【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）海島棉NPR1和XET基因的克隆及表達生物化學與分子生物學博士論文

密級：（內部 5 年） 論文編號： 中國農業(yè)科學院 博士學位論文 海島棉 因的克隆及表達 ii 縮略詞表 縮寫 英文名稱 中文名稱 楊酸 ,6， 6,2,3)并噻唑類制劑 統(tǒng)獲得性抗性 導系統(tǒng)抗性 JA 莉酮酸 烯 R XG 葡聚糖 葡聚糖內轉糖苷酶 要 棉花是一種重要的經(jīng)濟作物，在國民經(jīng)濟中具有重要作用。當前我國棉花生產(chǎn)中存在兩個關鍵問題：一是黃萎病危害嚴重，缺乏抗黃萎病的棉花品種；二是纖維品質中等和單一，在國際市場上缺乏競爭力。針對以上問題，本論文進行了以下兩方面的研究。 1. 海島棉系統(tǒng)獲得性抗性（ 徑中調控基因 克隆及表達 R 是 徑中的中心元件，其功能定位在水楊酸（ 累之后、 因表達之前。本研究利用擬南芥 核苷酸序列 物，發(fā)現(xiàn)了兩處保守區(qū)，根據(jù)此保守區(qū)序列設計簡并引物，克隆得到了海島棉 基因片段；然后用 3 of 和 5術，克隆了 全長 列。分析發(fā)現(xiàn)， 起始密碼子上游存在 2 個 W 框；推導的氨基酸序列與已知 同源性較低 （ 39 55%），但在功能區(qū)的同源性可達 70以上； 明該蛋白中含有 錨蛋白重復序列結構域。在擬南芥中， 始密碼子上游有 3 個 W 框，對誘導 表達和激活 導的植物防衛(wèi)反應至關重要，錨蛋白重復序列則是 現(xiàn)其功能必不可少的。由此可以斷定我們克隆的基因是 海島棉中的同源基因，命名為 構建了正義、反義和 物表達載體，利用花粉管通道法將這三種質粒轉入棉花，同時將正義（ 反義（ 物表達載體通過農桿菌介導法轉入了煙草，均獲得了轉基因植株。通過 交技術檢測 ，結果表明目的基因已整合到煙草和棉花基因組中。用離體葉片接種法對轉基因煙草進行抗病性鑒定，有 5 株轉 煙草對赤星病菌的抗性明顯提高。 2. 海島棉 因的克隆及過量表達對酵母細胞伸長的影響 木葡聚糖內轉糖苷酶（ 一類重要的細胞壁松弛酶，與細胞的伸長密切相關。本研究以海島棉 7124 為材料，用 術得到了海島棉的 全長 因 基酸同源性比較表明， 已報道的其他植物的 白 有較高的同源性（ 67 71%），且含有 活性催化位點 構建了酵母表達載體，利用裂殖酵母表達系統(tǒng)對該基因的功能進行了活體分析， 裂殖酵母中的過量表達 促使 細胞伸長約 1 倍，且細胞為單核，暗示 細胞伸長的促進作用是由于細胞壁的松弛而引起的。這是首次通過轉基因技術在活體條件下證明 有促進細胞伸長的功能。 構建纖維特異表達啟動子 動的 物表達載體和 物表達載體，用花粉管通道法轉化棉花，獲得轉基因植株，其對纖維品質的影響正在研究中。 關鍵詞： 海島棉 克隆 表達 v as of an in in is of to of in as 1. AR is a at a A AR of we . 7124 as a to by W- in TG of to a at TB is by 5S of of in by 2. of on in is a of It is a ET G. we . 7124 as a to CR is to ET 67% 71%) to in In vi as of To of is to ET is to in in by ; R 錄 引言 1 第一部分 海島棉系統(tǒng)獲得性抗性途徑中調控基因 克隆及其在轉基因煙草中的表達 2 第一章 文獻綜述 2 1. 植物 R 基因與病原物 因的互作 2 原物 因 2 物 R 基因 4 R 蛋白的互作 6 2. 植物抗病信號傳遞 6 物抗病途徑 7 物防衛(wèi)反應信號傳遞相關基因 11 3. 植物防衛(wèi)反應基因 16 丁質酶和 16 R 蛋白 17 它的防衛(wèi)基因 18 4. 研究的目的意義 19 第二章 試驗研究 20 第一節(jié) 海島棉系統(tǒng)抗性途徑中調控基因 克隆及序列分析 20 1. 材料與方法 20 料 20 法 21 2. 結果與分析 28 島棉 長 克隆 28 列分析 31 3. 討論 35 第二節(jié) 轉 因煙草的抗病性分析 37 1. 材料與方法 37 1 料 37 法 38 2. 結果與分析 46 物表達載體的構建 46 物表達載體的構建 49 草的遺傳轉化及再生植株的分子檢測 52 基因煙草的抗病性分析 53 花的遺傳轉化與篩選 54 3. 討論 54 參考文獻 56 小結 69 第二部分 海島棉 因的克隆與功能分析 70 第一章 文獻綜述 70 1. 棉花纖維的發(fā)育 70 2. 細胞壁結構與細胞伸長、纖維發(fā)育 70 展蛋白 72 葡聚糖內轉糖苷酶 74 3. 本研究的目的意義 76 第二章 試驗研究 77 1. 材料與方法 77 料 77 法 78 2. 結果與分析 92 因全長 克隆 92 因序列分析 93 因酵母表達載體的構建 95 因在酵母細胞中的過量表達對細胞長度的影響 96 物表達載體的構建 97 花的遺傳轉化 98 3. 討論 101 參考文獻 103 小結 110 結論及創(chuàng)新點 111 致謝 112 作者簡介 113 1 引言 棉花是一種優(yōu)良的天然纖維，具有吸濕、 通氣、保暖性好、不帶靜電、手感柔軟等人造纖維難以取代的特點。九十年代以來，隨著人們保健意識的增強和生活水平的提高，穿著天然纖維的服裝已成為一種不可逆 轉的國際潮流。 我國是當今世界 5 大產(chǎn)棉國之一，棉花的單產(chǎn)、總產(chǎn)水平和栽培面積均處世界前列。但目前我國棉花生產(chǎn)上存在兩個關鍵性難題：一是棉花纖維品質中等，且品質單一，在國際市場中缺乏競爭力，長絨纖維主要靠進口；二是黃萎病危害嚴重。自 90 年代以來，黃萎病的發(fā)生有加重趨勢，發(fā)生范圍也日趨擴大，造成巨大經(jīng)濟損失。 植物基因工程的發(fā)展為棉花抗病育種和纖維品質改良提供了新途徑。目前，開展棉花基因工程已具備了優(yōu)越的條件：（ 1）轉基因技術如花粉管通道法和農桿菌介導法已成功地用于棉花的遺傳轉化，花粉管通道法不受基因型的限制； （ 2）轉基因抗蟲棉已在生產(chǎn)上大規(guī)模應用，積累了豐富的經(jīng)驗；（ 3）在模式植物中已克隆了許多與抗病和細胞發(fā)育相關的基因，可以用分子生物學的方法去發(fā)掘棉花中的同源基因（ （ 4）棉纖維主要用作工業(yè)和成衣原料，轉基因產(chǎn)品的安全性問題較食用作物要小。但由于棉花基因組較大，結構基因組的研究落后于擬南芥和水稻，已克隆的有重要應用前景的基因貧乏，且對抗黃萎病和棉纖維發(fā)育的分子機理認識匱乏，因此，上游工作的薄弱仍然是通過基因工程手段改良棉花的瓶頸所在。 隨著分子生物學技術的發(fā)展，新的技術平臺不斷建立， 術是一種克隆基因的有效方法，省去構建 庫的繁瑣工作， 術則可誘導基因沉默來鑒定基因的功能。利用生物信息學和很多生物網(wǎng)站的信息數(shù)據(jù)，可為同源基因的克隆提供基礎。 海島棉是棉花四個栽培種之一，高抗黃萎病，纖維品質優(yōu)良。本研究以海島棉為材料，通過術克隆了系統(tǒng)獲得性抗病途徑中的主要調控基因 細胞壁修飾酶基因 對其功能進行了初步研究，期望為棉花基因工程提供有用的基因資源。 中國農業(yè)科學院博士學位論文 文獻綜述 2 第一部分 海島棉系統(tǒng)獲得性抗性途徑中調控基因 克隆及表達 第一章 文獻綜述 植物在與 微生物長期共同進化的過程中，形成了一系列防護機制來抵抗病原菌的侵染。早在20 世紀 60 年代，美國植物病理學家弗洛爾（ 1971）提出了基因對基因的假說，引導人們對植物抗病機制的研究逐步進入分子水平。半個多世紀的研究積累了豐富的資料，為揭示植物抗病機理奠定了堅實的基礎。 在不親和互作模式中，植物經(jīng)病原菌侵染后，首先通過信號識別，即病原菌的無毒基因 之間相互作用，產(chǎn)生激發(fā)子，激活植物體內的防衛(wèi)反應，一系列抗病信號傳導相關基因表達，最后是防衛(wèi)基因表達，使植物表現(xiàn)出抗病性。對 R 和 間的互作 及信號傳導相關基因的研究，將為植物抗病基因工程的發(fā)展提供理論依據(jù)。 1. 植物 R 基因與病原物 因的互作 1971）的基因對基因假說認為，如果寄主中有一個調節(jié)抗病性的基因，病菌中就有一個相應的基因調節(jié)致病性，其中寄主的抗病基因（ R）和病菌的無毒基因（ 顯性的，而寄主的感病基因和病菌的毒性基因是隱性的，只有具有抗病基因的植物品種和具有無毒基因的病菌小種互作時才表現(xiàn)抗病，其它情況均表現(xiàn)感病。目前已克隆了多個 R 基因和 因，分析已知病原物無毒因子與植物 R 基因的特性及功能，將有助于加 深了解植物的抗病機理。 原菌的無毒基因 初是根據(jù)在含有 R 基因的寄主植物中誘導抗病性的能力來定義的，是指與寄主 R 互作、產(chǎn)物與寄主 R 基因產(chǎn)物互補、 對寄主植物特異性不親和的基因，也稱為寄主專化性基因或反向調節(jié)寄主范圍的基因 ( 1990)。基因對基因假說的經(jīng)典解釋是受體 般認為，無毒基因編碼的特異性激發(fā)子為配體， R 基因產(chǎn)物為受體 ( 1990)， 激發(fā)子與相應的 R 基因產(chǎn)物識別誘導寄主的防衛(wèi)反應，從而表現(xiàn)小種品種互作的不親和性。無毒基因 失活或缺乏相應的無毒基因，則表現(xiàn)為小種品種互作的親和性反應，植物表現(xiàn)為感病。 迄今已從植物病原物（包括真菌、細菌、病毒等）中分離獲得多種無毒基因。 菌的 因 目前已克隆了約 40 多種細菌的 因，主要來自假單胞屬 黃單胞屬 2000）。它 們位于染色體或質粒上，編碼親水性可溶蛋白，且不具有典型的信號肽。盡管已分離到很多細菌的無毒基因，但除 ) 家族外，大部分沒有或只有很少的同源性。 中國農業(yè)科學院博士學位論文 文獻綜述 3 因家族 因 家 族 分 布 于 此基因家族成員有以下共同特點： 1）可以在抗性寄主上引起過敏性反應（ 2）在感病寄主上加重病癥； 3）序列同源性很高。 族成員在結構上的典型特征是 在其中心區(qū)域都含有一個 34 個氨基酸串連的重復區(qū)域， C 端含有 核定位序列（ 和酸性的轉錄激活結構域（ 基因家族成員間的不同在于重復序列數(shù)目的不同（ ） ( 2001)。重復序列對誘發(fā)多數(shù)寄主植物的 決定作用， 是激發(fā)植物 必需的 (， 1996； ， 2000)， 類 白中的 變將失去識別相關 R 蛋白的功能 ( 2001)。 族 族中最先分離到的成員是源自植物病原物 源自 2001），該家族還包括哺乳動物病原菌 Y. ， 1997)、植物病原菌 X. (， 1999)、 (， 2000)、 (， 2000)、 (， 2001) 以及植物共生菌 (， 1997)。 序列間沒有顯著同源性的無毒基因主要克隆自 包括一些克隆自無毒基因，編碼小型親水性蛋白，分子量多數(shù)在 18 40 有個別產(chǎn)物的分子量高達 100 1987)。 毒的 因 植物病毒的無毒基因編碼病毒的重要組分，如：病毒衣殼蛋白、復制酶蛋白和運動蛋白等。 研究發(fā)現(xiàn)一種病毒可誘發(fā)多種植物產(chǎn)生 種病毒無毒因子可以誘導不同 R 基因介導的胡椒輕型斑駁病毒的外殼蛋白可誘導胡椒 R 基因 導的 清 學上相關性小的不同病毒的外殼蛋白可誘發(fā)同一 R 基因介導的 ：煙草花葉病毒（ 黃瓜斑駁花葉病毒（ 外殼蛋白均可誘導毛葉煙（ N介導的 1997） 。從寄主角度講，不同植物中不同 R 基因，可以分別識別同種病毒中不同的無毒因子，如煙草 N 基因、毛葉煙 (N. N 基因、番茄 2 基因能夠分別識別 復制酶 ( ， 1999)、外殼蛋白 (， 1991) 及運動蛋白 (， 1993)，從而表現(xiàn) 病毒無毒因子與互補的 R 基因產(chǎn)物也可能通過間接的相互作用導致 抗病反應。 用芫箐皺縮病毒（ 的 子外殼蛋白 (對擬南芥基因文庫進行酵母雙雜交檢測，沒有篩選到對 生 R 基因，卻發(fā)現(xiàn)一種可能是 發(fā)子胞內受中國農業(yè)科學院博士學位論文 文獻綜述 4 體的寄主蛋白 （ ， 2000），這說明 R 可能是以間接作用的方式與 P 相互作用 (， 1998； 2001)。 菌的 因 由于缺乏簡便有效的克隆方法，迄今只是通過反向遺傳法從為數(shù)不多的幾種真菌中克隆到了一些無毒基因 。 番茄葉霉菌 (的 因是最早被克隆的真菌無毒基因，編碼小分子量的胞外蛋白，均含偶數(shù)半胱氨酸，在維持蛋白識別結構或直接在蛋白與抗病基因產(chǎn)物的識別中起重要作用 ( , 1997)。 在稻瘟菌 （ 中克隆得到兩類無毒基因。第一類編碼品種特異性抗性激發(fā)子，迄今唯一克隆的成員是一個 編碼 中性鋅金屬蛋白酶的 基因 ， 2000)。第二類無毒基因編碼非品種特異性抗性激發(fā)子，包括 碼產(chǎn)物包括信號肽共 145 個氨基酸，是一種小型富含甘氨酸的疏水蛋白 ( , 1995)。 從大麥云紋病菌 (分離鑒定的一種無毒基因，可以誘導多種禾本科作物產(chǎn)生壞死反應，還 可高度特異性地在含抗病基因 品種中誘發(fā)過氧化物酶基因及病程相關蛋白基因 的表達 ( , 1995)，由此推斷 與大麥 補的無毒基因。 其它真菌的無毒基因的克隆也在進行中。包括編碼豇豆銹病 種特異性激發(fā)子的基因，亞麻銹菌 無毒基因，十字花科黑脛菌 無毒基因 及 無毒基因 ( 1998； ， 2000)。 毒基因在病原物致病性中的作用 無毒基因是病原物的遺傳因子，它可以使相應的寄主植物對病原物的侵染產(chǎn)生防衛(wèi)反應，這顯然不利于病原物的生存和發(fā)展。為什么病原物產(chǎn)生一種限制自身的信號，并且在與植物抗病基因一起漫長的進化過程中沒有消失？研究表明，無毒基因具有有利于病原物自身生存的功能。真菌 一種無毒基因，該基因的突變株 在番茄葉片中的菌絲生長和分生孢子形成均明顯不如野生型 ( ,1997)。對大量病原物突變體的 分析結果也表明，在寄主不含相關 R 基因時， 因可對病原物提供一種選擇優(yōu)勢 ( ， 2000； 2001； ， 2000)。 同時應當指出，毒性和無毒基因只是人為的命名。無毒基因具有雙重功能：在含互補抗病基因的植物中表現(xiàn)無毒效應，而在不含互補抗病基因的植物中則顯示小種、菌株、致病型、或種特異性的毒性效應。在細菌無毒基因中，至少有十幾個基因在一種或多種細菌菌 株、致病型或種中，對不含互補抗病基因的寄主植物表現(xiàn)致病性和毒性作用 ( , 2000； , 2000)。多數(shù)病原菌無毒基因在病程中的作用尚有待進一步研究。 物的 R 基因 中國農業(yè)科學院博士學位論文 文獻綜述 5 基因的分類 病原細菌在植物體內的特異性識別常常是由單個抗病基因 R 控制?？共』蚴侵富驅蚣僬f中寄主植物與病原無毒基因表現(xiàn)非親和互作的基因，它決定寄主植物對病原菌的?；宰R別并激發(fā)抗病反應。 1992年， 用轉座子標記技術克隆了第一個植物抗病基因玉米的抗 圓斑病基因 1993年克隆了番茄的 因。此后 R 基因的研究取得了重大進展 ( , 1996； , 2000； 2001)。迄今已經(jīng)克隆了 40 多個 R 基因 （ 2003）。 大多數(shù) R 蛋白具有胞間或胞內亮氨酸重復序列 (結構域 ( , 2001； 2001)。 根據(jù)蛋白的結構特征， R 基因編碼的蛋白可分為 5大類：細胞內的蛋白激酶、具有胞外 構的類似受體的蛋白激酶、具有細胞內 R 基因、編碼與細胞膜結合的細胞外 白和毒素還原酶。 具有細胞內 R 基因是最大的一類 R 基因。 顯著的結構特點是有一個數(shù)目可變的 C 端 經(jīng)在多種不同的蛋白中發(fā)現(xiàn) 構域，它是蛋白與蛋白作用、多肽與配基結合、蛋白與碳水化合物結合的功能位點 ( 1997； 1998)；此外，每一個 R 蛋白都包含一個保守的 點，這一位點在其他蛋白中對 結合很重要 ( , 1990)。 蛋白根據(jù) N 端結構特點可分為兩類 : 一類具有與果蠅胞內信號結構域和哺乳動物白介素 體同源的結構域 (目前僅在雙子葉植物中發(fā)現(xiàn)了這類基因，包括擬南芥的 草的 N、亞麻的 基因；另一類包含螺旋 ( ( , 2001； , 2000； , 2001)，由于螺旋 可分為多個亞家族。 蛋白的結構與功能的關系 R 蛋白有兩種功能：（ 1）病原物識別；（ 2）信號傳導，啟動植物的防衛(wèi)反應。 R 蛋白有一個調節(jié)結構來確保它們在信號感應轉導過程中的功能 。 水稻的 因和擬南芥編碼油菜素類固醇受體的 () 基因產(chǎn)物都包含一個 激酶結構域。將 白與 白的結構域部分互換，雜合蛋白中含 有 和 激酶區(qū)，在油菜素類固醇的作用下，雜合蛋白質可激活防衛(wèi)反應（ ， 2000），表明