包涵體純化方案

包涵體純化方案緩沖液配方：1. 變性復(fù)性緩沖液精品資料緩沖液a：50mmtris-hcl(ph8.5),1mmedta, 100mmnacl,1%tritonx-100緩沖液 b：50mm tris-hcl (ph8.5), 1mm edta, 100mm nacl，1%triton x-100 ，2m 脲素緩沖液 c：50mm tris-hcl (ph8.5), 1mm edta, 100mm nacl，1%triton x-100緩沖液 d：50mm tris-hcl (ph8.5), 1mm edta, 100mm nacl，1%triton x-100 ，2m 鹽酸胍溶解緩沖液e：50mm tris-hcl (ph8.5), 1mm edta, 100mm nacl， 10mm-巰基乙醇 /dtt， 2mm 脫氧膽酸鈉， 8m 脲素復(fù)性緩沖液： 50mm tris-hcl (ph8.5)，100mm nacl，6m/4m/2m脲素,1% 甘氨酸，5% 甘油，0.2%peg，1mm 氧化型谷胱甘肽，1mm 還 原型谷胱甘肽2. 純化緩沖液binding buffer ： 50mm tris-hcl, 100mm nacl, 10mm咪 唑 ， ph8.5 elution buffer ：50mm tris-hcl, 100mm nacl,不同濃度梯度咪唑 , ph8.5具體實(shí)施步驟：1. 大量誘導(dǎo)表達(dá)的菌液7000rpm 離心 10min 。棄上清，用 1pbs 重懸，洗滌菌體細(xì)胞， 7000rpm ，離心 10min 。再用 pbs 重復(fù)洗一遍。離心后留菌體沉淀。2.將菌體細(xì)胞用緩沖液a 重懸，液氮中反復(fù)凍融后，超聲破碎。13000rpm離心10min ，棄上清，收集包涵體沉淀。2. 分別用緩沖液b、c、d 超聲清洗包涵體沉淀。13000rpm離心 10min 收集沉淀。3. 用緩沖液e溶解包涵體，緩慢搖動(dòng)使其緩慢溶解，室溫放置30min ，然后13000rpm離心 10min 。取上清。4. 將上清稀釋至0.1-1.0mg/ml ，裝入透析袋中，放置于梯度復(fù)性緩沖液中，4 緩慢透析 24-36h 。最后在純化binding buffer中透析，確保蛋白穩(wěn)定可溶。5. 對(duì)溶解的包涵體蛋白進(jìn)行親和層析。附注：edta 防止蛋白降解 nacl 一定的鹽離子可降低某些帶電基團(tuán)間的斥力triton x-100除去其他細(xì)菌成分，如膜外蛋白，質(zhì)粒dna 和其他雜質(zhì)脲素，鹽酸胍，洗掉包涵體表面的不溶性雜蛋白 -巰基乙醇 /dtt 作為還原劑打開錯(cuò)配的二硫鍵脫氧膽酸鈉作為離子型去垢劑能促溶蛋白 甘氨酸、甘油促溶peg 可逆修飾折疊中間體的疏水基團(tuán)氧化型和還原型谷胱甘肽促進(jìn)二硫鍵的