【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）動(dòng)物源性食品中獸藥多殘留通用型檢測(cè)技術(shù)體系研究-項(xiàng)目驗(yàn)收文檔

I 浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究（分析測(cè)試）項(xiàng)目驗(yàn)收文檔 項(xiàng)目 合同 編號(hào)： 2011目名稱： 動(dòng)物源性食品中獸藥多殘留通用型檢測(cè)技術(shù)體系研究 項(xiàng)目承擔(dān)單位： 寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院 項(xiàng)目負(fù)責(zé)人： 二一三年三月 錄 第一部分 工作報(bào)告 .二部分 技術(shù) 報(bào)告 .要 .一章 文獻(xiàn)綜述 .言 .類別多殘留分析方法的必須性和可行性 .處理方法部分 . 提取方法 . 凈化方法 .器分析方法部分 . 液相色譜部分 . 質(zhì)譜技術(shù)部分 .結(jié)與展望 .考文獻(xiàn) .二章 超高效液相色譜 用測(cè)定生鮮牛奶中的獸藥和其他污染物 .言 .驗(yàn)部分 .果與討論 .章結(jié)論 .論與展望 .考文獻(xiàn) .錄 1.錄 2（縮寫(xiě)） .謝 .究期間發(fā)表的主要論文與發(fā)明專利 .施總結(jié)報(bào)告 部分 動(dòng)物源性食品中獸藥多殘留通用型檢測(cè)技術(shù)體系研究 一、項(xiàng)目基本情況 近些年來(lái)，小分子有機(jī)物污染物（包括獸藥、農(nóng)藥、生物毒素、環(huán)境污染物、非法添加物等）引發(fā)的大規(guī)模食品安全事故在我國(guó)頻發(fā)，如： 2002 年，蝦仁氯霉素事件； 2006 年，蘇丹紅事件； 2008 年，嬰幼兒奶粉的三聚氰胺事件；2010 年，濫用瘦肉精的 健美豬 事件； 2011 年，多家乳企的牛奶中黃曲霉毒素標(biāo)事件； 2012 年，洋快餐的 速生雞 濫用抗生素、抗病毒藥物事件等。一系列食品安全事故引發(fā)了全社會(huì)的高度關(guān)注，這些小分子有機(jī)污染物不僅對(duì)消費(fèi)者健康構(gòu)成了威脅，而且這些惡性事件影響了消費(fèi)信心以及我國(guó)動(dòng)物源性食品在國(guó)際上的聲譽(yù)。歐盟美、日本對(duì)不同食品中各種小分子有機(jī)污染物殘留設(shè)定了嚴(yán)格的法規(guī)要求。我國(guó)蜂產(chǎn)品、畜禽產(chǎn)品、水產(chǎn)品等動(dòng)物源性食品由于化學(xué)殘留超標(biāo)屢次被進(jìn)口國(guó)退貨、銷毀、索賠甚至終止貿(mào)易往 來(lái)，蒙受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并遭受信譽(yù)危機(jī)，影響了食品國(guó)內(nèi)消費(fèi)與出口創(chuàng)匯。 種類繁多、來(lái)源廣泛的小分子有機(jī)污染物無(wú)論給企業(yè)自檢還是政府監(jiān)管帶來(lái)了高度的復(fù)雜性和不確定性。食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的樣品和待檢測(cè)的項(xiàng)次越來(lái)越多，加上周期要求，面臨的分析任務(wù)越來(lái)越艱巨。我國(guó)現(xiàn)階段，獸藥和其他污染物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（除農(nóng)藥殘留分析外）的基本設(shè)計(jì)思路是將化學(xué)結(jié)構(gòu)相似或功效接近的一類目標(biāo)物進(jìn)行單類別 S 檢測(cè)為主，雖然充分考慮了化合物之間的差異，相對(duì)于通用型方法，降低前處理的難度，但這樣需要制訂出一大堆的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法。截止 2010 年，僅關(guān)于動(dòng)物源性食品中有關(guān)獸藥殘留和生物毒素的現(xiàn)行國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)就已超過(guò) 100 個(gè)，且尚有很多種類藥物并未覆蓋，未來(lái)需要分析的類別還在不斷增加，眾多獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法無(wú)疑給全面質(zhì)量把關(guān)帶來(lái)巨大的麻煩。 006 年 表第一篇同時(shí)篩選牛肉、豬肉和雞肉中 130 種獸藥的S 方法?？焖佟⑼ㄓ玫亩囝悇e多殘留分析方法（ 速成為研究開(kāi)發(fā)的熱門之一。 和 S 技 術(shù)，分別相繼開(kāi)發(fā)出牛奶中 150 和 101 種化合物的多類別檢測(cè)方法， （ 2008）最早提出來(lái)通用型提取方法（ 念，采用 奶、蜂蜜、肉類等基質(zhì)中172種農(nóng)藥、生物毒素、植物毒素和獸藥。 采用兩種不同極性溶劑乙腈和 沖液分別提取不同肌肉中 100 種獸藥。經(jīng)過(guò) 柱可以除去蛋白、碳水化合物等，但不能避免強(qiáng)極性化合物的損失。 也指出由于受極性差異的影響，當(dāng)前多類別分析方法存 在部分待測(cè)物線性不理想，影響其檢測(cè)低限和定量等問(wèn)題。他們預(yù)測(cè)將待測(cè)物分成極性組、中等極性到弱極性組兩組處理將更為合理 82。這種按極性分組設(shè)計(jì)思路既考慮了化合物間的差異，又最大程度結(jié)合了化合物間的共性，分為 2極性組別，進(jìn)行前處理和儀器分析理論上能勝任全面分析的要求，可組成一個(gè)嚴(yán)密的檢測(cè)體系。即使是新出現(xiàn)的藥物，只要了解其大致的極性范圍，進(jìn)行增補(bǔ)也十分方便。因此極性分組是打破 檢不了、檢不快 的檢測(cè)瓶頸的好途徑。 通過(guò)這些研究者的前期嘗試可見(jiàn)， S 或 S 技術(shù)大大擴(kuò)充了檢測(cè) 范圍，但其選擇性和靈敏度并沒(méi)有無(wú)限制降低對(duì)樣品前處理的要求，動(dòng)物組織中不同理化性質(zhì)的獸藥和其他污染物的同時(shí)分析具有高度的復(fù)雜性，并沒(méi)有取代單類別多殘留方法成為檢測(cè)主流方法。一方面，對(duì)于多類別方法，必須兼顧各類別的回收率，一般采用通用性強(qiáng)、選擇性小的提取方法。食品基質(zhì)一般比較復(fù)雜，勢(shì)必會(huì)因此帶來(lái)較多共萃取物，基質(zhì)效應(yīng)干擾檢測(cè)結(jié)果；另一方面，凈化往往帶有一定的選擇性，尤其是處理步驟過(guò)多時(shí)容易導(dǎo)致某些待測(cè)化合物的損失，且可能降低了樣品的通量。因此，開(kāi)展用于分析動(dòng)物源組織中的小分子有機(jī)污染物通用型較強(qiáng)的多類別 S 方法研究，對(duì)于提高檢測(cè)效率，減少漏檢以及降低分析成本具有十分現(xiàn)實(shí)的意義。 二、 項(xiàng)目執(zhí)行情況 V 研究?jī)?nèi)容包括如下內(nèi)容： 1. 相參數(shù)優(yōu)化（色譜柱和流動(dòng)相的比較與選擇）、 S 參數(shù)的優(yōu)化（毛細(xì)管電壓、電離方式與離子對(duì)的比較與選擇）； 2. 標(biāo)準(zhǔn)品的配置、共存穩(wěn)定性（避免使用酸或堿溶劑，溶劑選擇與有效期）； 3. 極性 取方法、凈化的優(yōu)化， 4. 強(qiáng)極性組的提取和凈化、 5. 方法學(xué)參數(shù)評(píng)價(jià) ; 6. 當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)實(shí)際樣品的抽樣調(diào) 查，完成初步摸底； 7. 方法的驗(yàn)證、專利的申請(qǐng)。 起始年月 進(jìn)度 2011 20111. 完成了所有標(biāo)準(zhǔn)品配制； 2. 建立了 S 的 行 相參數(shù)優(yōu)化； 20112011. 比較水、乙腈、乙酸乙酯、乙醇和正己烷提取配方豬肉中小分子污染物的效率。 2011 20111. 比較超低溫冷凍法、固相萃取法、水沉淀脂肪、 2. 發(fā)明專利申請(qǐng)； 2012 20121. 提取方法的確定：比較了單一溶劑、混合溶劑的提取效果。 2. 凈化方法的確定： 化方法的確定： 3. 專利申請(qǐng)。 2012 2012論 文投稿 ； 2. 投稿到色譜（中文核心）。 6. 比較五氟丙酸和七氟丁酸兩種離子對(duì)試劑對(duì)氨基糖苷類的保留。 2012 20121. 從特異性、檢測(cè)限、回收率、精密度等方面進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)； 2. 完成方法的驗(yàn)證； 3. 專利申請(qǐng)。 2012 2013. 對(duì)豬肉、牛肉、魚(yú)肉、雞肉等實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，并對(duì)實(shí) 際樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析； 2. 發(fā)明專利申請(qǐng)：一種動(dòng)物源性食品中小分子有毒有害物質(zhì)的通用快速檢測(cè)方法。 3. 方法驗(yàn)證。 2013 2012. 對(duì)研究項(xiàng)目進(jìn)行國(guó)外查新； 2. 形成技術(shù)報(bào)告和工作報(bào)告； 3. 申請(qǐng)鑒定驗(yàn)收。 三、 技術(shù)創(chuàng)新點(diǎn)和技術(shù)解決方案 改變我國(guó)現(xiàn)階段獸藥和其他污染物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的基本制訂套路（單類別 S 檢測(cè)），緊扣 相似相容 原理，創(chuàng)新地采用極性分組前處理技術(shù)思路，既考慮了化合物間的差異，又最大程度結(jié)合了化合物間的共性，將極性分組前處理技術(shù)與 S 技術(shù)兩者結(jié)合 起來(lái)，開(kāi)展主要?jiǎng)游镄灾行》肿佑袡C(jī)污染物的快速、通用篩查和確證方法的研究。 （ 1）分析儀器方法部分：根據(jù)不同目標(biāo)化合物的峰形和離子化效率，僅選擇 3種流動(dòng)相，其中強(qiáng)極性組采用七氟丁酸作為離子對(duì)試劑（濃度為 50 ）。定容液主要由二甲亞砜（ 水組成，由 3次進(jìn)樣；選擇耐100%水的色譜柱，可以實(shí)現(xiàn)極性和非極性化合物的同時(shí)較好保留。 不影響同分異構(gòu)體的分離。 2）前處理部分：創(chuàng)新地采用極性分組前處理技術(shù)思路，既考慮了化合物間的差異，又最大程度結(jié)合了化合物間的 共性，實(shí)現(xiàn)多類別極性和非極性待測(cè)物的提取和凈化。強(qiáng)極性組（氨基糖苷類）前處理采用乙腈 +乙醇 +水溶液（ 1+1+2）和正己烷一步法進(jìn)行提取和凈化；極性 解后，采用雙相法提取，超低溫冷凍法、分散固相萃取法、降低凈化要求手段等三重組合凈化，達(dá)到了降低背景干擾的目的。 及其特點(diǎn) 1. 極性分組前處理，保障檢測(cè)項(xiàng)目覆蓋全面 ： 首先，將目標(biāo)化合物按極性分為強(qiáng)極性組（ 12 種待測(cè)物）和極性 284 種待測(cè)物），分別進(jìn)行前處理和儀器分析，理論上保障檢測(cè)項(xiàng)目覆蓋全面。優(yōu)于藥物類別和酸堿性等方 式分組。 2. 極性組（氨基糖苷類）的提取和凈化： 前處理十分簡(jiǎn)便：采用 50%乙腈乙醇水溶液（ 1+1+2）和正己烷一步法提取和凈化，氮?dú)獯等ビ袡C(jī)溶劑，聚醚砜微孔膜過(guò)濾后進(jìn)樣；比較了離子對(duì)試劑七氟丁酸和五氟丙酸對(duì)氨基糖苷類 合物在反相色譜柱上保留效果，采用七氟丁酸待測(cè)物不僅保留時(shí)間更長(zhǎng)，而且響應(yīng)強(qiáng)度更大。 3. 極性 包括了酶水解步驟： 在溫和條件（ 溫37 ）下作用 16 h，避免漏檢軛合代謝物；采用兩相提取法，通用性強(qiáng)：由上下兩層互補(bǔ)相溶的溶劑組成，上層為正己烷，下層為乙腈乙醇水溶液（含正己烷對(duì)弱極性待測(cè)物具有極高的提取效率；乙腈乙醇水溶液對(duì)極性和中等極性化合物的提取效果好；另外， 為保護(hù)劑，防止四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類被金屬離子螯合引起回收率降低；下層液體中有機(jī)相和水相的比例，恰好為下一步 4. 極性 分散固相萃?。?利用氨基填料（ 料 (300 50 溶劑環(huán)境即為 7.5 腈 +乙醇 +水（ 60+15+25，體積比），結(jié)合脂肪在水中溶解度極低的特點(diǎn)（極性差異大），簡(jiǎn)便快捷實(shí)現(xiàn)樣品的凈化， 此方法重復(fù)性良好、回收率好、通用性強(qiáng)。與固相萃取法相比，大大提高處理效率，成本低廉。 5. 極性 超低溫冷凍法：溫度的降低在不影響低含量的目標(biāo)化合物回收率的同時(shí)，使得提取液中含量較高的脂肪、碳水化合物雜質(zhì)的溶解度減少而部分析出，通過(guò)離心或冷凍過(guò)濾達(dá)到分離，通用性強(qiáng)。 6. 降低前處理要求：利用流路切換避免污染質(zhì)譜 （前 2.0 換至廢液，去除鹽分、糖分，彌補(bǔ)了不采用固相萃取小柱凈化的缺陷）； 7. 流動(dòng)相和定容液的選擇，獲得最少的進(jìn)樣次數(shù)。 不僅極性待測(cè)物具有好的峰形，而且又不影響非極性待測(cè)物的在溶劑中的溶 解度。對(duì)于 296 種化合物，在 3種不同流動(dòng)相的條件下，僅需 3次進(jìn)樣。 綜上所述，本方法除了檢測(cè)覆蓋面更廣外，在前處理的通用性、凈化效果和處理速度等方面有了較大的突破。降低漏檢風(fēng)險(xiǎn)，加上前處理簡(jiǎn)便快速，與以往多個(gè)方法的檢測(cè)方法，檢測(cè)效率得到了根本性的提升，縮短檢測(cè)周期；同時(shí)，與采用固相萃取小柱、 但保證極性強(qiáng)和極性弱的待測(cè)物 四、科技成果轉(zhuǎn)化、產(chǎn)業(yè)化經(jīng)費(fèi)投入情況，包括總經(jīng)費(fèi)和科研經(jīng)費(fèi)投入情況 項(xiàng)目投入資金 4萬(wàn)元，全部為單位自籌 。 完成情況 見(jiàn)下方 對(duì)照表 。 項(xiàng)目 項(xiàng)目合同書(shū) 實(shí)際完成情況 主要技術(shù)指標(biāo)（限200字） （ 1）技術(shù)指標(biāo)： a） 一個(gè)方法同時(shí)完成獸藥 150項(xiàng)以上（包含磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、氯霉素類、硝基咪唑類、苯并咪唑類、阿維菌素類、糖皮質(zhì)激素類、性激素、 2狀腺抑制劑類、鎮(zhèn)定劑類、大環(huán)內(nèi)酯類、 內(nèi)酰胺類、喹惡啉類，每類藥物至少包含一種）的同時(shí)檢測(cè)，包括定性和定量； b） 檢測(cè)限滿足目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)法規(guī)要求，回收率、精密度滿足分析要求； c） 前處理方法通用性強(qiáng)，適合復(fù)雜生物樣品基質(zhì)的檢測(cè)。 d） 采用超高效液相色譜和三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜，方法快速、靈敏。 a）通用性強(qiáng) ：分析目標(biāo)物達(dá)到 296項(xiàng)，包括了水溶性極強(qiáng)的氨基糖苷類、其中獸藥超過(guò) 200項(xiàng)：包括所有項(xiàng)目合同書(shū)所述類別。 無(wú)論是從類別的數(shù)量和目標(biāo)物的數(shù)量，都大大超過(guò)預(yù)期的檢測(cè)范圍。 b）從本方法來(lái)看，線性良好。本方法的定量限在 0 g/間。對(duì)于 80 %以上的待測(cè)物定量限低于 2 g/大部分待測(cè)物的檢測(cè)低限能滿足歐盟的限量。在牛肉、雞肉和魚(yú)肉中平均回收率范圍分別在 相應(yīng)的重復(fù)性分別范圍為 三個(gè)水平的平均添加回收率在 其相應(yīng)的 內(nèi)精密度）在 日間精密度在 對(duì)于 80 %以上的待測(cè)物 回 收 率 在 70之 間 ， 精 密 度 . 潮霉素 B 3128220000 . 氫鏈霉素 12821000 . 霉素 5721000 . 卡那霉素 806318000 . 糖霉素 2554617000 114 . 龍霉素 754223000 . 普霉素 3732121000 . 布霉素 3298620000 0. e 1a 慶大霉素 609819000 1 慶大霉素 587621000 2 慶大霉素 975120000 60 11. 索米星 3238519000 2. 替米星 5639121000 .3 d of 1, 1a （慶大霉素包括 表 2在正離子模式下采集的 144種化合物中英文名稱、化學(xué)分類號(hào)、分子式、分子量 、標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液濃度、保留時(shí)間、定量離子對(duì)、定性離子對(duì)和離子比例 he of 44 in C in 合物 化學(xué)分類號(hào) 子式 子量準(zhǔn)液(保留時(shí)間 定量離子對(duì) 定性離子對(duì) 離子比例 ) 甲狀腺抑制劑類 13. 巰咪唑 604000 88 57 4. 基硫脲嘧啶 19565000 43 43 84 5. 硫氧嘧啶 517000 154 ) 硝基咪唑類 16. 基甲硝唑 4812600 126 7. 936500 140 8. 硝唑 443600 82 9. 硝唑 7681600 01 55 201 140 0. 美唑 551500 96 81 61 21. 硝唑 19387800 48 121 248 2. 基異丙硝唑 35175700 122 3. 丙硝唑 14885700 2) 24. 克多巴胺 97825180 5. 美特羅 73573190 149 6. 代克倫特羅 暫無(wú) 0 7. 酸苯氧丙酚胺 579180 284 8. 布特羅 56341130 9. 布特羅 81732180 0. 噴特羅 95656140 202 1. 氟拉明 458120 109 159 2. 苯乙醇胺 A 暫無(wú) 0 3. 安得 3506160 4. 海拉明 58170 152 5. 他索洛爾 63659180 7) 苯并咪唑類 36. 2934700 7. 基丙基磺酰苯并咪唑 809831000 8. 基噻苯咪唑 9481000 62 39. 菌靈 10605900 0. 苯咪唑 1481000 175 131 1. 5523291400 77 2. 820501400 95 3. 基甲苯咪唑 602541600 4. 苯達(dá)唑砜 751841200 159 5. 吩達(dá)唑 537161500 159 6. 苯咪唑 314311600 7. 苯咪唑 142551300 8. 苯噠唑 549651200 9. 苯達(dá)唑亞砜 540291200 95 0. 苯咪唑 314301600 ) 同化激素類 51. 酸地塞米松 11772400 ) 抗病毒藥 52. 剛烷胺 7681000 52 52 3. 剛烷乙胺 133921200 81 ) 喹惡啉類 54. 乙醇 236961200 102 143 5. 巴多 1791337 00 63 56. 氧基喹啉 911400 148 2) 57. 羥吡啶 2971700 101 87 8. 癸氧喹酯 185072400 ) 59. 莫西林 2678716000 114 3) 林可酰胺、大環(huán)內(nèi)酯類 60. 可霉素 1541800 1. 旋霉素 80254300 2. 米考星 1080504600 3. 利霉素 795481700 4. 林霉素 183231800 5. 桃霉素 39223500 6. 妙菌素 552972800 119 7. 樂(lè)菌素 14014600 8. 它霉素 13924100 9. 霉素 1143700 83 0. 沙霉素 168464200 1. 紅霉素 802144100 116 2. 尼妙林 1013123100 64 ) 非甾類消炎藥類 73. 羅昔康 363221500 78 121 4. 林酸 381942000 248 5. 美汀 261711500 91 6. 基布洛芬 220711600 77 7. 普生 222041