離心管中。 物的選擇 通過文獻(xiàn)的閱讀， 研究選取了修長高原鰍線粒體 兩個片段，分別為細(xì)胞色素 b（ 和環(huán)氧合酶 1（ ，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，嘗試用 15915 和 對引物進(jìn)行擴(kuò)增，實驗結(jié)果表明條帶清晰，達(dá)到送測標(biāo)準(zhǔn)。 增及測序 引物對應(yīng)堿基序列見表 2 表 2in 增片段 正引物（ 5 反引物（ 5 線粒體目的基因的擴(kuò)增和測序 兩組引物經(jīng)過生物公司合成后稀釋為 5P 過幾次反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的摸索，最終確定了最適宜的 體系濃度和反應(yīng)程序 。片段 增反應(yīng)的 25應(yīng)總體積包括 滅菌 1 祁連山地區(qū)修長高原鰍譜系地理學(xué)研究 12 正引物 1引 物 2ul ， 1應(yīng)程序如下：首先預(yù)變性 94C 5后 35 個循環(huán)包含 94058C 退火 4572C 延伸 1后后延伸 72C 7片段 系為：每 25應(yīng)總體積包括 滅菌 CR 引物 引物 2， 1 應(yīng)程序如下：首先預(yù)變性 94C 5后35 個循環(huán)包含 94C 變性 3055C 退火 4572C 延伸 1后后延伸72C 7兩端基因片段經(jīng)過擴(kuò)增后電泳檢測 后 條帶清晰， 帶大約 1000段大約 800右，擴(kuò)增樣品密封后 送去北京六合華大基因公司進(jìn)行堿基序列測定。 據(jù)分析 將測序的得到的數(shù)據(jù)結(jié)果 用 行序列多重比對，在此同時，以原始測序 峰值結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行人工校正。比對結(jié)束后 段有效序列長度為 1000 個 段有效序列長度為 635 個 兩個片段進(jìn)行拼接。 利用 軟件 生成單倍型，然后將所有的單倍型以及外類群采用最大簡約分析法（ 極大似然法（ 貝葉斯法用.0 件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。將生成的單倍型用 建單倍型網(wǎng)狀圖。接下來，運用 件計算 種群分化水平 （ 、物種 總遺傳多樣性（ 和 種群內(nèi)遺傳多樣性（ 。最后，的分子多樣性變性分析 of 算模塊對種群內(nèi)及種群間遺傳變異進(jìn)行估算，設(shè)置 1000 次的隨機(jī)參數(shù)進(jìn)行置換檢驗 。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 祁連山地區(qū)修長高原鰍譜系地理學(xué)研究 13 第三章 結(jié)論 驗結(jié)果 群地理位置及單倍型分布 我們總共采集到 修長高原鰍 16 個樣點 16 個自然種群 ， 共 216 條個體 ， 49種單倍型 。每個自然種群個體數(shù)量由 1 到 35 個不等。采集過程中用 外定位儀器記 錄了樣點的經(jīng)緯度、 海拔信息 及種群個體和單倍型分布情況 。 表 3長高原鰍 采集種群的地理位置和 線粒體 單倍型分布 of of N） / E） m） N T T T T GL 731/10224 3731/10224 3731/10224 3731/10224 3731/10224 3731/10224 3731/10224 3731/10224 3718/10309 2810 2810 2810 2810 2810 2810 2810 2810 2613 5 2 1 3 1 1 1 1 1 2 4 6 8 L 718/10309 2613 1 L 718/10309 2613 2 L 718/10309 2613 1 J 717/10314 2475 1 D 840/9825 3390 4 D Q Z 840/9825 3850/9850 3824/9939 3804/10023 3845/10006 3390 3827 3202 2934 1774 1 6 4 10 4 16 16 州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 祁連山地區(qū)修長高原鰍譜系地理學(xué)研究 14 續(xù) 表 3長高原鰍 采集種群的地理位置和 線粒體 單倍型分布 N） / E） m） N YN 850/9850 3827 1 Q 824/9939 3202 1 B 804/10023 2934 1 B B B BB 804/10023 3804/10023 3804/10023 3804/10023 3804/10023 3804/10023 2934 2934 2934 2934 2934 2934 1 1 1 1 1 1 21 23 25 GZ 845/10006 1774 1 Z 845/10006 1774 1 Z T T E E E M R L L E E E M 845/10006 3845/10006 3738/9529 3738/9529 3738/9529 3626/9423 3625/9452 3630/9611 3625/9452 3630/9611 3625/9452 3630/9611 3630/9611 3646/9904 3630/9450 3630/9450 3930/9600 4032/9631 3930/9600 4032/9631 3625/9452 3625/9452 3625/9452 3625/9452 3625/9452 3625/9452 3630/9611 1774 1774 3240 3240 3240 2779 2818 2691 2818 2691 2818 2691 2691 3163 2169 2169 2130 1316 2130 1316 2818 2818 2818 2818 2818 2818 2691 3 1 9 1 5 8 3 10 35 1 3 1 1 32 11 1 8 6 4 1 1 3 2 2 1 1 1 29 31 33 33 34 36 38 40 40 42 44 46 48 州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 祁連山地區(qū)修長高原鰍譜系地理學(xué)研究 15 統(tǒng)發(fā)育分析及主要分支 結(jié)構(gòu) 選取 鰍科須鰍屬 托氏須鰍 鰍科南鰍屬 背紋 南鰍 高原鰍屬 似鯰高原鰍 為外類群 ，經(jīng)過一系列數(shù)據(jù)處理和軟件分析得到系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)構(gòu)， 使用 最大簡約分析法（ 極大似然法（ 貝葉斯法用 .0 件 分別 得到的樹形結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析， 分支 結(jié)果基本一致，因此，選擇 件得到的進(jìn)化樹進(jìn)行分析（圖3分支結(jié)果與預(yù)想結(jié)果基本一致，具有明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)。 使用 3，與系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果進(jìn)行比較，網(wǎng)絡(luò)聚合結(jié)果和樹狀分支結(jié)果一致，有明顯的星狀結(jié)構(gòu)，聯(lián)系對應(yīng)種群地理位置進(jìn)行分析，結(jié)果具有一定的分析意義。用 葉斯方法對修長高原鰍 物種的分化時間進(jìn)行估算，得到的結(jié)果顯示。 圖 3長高原鰍線粒體單倍型網(wǎng)狀分析圖 of 州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 祁連山地區(qū)修長高原鰍譜系地理學(xué)研究 16 圖 3長高原鰍 單倍型系統(tǒng) 發(fā)育 樹 of 遺傳多樣性及種群隔離分化 修長高原鰍共 216 個試驗樣品，生成 49 個單倍型，測序結(jié)果 635 個 使用 件將所有單倍型的堿基變異位點統(tǒng)計，共 337 個堿基變異位點（表 3然后將 16 個自然種群， 49 個單倍型的所有單倍型數(shù)據(jù)生成 式文件，使用 件進(jìn)行 析 （表3將所有種群單倍型分布情況和單倍型變異堿基位點運用 件進(jìn)行分析，得到相應(yīng)的 然種群總的遺傳多樣性）、 理單元遺傳分化系數(shù)）和 傳分化系數(shù)）。 修長高原鰍 自然種群總的遺傳多樣性 于種群間遺傳多樣性（ 因此地理單元間的遺傳分化系數(shù) （ 和遺傳分化系數(shù)蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 祁連山地區(qū)修長高原鰍譜系地理學(xué)研究 17 （ 也較高。這表示了 修長高原鰍 種群間的遺傳分化較高，并且種群間基因流較少 ， 在物種水平單倍型間有著明顯的譜系地理結(jié)構(gòu) 。 表 3長高原鰍 種群之間單倍型 of of of of of 5 a 200 215 b to of 州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 祁連山地區(qū)修長高原鰍譜系地理學(xué)研究 18 表 3長高原鰍 49種 單倍型比對后的變異位點從 5 到 3 分布情況 of of NA in 2 2831 46 52 58 59 70 76 79 100 106 127 139 160 163 178 187 217 223 244 256 274 280 283 286 289 298 304 307 310 313 319 325 328 331 339 94268 418 103148 133172 181454 247 208253 241 637 301 607 322 727 493 352 214439601787808 4244