【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）棉花黃萎病、枯萎病拮抗細(xì)菌的篩選及相關(guān)抗病基因的克隆生化與分子生物學(xué)碩士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 棉花黃萎病、枯萎病拮抗細(xì)菌的篩選及相關(guān)抗病基因的 克隆 of of I 摘 要 棉花 黃萎病、枯萎病是目前最主要的真菌病害 之一 ， 給 世界 棉花產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失 ，且極難防治 。 因此 篩選拮抗菌、克隆抗病相關(guān) 基因、研制 高效 生物農(nóng)藥 具有十分重要的意義 。本實驗從土壤中篩選高效拮抗菌株 ， 克隆細(xì)菌源 棉花 黃萎病、枯萎病的 抗病相關(guān) 基因 ,為構(gòu)建基因工程拮抗菌、制備微生物農(nóng)藥提供技術(shù)平臺 。 從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所黃萎病、枯萎病發(fā)病較輕的 試驗 棉田采集根圍土，利用土壤稀釋分離法從中分離出 21 株細(xì)菌 。 通過平板對峙法，篩選出 5 株 具有自主知識產(chǎn)權(quán)的， 對棉花黃萎病 菌 、枯萎病菌皆具有拮抗活性的細(xì)菌。這 5 株拮抗細(xì)菌 發(fā)酵液對黃萎病 菌 的抑 菌效率分別達(dá)到 21%；對枯萎病 菌 的抑菌效率分別達(dá)到 56%， 1 的拮抗活性比較高，具有作為生防菌應(yīng)用的潛能。 5 株 拮抗 細(xì)菌 經(jīng)過革蘭氏染色 均為陽性細(xì)菌。 利用 16s 術(shù) ， 初步鑒定為 芽孢桿菌 。 經(jīng)過在不同培養(yǎng)條件下對 的測定發(fā)現(xiàn)： 長迅速， 28在 體培養(yǎng)基中2h 即達(dá)到生長對數(shù)期， 30h 后達(dá)到生長最高峰。 15 50范圍內(nèi)均能生長，最適生長溫度為28 。 在 4 9 之間 均能良好生長，最適 為 7。 常見抗生素培養(yǎng)基中不能生長，能耐受 25 g/度的細(xì)胞壁降解酶平板檢測， 發(fā)現(xiàn) 果膠酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基平板上均出現(xiàn)顯著水解圈 。 用 方法測定， 泌的幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、果膠酶、纖維素酶的活性分別達(dá)到 時發(fā)現(xiàn)， 向胞外分泌一些揮發(fā)性的拮抗物質(zhì)。 葡聚糖酶是重要的一類抗菌酶，具有很高的應(yīng)用價值。 根據(jù)已知的葡聚糖酶基因序列設(shè)計葡聚 糖酶特異引物，經(jīng) 增獲得一 700條帶，經(jīng)測序 及上網(wǎng)比對， 該序列與來源于33L 葡聚糖酶基因 具有很高的相似性 ，初步認(rèn)為該片段為葡聚糖酶的部分基因片段 。為了進(jìn)一步獲得拮抗相關(guān)基因，利用 轉(zhuǎn)座子 建 插入突變體庫，通過影印培養(yǎng)，篩選出 3 株抗菌活性顯著下降的突變株，經(jīng)過 證后，從突變株中獲得 一 500序列， 將此序列與 的序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn) 該 片段 與來源于枯草芽孢桿菌的伊枯草桿菌素合成酶 B（ ） 基因片段相似性高達(dá) 99，初步認(rèn)為該 序列 為伊枯草桿菌素合成酶 B 基因片段 。 關(guān)鍵詞 棉花黃萎病 棉花枯萎病 芽孢桿菌 克隆 基因 to be to It is to to In we 21 of of 5, B1 , 21%( 56%， ( 6 1 be as of S6 by 6s S6 It in 5 0 , 8 ; it in pH , pH . S6 t to to 5g/mL pc m. It of is an 700CR to 9%. 6 by 3 of to 9%. 錄 第一章 緒論 . 1 萎病、枯萎病 . 1 黃萎病 . 1 萎病 . 1 花黃萎病、 枯萎病的危害 . 2 黃萎病、枯萎病的傳播途徑 . 3 黃萎病、枯萎病的致病機理 . 3 萎病、枯萎病的 防治 . 3 傳統(tǒng)防治方法 . 3 生物防治 . 4 生防菌抑制病害的機理 . 5 常見生防細(xì)菌芽孢桿菌 . 8 芽孢桿菌 . 8 芽孢桿菌抑制病害的機理 . 8 轉(zhuǎn)座子技術(shù)應(yīng)用于芽孢桿菌 . 10 研究的目的和意義 . 11 術(shù)路線 . 12 第二章 棉花黃萎病、枯萎病拮抗細(xì)菌的篩選及鑒定 . 13 料與試劑 . 13 驗材料 . 13 要實驗儀器 . 13 要試劑 . 13 養(yǎng)基配方 . 14 驗方法 . 14 株的分離純化 . 14 抗細(xì)菌的篩選 . 14 抗菌株發(fā)酵液抑菌效率檢測 . 14 抗細(xì)菌的革蘭氏染色 . 14 6s 定 . 15 果與分析 . 18 菌株的分離、篩選 . 18 拮抗菌株發(fā)酵液的抑菌效率 . 18 拮抗菌的革蘭氏染色 . 18 6 的 16s 定 . 19 論 . 22 第三章 生長特性及拮抗成分初步分析 . 23 料與儀器 . 23 實驗材料 . 23 要使用儀器 . 23 養(yǎng)基 . 23 法 . 24 6 拮抗效率的平板檢測 . 24 6 生長最適溫度的測定 . 24 6 生長曲線的測定 . 24 6 生長最適 測定 . 24 6 的抗生素抗性實驗 . 24 胞壁降解酶檢測 . 24 發(fā)性拮抗物質(zhì)的檢測 . 26 果與 分析 . 26 6 的拮抗效率平板檢測 . 26 6 的生長最適溫度 . 27 6 的生長曲線 . 28 6 的生長最適 . 28 6 對抗生素的抗性 . 29 胞壁降解酶的檢測 . 29 萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 . 30 準(zhǔn)曲線建立 . 30 . 31 胞壁降解酶活性的測定 . 31 發(fā)性拮抗物質(zhì)的檢測 . 31 論 . 32 第四章 葡聚糖酶部分基因的獲得 . 33 料與儀器 . 33 料 . 33 要儀器 . 33 4 驗方法 . 33 6 提取 . 33 聚糖酶基因的特異性擴(kuò)增 . 33 接 . 34 接 . 35 組子的鑒定 . 35 果與分析 . 36 論 . 37 第五章 轉(zhuǎn)座子突變體庫的構(gòu)建及拮抗相關(guān)基因的獲得 . 38 料與試劑 . 38 V 料 . 38 要實驗器材 . 38 養(yǎng)基與抗生素 . 38 驗方法 . 39 粒的提取 . 39 萎病、枯萎病分生孢子懸液的制備 . 39 孢桿菌的轉(zhuǎn)化 . 40 座子突變體庫的構(gòu)建及突變株的篩選 . 40 變株的 證 . 40 抗相關(guān)基因的獲得 . 41 果與分析 . 42 變株的獲得 . 42 證 . 42 論 . 44 第六章 全文結(jié)論 . 46 參考文獻(xiàn) . 47 致 謝 . 53 作 者 簡 歷 . 54 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 黃萎病、枯萎病是世界級的植物病害，它們能感染多種植物，使植物萎蔫致死，且極難防治，因此有“植物癌癥”之稱。每年由于黃萎病、枯萎病給全球造成的經(jīng)濟(jì)損失平均數(shù)十億美元。黃萎病、枯萎病能感染多種植物，其中以對棉花的影響最為嚴(yán)重，造成的經(jīng)濟(jì)損失也最慘重： 1973 年全國感染黃、枯萎病棉田面積為 1977 年發(fā)展為 982 年達(dá)到 入 90 年代，我國黃萎病、枯萎病擴(kuò)展蔓延更是迅速（石磊巖 ， 1998）。 萎病、枯萎病 黃萎病 黃萎病菌屬半知菌叢 梗孢輪枝菌屬。輪枝菌屬包含若干個“種”：黑白輪枝菌（ 大麗輪枝菌（ 三體輪枝菌（ 變黑輪枝菌（ 云狀輪枝菌（ ，賴卡尼輪枝菌（ 。其中，黑白輪枝菌和大麗輪枝菌是引起世界范圍內(nèi)廣泛寄主產(chǎn)生維 管性黃萎病的兩個常見種（陳旭生 ， 1997）（ 馬存 ， 1996） 。 通過田間調(diào)查分析（宋曉軒， 1997）， 感染 黃萎病 的棉花 有三種癥狀類型：（ 1）西瓜皮狀，其特點是 植株 從下部開始發(fā)病，葉片干枯上卷。（ 2）水燙狀，表現(xiàn)為植株頂部 1 2 片葉半邊水燙狀。（ 3）早期落葉型，其特點為植株從中部開始發(fā)病，葉片失水，色變淺，萎蔫下垂，重者干枯下卷，然后落葉，只留生長點，嚴(yán)重者枯死。 萎病 枯萎病是一類植物病害的總稱，因病原菌的侵害，造成植物枯死萎蔫?？菸∮屑?xì)菌性病原 ， 如香蕉細(xì)菌性枯萎病等（郭權(quán)， 1993）， 和真菌性病原兩種（潘光照 ， 1999）。常見的枯萎病 是由鐮刀菌屬 （ 起的世界性植物土傳病害（朱乾浩 ， 1994） ， 其中的尖孢鐮刀菌（ 主要病菌種類之一。 棉花枯萎病從子葉期開始就可發(fā)病，病株矮小，蕾鈴脫落率高，單株結(jié)鈴數(shù)下降，鈴重減輕，棉纖維強度下降，從而影響棉花產(chǎn)量和品質(zhì)。病害嚴(yán)重的 1 2 片真葉時即可造成死苗?，F(xiàn)蕾期發(fā)病高峰時可成片死苗。 感染枯萎病的棉花 癥狀隨環(huán)境條件、棉花品種類型、棉花生育期、病原致病力等因素的不同而異 ，大致可分為 5 種類型： (1)黃色網(wǎng)紋型：其典型癥狀是葉脈導(dǎo)管受枯萎病菌毒素侵害后呈現(xiàn)黃色，而葉肉 仍保持綠色，多發(fā)生于子葉和前期真葉。 (2)黃化型：一般從子葉或真葉邊緣開始，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 葉肉褪色變黃。 (3)紫紅型：一般在早春氣溫低時發(fā)生，蕾期發(fā)病最重 子 葉或真葉的局部或全部呈現(xiàn)紫紅色病斑，嚴(yán)重時葉片脫落。 (4)青枯型：病株在突然失水情況下出現(xiàn)的癥狀，尤其在干旱氣候條件下，遇到驟雨，之后遇高溫強日照，病株葉色深綠，葉片變軟下垂，植株青枯死亡。 (5)皺縮型：葉色深綠，葉肉增厚，葉片皺縮，節(jié)間縮短，植株矮化，常與網(wǎng)紋型和黃化型癥狀并存。 花黃萎病、枯萎病的危害 棉花黃萎病自 1914 年 次在美國發(fā)現(xiàn)以來， 至今已從美國整個植棉帶傳播至亞洲、非洲、拉丁美洲和歐洲等 30 多個主要植棉國家和地區(qū)，給世界造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失：前蘇聯(lián)每年因棉花黃萎病損失皮棉 320 萬擔(dān)左右，美國每年損失皮棉約 210 萬擔(dān)（石磊巖 ，1998）（石磊巖， 1996）。 我國棉花黃萎病在 30 年代就已經(jīng)有了報道， 30 年代至 40 年代棉花黃萎病傳入我國初期，局限于引種美國棉花的局部地區(qū)，以后隨著這些棉種的繁殖、調(diào)運和推廣，病區(qū)逐步擴(kuò)大，發(fā)病日趨嚴(yán)重。至解放初期調(diào)查，棉花黃萎病已擴(kuò)展至十二個省，主要分布于我國北部棉區(qū)的灌溉地與河灘地。解放后 50 多年以來， 隨 著我國棉區(qū)的不斷擴(kuò)大，棉種的調(diào)運、串換頻繁，以及耕作制度的改革，植物檢疫、種子處理和防治工作沒有跟上，黃萎病的蔓延加快了，危害也加深了 （ 1999） ,全國每年因棉花黃、枯萎病損失皮棉產(chǎn)量 10 萬噸。棉花黃、枯萎病在我國大部分棉花病田混生為害，據(jù) 1983 年全國普查，兩病發(fā)生遍及21 個植棉省、自治區(qū)、直轄市的 574 個縣。 1983 年普查時的為害面積為 2223 萬畝，其中絕產(chǎn)面積為 31 萬畝。棉花枯、黃萎病混生的地區(qū)，往往在同一塊地里兩種病害均有發(fā)生，甚至在同一棉株上同時受兩病浸染為害，損失明顯加重， 一般減產(chǎn) 20 30，嚴(yán)重的減產(chǎn) 60以上，甚至無收成，混生病株比無病單株產(chǎn)量下降 37，單株結(jié)鈴數(shù)下降 27，據(jù)估算， 黃、枯 萎病為害的年份，全國每年損失皮棉約 150 200 萬擔(dān)。 表 of 0s 年份 流行面積（萬畝） 流行區(qū)域 1993 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2002 267 160 133 40 80 100 100 300 黃河流域、長江流域棉區(qū) 黃河流域棉區(qū) 黃河流域的冀、魯、豫三省 長江流域棉區(qū) 黃河流域的魯、豫二省 魯西、豫東、蘇北 魯西、豫東、蘇北 黃河流域、長江流域、西北內(nèi)陸棉區(qū) *轉(zhuǎn)引自簡桂良 我國棉花抗黃萎病育種現(xiàn)狀、問題及對策 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 黃萎病、枯萎病的傳播途徑 黃萎病菌主要以微菌核在土壤中越冬，也能在種子中越冬而引發(fā)侵染，帶病種子是遠(yuǎn)距離傳病和病區(qū)迅速擴(kuò)大的重要途徑。發(fā)病適宜溫度為 25 28（王志斌 ， 2006） 。 引發(fā)枯萎病發(fā)生 的 主要原因為種子傳播、糞肥帶菌、土壤帶菌、溫濕度適宜、肥料施用 不當(dāng)、排水不良、地勢低洼等?？菸∫跃z體、分生孢子、后垣孢子在土壤及未腐熟的帶菌綠肥中越冬，種子也可以帶菌。尖孢鐮刀菌的短距離傳播主要是通過灌溉和帶菌的農(nóng)用器具（鄭忠元 ， 2002）。長距離傳播是通過帶菌的種苗和土壤，也可以通過風(fēng)進(jìn)行孢子傳播（ N， 1990） 。 黃萎病、枯萎病的致病機理 隨著社會經(jīng)濟(jì)和科學(xué)的發(fā)展，人們對黃萎病、枯萎病的致病機理研究越來越深入，但是至今為止，尚未得出確切的結(jié)論。目前比較流行的有“堵塞說”和“毒素說”兩種學(xué)說。 堵塞說認(rèn)為，病菌侵入木質(zhì)部導(dǎo)管后，刺激 鄰近細(xì)胞產(chǎn)生一種膠狀物質(zhì)，進(jìn)而堵塞導(dǎo)管，阻礙水分輸送，從而導(dǎo)致葉片萎蔫?；蚴侵虏【旧a(chǎn)生一些粘性物質(zhì)從而堵塞導(dǎo)管，這些物質(zhì)包括：胞外多糖、胞外蛋白、 分泌系統(tǒng)及其輸出產(chǎn)物等（李淑英 ， 2001）（王軍 ， 2005） 。 但1958)等研究表明，正常的次生木質(zhì)部導(dǎo)管潛在的輸水能力已能滿足植株的需求，因而堵塞不應(yīng)是致萎的主要原因。 目前大多數(shù)學(xué)者比較贊同的是毒素說。該學(xué)說認(rèn)為，黃萎病、枯萎病浸染植株后，會分泌某些毒素，該毒素造成浸染植株萎蔫失活（陳 旭升 ， 2001）（袁紅旭 ， 2002）。王賀祥等人研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌酸（ 枯萎病導(dǎo)致棉花萎蔫的重要致病因子（王賀祥等， 1988），它能使寄主細(xì)胞膜透性損害、生理代謝失調(diào)，并可耦合多種酶系統(tǒng)中的銅、鐵、鎂等離子，最終導(dǎo)致植物萎蔫。 研究發(fā)現(xiàn)黃萎病分泌的毒素（ 棉花細(xì)胞質(zhì)膜具有高度親和位點（ 996）。 萎病、枯萎病的防治 傳統(tǒng)防治方法 棉花黃萎病、枯萎病破壞的嚴(yán)重性已經(jīng)引起各國政府和科研部門的重視，各國科學(xué)家從事黃、枯萎病的 防治已有多年，但效果不很理想，特別是黃萎病更是猖獗為害難以防治，其中重要的原因是因為它能以微菌核的休眠結(jié)構(gòu)在土壤中、作物殘體上長期存活達(dá)十幾年之久（鹿秀云 ， 2002）。 為了控制棉花黃萎病、枯萎病的發(fā)生和蔓延，國內(nèi)外研究學(xué)者們開展了許多方法，主要采取常規(guī)育種選育抗病的優(yōu)良品種（王振山 ， 1989）（齊俊生， 2000），噴灑化學(xué)農(nóng)藥（張世平， 1996），農(nóng)業(yè)措施等，這些方法在控制病害、促進(jìn)棉花生產(chǎn)方面起 到 了重要作用。 1培育抗病品種。培育抗病品種是防治黃、枯萎病的主要手段，經(jīng)過多年的研究，已經(jīng)培育出一大批優(yōu)良 的品系，它們的推廣和應(yīng)用對棉花的病害防治起到了重大的作用。但是 抗棉花黃萎中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 4 病、枯萎病品種的選育周期長，耗時費力，不能滿足生產(chǎn)需要， 且 抗性極易喪失 （李淑英 ， 2001） 。 2 化學(xué)防治。多年來，人們研制多種化學(xué)農(nóng)藥向大田噴灑來對棉花黃萎病、枯萎病進(jìn)行防治 。目前 枯萎病能通過化殺法得到一定的控制，但是尚沒有特效藥劑能控制黃萎病。同時，化殺法又帶來了許多嚴(yán)重的問題： 1、化學(xué)農(nóng)藥長期使用會在食物鏈中積累，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。 2、化學(xué)農(nóng)藥是非特異性的，在殺滅病蟲害同時，也會使有益的昆蟲受到毒害，破壞生態(tài)平衡。 3、長期使用 化 學(xué)農(nóng)藥，病菌的抗藥性增強，導(dǎo)致使用頻率和用量逐年增加，形成了惡性循環(huán) （李瓊芳 ，1996）（蔣玉琴， 1994） 。 3農(nóng)業(yè)措施。 農(nóng)業(yè)措施中比較有效的是輪作倒茬，能夠有效的降低土壤中菌量，減少病害發(fā)生 。 但是由于黃、枯萎菌能夠在土壤中存活十幾到幾十年，短期輪作達(dá)不到預(yù)期目的。 生物防治 1 2 2 1 植物病害生物防治的概念 傳統(tǒng)的方法不能從根本上防治 黃萎病、枯萎病 。 目前生物防治 已引起各國科研工作者 的高度關(guān)注。英國植物學(xué)家 任何條件下或借助于任何手段，通過其他生物 （人除外）的作用來減少病原物的生存和活動，從而減少病原物所致病害的發(fā)生（ 1965）。我國是生物防治 歷史 最悠久的國家。早在公元 304年，晉代的南方草木狀一書就有利用 物防治與其他方法相比，具有安全、有效、持久的特點 ， 特別是避免了化學(xué)防治帶來的一系列問題。 1 2 2 2 常用的生防菌 由于植物根部向外分泌混合物，使植物根圍土形成養(yǎng)料豐富、適于微生物生長的特殊環(huán)境，很多有用的生防微生物都是從根圍土中篩選出來。常用的生防菌一般包 括：生防細(xì)菌、生防真菌、生防放線菌。 1生防細(xì)菌。 目前應(yīng)用較多的生防細(xì)菌主要有芽孢桿菌 (、假單胞桿菌(土壤放射桿菌 ( 。自從 1945年 孢桿菌 產(chǎn)生拮抗物質(zhì)以來，人們已從 芽孢桿菌 的不同菌株中分離出幾十種抗菌物質(zhì)，并弄清了這些抗菌物質(zhì)是一類從簡單分子到復(fù)雜化合物即從桿菌肽 ( 大環(huán)脂 ( 到類似噬菌體顆粒等不同成份組成的物質(zhì)，此外，其 中一部分是低分子量的抗菌素 ,也有一些蛋白性的抗菌物質(zhì)。 2生防真菌。 我國真菌制劑的研發(fā)有 30 多年的歷史，在農(nóng)業(yè)上成功應(yīng)用于微生物農(nóng)藥的真菌有白僵菌、綠僵菌、蠟蚧輪枝菌、擬青霉菌、木霉等 ， 其特點是容易生產(chǎn)，且能在病蟲群體中多次感染而引起流行，擴(kuò)大了防治效果 （金衛(wèi)根 ， 2002）。在生防真菌開發(fā)應(yīng)用方面，迄今研究應(yīng)用較多的是木霉屬（ 。 3生防放線菌。自從 1872 年 現(xiàn)放線菌，至今已經(jīng)報道的放線菌有 69 屬 1687 種。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 5 1989 年 出放線菌殺菌劑 商品名為 要用于觀賞植物和溫室蔬菜上的鐮刀菌引起的枯萎病。 生防菌抑制病害的機理 1 2 3 1 誘發(fā)植物抗性 誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性是植物被環(huán)境中的非生物或生物因子激活產(chǎn)生的對隨后的病原菌浸染具有抵抗性的特征。系統(tǒng)抗性的誘導(dǎo)可以使與植物防衛(wèi)有關(guān)的病程相關(guān)蛋白（ ：幾丁質(zhì)酶、 等的活性增加；也會導(dǎo)致一些低分子量的微生物拮抗物質(zhì)如植保素的積累；還會形成其他保護(hù)作用的生物大分子 ，如木質(zhì)素、葡聚糖和富含羥脯氨酸的糖蛋白。植物被誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性后，便具有廣譜抗性。 983 年首次 報道用四種熒光假單胞菌作為誘導(dǎo)劑誘發(fā)植物的系統(tǒng)抗性（趙繼紅， 2003）。 篩選到一株 黃萎病菌株，通過研究發(fā)現(xiàn)它是通過誘導(dǎo)寄主植物的系統(tǒng)抗性來達(dá)到抗病效果（ 2005）。 . 植物受到病害侵入刺激后產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)包括以下幾類： 1植物激素。植物激素是植物體內(nèi)產(chǎn)生的一類生理活性物質(zhì)，在低濃度下就能顯著影響植物的生長，它能使植物各器官互通信息，互相協(xié)調(diào)，從而使整株植物的 生長發(fā)育協(xié)調(diào)一致。目前在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的植物激素有五類：生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸和乙烯 （ 張穗， 2003） 。植物在這些激素的刺激下，提高了其本身對病原菌的抗性。 2植物抗病相關(guān)酶類。根據(jù)研究，植物被黃萎病、枯萎病感染后，其本身會發(fā)生一系列的變化以抵抗病原菌的侵染，體內(nèi)一些與抗病有關(guān)酶類的合成量增加。這些酶包括：過養(yǎng)化物酶（ 苯丙氨酸解氨酶（ 。在被病原菌浸染后，抗病品種與非抗病品種相比，這些酶的活性提高 得 更為顯著。植物對病原物的入侵反應(yīng)，是以酶的催化活動來實現(xiàn)的，苯丙氨酸解氨酶和過氧化物酶在植物抗病反應(yīng)次生代謝中起著重要作用，他們活性的變化引起諸如木質(zhì)素、植保素等抗性物質(zhì)的產(chǎn)生 （ 謝世勇， 2003） 。有研究表明馬鈴薯的 性與抗晚疫病呈正相關(guān) （ 王敬文，1982） 。黃瓜的 性變化與抗黑星病呈密切相關(guān) （ 李淑菊， 1997） 。目前，這些酶在植株中的含量已經(jīng)成為檢測植物抗病能力的方法之一。 3抗真菌蛋白?？拐婢鞍装ǎ海?1）病程相關(guān)蛋白，簡稱 白 。 當(dāng)病源菌浸染植物時細(xì)胞合成并分泌到細(xì)胞間隙的一類低分子量蛋白。（ 2）植物防御素。當(dāng)種子吸水萌發(fā)時，植物防御素立即得到釋放，從而有效保護(hù) 幼苗免受土傳和種傳菌物的危害，其抗菌作用主要表現(xiàn)在對菌物生長的抑制作用。（ 3）核糖體失活蛋白。通過對核糖體大亞基 28s 特異性修飾，使其不能與蛋白合成延長因子結(jié)合，從而組止蛋白質(zhì)的合成。（ 4） 菌機理是改變真菌細(xì)胞壁的通透性。（ 5） 白。抑菌機制為改變細(xì)胞膜的透性從而使病原菌致死。（ 6）植物凝集素。當(dāng)植物或某個組織受昆蟲或病原菌襲擊時，凝集素從受襲擊的細(xì)胞釋放至捕食者的消化道，通過糖結(jié)合活性引發(fā)毒性效應(yīng) （ 金靜， 2003） 。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 6 1 2 2 2 競爭作用 生 防菌與病原菌就營養(yǎng)和生存空間發(fā)生競爭。大量植物促生菌定殖在植物體內(nèi)、外，與病原菌爭奪營養(yǎng)，使病原菌因缺乏營養(yǎng)而受到抑制。研究表明，在一定的空間里，菌落數(shù)是有一定限量的，因此，生防菌與病員菌就生存空間發(fā)生競爭從而達(dá)到抑菌效果。競爭作用已在革蘭氏陰性細(xì)菌如假單胞菌等生防菌株被系統(tǒng)深入研究，它涉及生防微生物在植物根際、體表或體內(nèi)的定殖或內(nèi)生、繁殖和種群建立以及與病原生物的相互作用。 1 2 2 3 拮抗作用 拮抗作用是指微生物產(chǎn)生抗菌物質(zhì)從而抑制有害病原物的生長或發(fā)展或直接殺死病原物。拮抗微生物產(chǎn)生的主要抗菌物質(zhì)包 括一下幾類： 1抗生素 。 抗生素是有微生物產(chǎn)生的具有生物學(xué)活性的物質(zhì)，它在低濃度下就能抑制或影響其他生物的機能 （ 姜成林， 2001） 。生防假單胞菌產(chǎn)生的抗生素包括： 2， 4二乙?；冱S酚（ 2，4 吩嗪 1羧酸（ 1 藤黃綠膿素（ 硝吡咯菌素（ 氰化物（ （ 譚周進(jìn)， 2003） 。芽孢桿菌產(chǎn)生的抗生素一般包括：脂肽菌素族物質(zhì)（ 氨基多肽（ ） ,卡糖胺（ 多肽（ 。 芽孢桿菌 產(chǎn)生的脂肽類抗生素主要有表面活性素（ 伊枯草桿菌素（ 豐原素（ 大類 （ 高學(xué)文， 2003）。 2幾丁質(zhì)酶 。 幾丁質(zhì)又稱為甲殼素或甲殼質(zhì)，是由 N乙酰氨基葡萄糖 ( 1， 4糖苷鍵聚合而成的直鏈大分子，它廣泛分布于大多數(shù)真菌細(xì)胞壁中，幾丁質(zhì)酶是分解幾丁質(zhì)的一類蛋白質(zhì)，能將由 1， 4 N乙酰 D葡聚 糖（ 基組成的幾丁質(zhì)降解為低分子量的丁質(zhì)酶通過降解病原真菌菌絲末端合成的幾丁質(zhì)，從而抑制病原真菌的生長 （ 王焰玲， 1998） 。 根據(jù)幾丁質(zhì)酶催化區(qū)域或氨基酸序列相似性，在糖基水解酶分類系統(tǒng)中將幾丁質(zhì)酶分為兩類： 1991） (1993)(1990)。根據(jù)幾丁質(zhì)酶氨基酸序列特征又可分為 6 類， I、 歸于糖基化水解酶的第 19 族，主要存在于植物中， V 型歸于第 18 族，廣泛存在于病毒、細(xì)菌、真菌、昆蟲、節(jié)肢動物、植物和哺乳動物中，其氨基酸序列與 19 族缺乏同源性。而 N乙酰葡萄糖胺酶被歸于第 20 族（ 1999） 。 微生物產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶種類較多，性質(zhì)差異較大，即使同一微生物產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶也各不相同，但多數(shù)微生物幾丁質(zhì)酶都具有相似的結(jié)構(gòu)域：從 N 端到 C 端依次含有信號肽（ , 幾丁質(zhì)酶 催化域（ , 幾丁質(zhì)結(jié)合域（ 及 C 端區(qū)域。 圖 1微生物幾丁質(zhì)酶的一級結(jié)構(gòu) of 號 肽 幾 丁 質(zhì) 酶 催 化 域 幾 丁 質(zhì) 酶 結(jié) 合 域 C 端區(qū)域 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 7 信號肽：幾丁質(zhì)酶大多是胞外酶。幾丁質(zhì)酶不同，其信號肽的長度及特點也各不相同，但同源性較高的幾丁質(zhì)酶之間，信號肽序列較相似。 催化域：催化域負(fù)責(zé)幾丁質(zhì)的水解，是幾丁質(zhì)酶真正起作用的部位。除了催化 區(qū)在細(xì)菌中具有較高的同源性外，其他結(jié)構(gòu)差異較大（ ， 1998） (1995)(1993)。但是催化域的同源性與菌株的親緣關(guān)系沒有聯(lián)系，即近緣菌株可能具有完全不相同的催化域。 結(jié)合區(qū)：微生物結(jié)合區(qū)主要含有色氨酸殘基 (W)，幾丁質(zhì)酶通過不同的折疊，將結(jié)合區(qū)域中的芳香族氨基酸暴露在分子表面，通過它們實現(xiàn)與幾丁質(zhì)的結(jié)合，因此，結(jié)合區(qū)域中的氨基酸殘基不同，其與底物的結(jié)合方式也各不相同。催化區(qū)域相似的幾丁質(zhì)酶，它們的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域并不一定相似。一般認(rèn)為，幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域主要負(fù)責(zé)與幾丁質(zhì) 結(jié)合，使催化域更好的