第九章 核糖體(ribosome)

.,第九章核糖體,RIBOSOME,.,第九章核糖體(ribosome),核糖體是合成蛋白質的細胞器；核糖體幾乎存在于一切細胞內，不論是原核細胞還是真核細胞。核糖體的類型與結構多聚核糖體與蛋白質的合成反義RNA與核酶,.,第一節(jié)核糖體的類型與結構,核糖體是合成蛋白質的細胞器，其唯一的功能是按照mRNA的指令由氨基酸高效且精確地合成多肽鏈。核糖體的基本類型與成分核糖體的結構核糖體蛋白質與rRNA的功能分析,.,一、核糖體的基本類型與成分,核糖核蛋白體,簡稱核糖體(ribosome)基本類型附著核糖體游離核糖體70S的核糖體80S的核糖體主要成分r蛋白質：40%，核糖體表面rRNA:60%,，核糖體內部發(fā)現(xiàn)核糖體的兩個關鍵技術,.,二、核糖體的結構,結構與功能的分析方法蛋白質合成過程中很多重要步驟與50S核糖體大亞單位相關,.,結構與功能的分析方法,離子交換樹脂可分離純化各種r蛋白；純化的r蛋白與純化的rRNA進行核糖體的重組裝，顯示核糖體中r蛋白與rRNA的結構關系雙向電泳技術可顯示出E.coli核糖體在裝配各階段中，與rRNA結合的蛋白質的類型雙功能的交聯(lián)劑和雙向電泳分離可用于研究r蛋白在結構上的相互關系電鏡負染色與免疫標記技術結合，研究r蛋白在核糖體的亞單位上的定位。對rRNA，特別是對16SrRNA結構的研究70S核糖體的小亞單位中rRNA與全部的r蛋白關系的空間模型,.,同一生物中不同種類的r蛋白的一級結構均不相同，在免疫學上幾乎沒有同源性。不同生物同一種類r蛋白之間具有很高的同源性，并在進化上非常保守。,.,蛋白質結合到rRNA上具有先后層次性。核糖體的重組裝是自我裝配過程二十世紀六十年代初期RobertPerry用紫外微光束破壞活細胞的核仁，發(fā)現(xiàn)破壞了核仁的細胞喪失合成rRNA的能力，這一發(fā)現(xiàn)提示核仁與核糖體的形成有關。后來Perry又發(fā)現(xiàn)低濃度的放線菌素D能夠抑制3H-尿嘧啶摻入rRNA中，而不影響其他種類的RNA合成。顯微放射自顯影也顯示放線菌素D能夠選擇性阻止核仁RNA的合成，表明核仁與rRNA的合成有關。,.,16SrRNA的一級結構是非常保守的16SrRNA的二級結構具有更高的保守性：臂環(huán)結構(stem-loopstructure)rRNA臂環(huán)結構的三級結構模型,.,蛋白質合成過程中很多重要步驟與50S核糖體大亞單位相關,涉及的多數(shù)因子為G蛋白(具有GTPase活性)，核糖體上與之相關位點稱為GTPase相關位點。最近人們成功地制備L11-rRNA復合物的晶體，獲得了其空間結構高分辨率的三維圖象。這一結果證實了前人用各種實驗技術所獲得的種種結論提出直觀、可靠且比人們的預料更為精巧復雜和可能的作用機制，從而為揭開核糖體這一具有30多億年歷史的古老的高度復雜的分子機器的運轉奧秘邁出了極重要的一步。,.,三、核糖體蛋白質與rRNA的功能分析,核糖體上具有一系列與蛋白質合成有關的結合位點與催化位點在蛋白質合成中肽酰轉移酶的活性研究,.,核糖體上具有一系列與蛋白質合成有關的結合位點與催化位點,與mRNA的結合位點與新?lián)饺氲陌滨?tRNA的結合位點氨?；稽c，又稱A位點與延伸中的肽酰-tRNA的結合位點肽?；稽c，又稱P位點肽酰轉移后與即將釋放的tRNA的結合位點E位點(exitsite)與肽酰tRNA從A位點轉移到P位點有關的轉移酶(即延伸因子EF-G)的結合位點肽酰轉移酶的催化位點與蛋白質合成有關的其它起始因子、延伸因子和終止因子的結合位點,.,核糖體上具有一系列與蛋白質合成有關的結合位點與催化位點,與mRNA的結合位點與新?lián)饺氲陌滨?tRNA的結合位點氨?；稽c，又稱A位點與延伸中的肽酰-tRNA的結合位點肽?；稽c，又稱P位點肽酰轉移后與即將釋放的tRNA的結合位點E位點(exitsite)與肽酰tRNA從A位點轉移到P位點有關的轉移酶(即延伸因子EF-G)的結合位點肽酰轉移酶的催化位點與蛋白質合成有關的其它起始因子、延伸因子和終止因子的結合位點,.,在蛋白質合成中肽酰轉移酶的活性研究,核糖體蛋白在核糖體中rRNA是起主要作用的結構成分r蛋白質的主要功能,.,核糖體蛋白,很難確定哪一種蛋白具有催化功能：在E.coli中核糖體蛋白突變甚至缺失對蛋白質合成并沒有表現(xiàn)出“全”或“無”的影響。多數(shù)抗蛋白質合成抑制劑的突變株，并非由于r蛋白的基因突變而往往是rRNA基因突變。在整個進化過程中rRNA的結構比核糖體蛋白的結構具有更高的保守性。,.,在核糖體中rRNA是起主要作用的結構成分,具有肽酰轉移酶的活性；為tRNA提供結合位點(A位點、P位點和E位點)；為多種蛋白質合成因子提供結合位點；在蛋白質合成起始時參與同mRNA選擇性地結合以及在肽鏈的延伸中與mRNA結合；核糖體大小亞單位的結合、校正閱讀(proofreading)、無意義鏈或框架漂移的校正、以及抗菌素的作用等都與rRNA有關。,.,r蛋白質的主要功能,對rRNA折疊成有功能的三維結構是十分重要的；在蛋白質合成中,某些r蛋白可能對核糖體的構象起“微調”作用；在核糖體的結合位點上甚至可能在催化作用中,核糖體蛋白與rRNA共同行使功能。,.,第二節(jié)聚核糖體與蛋白質的合成,多聚核糖體(polyribosome或polysome)蛋白質的合成蛋白質合成的起始(initiation)、多肽鏈的延伸(elongation)、終止(termination)RNA在生命起源中的地位及其演化過程,.,一、多聚核糖體(polyribosome或polysome),概念核糖體在細胞內并不是單個獨立地執(zhí)行功能，而是由多個甚至幾十個核糖體串連在一條mRNA分子上高效地進行肽鏈的合成，這種具有特殊功能與形態(tài)結構的核糖體與mRNA的聚合體稱為多聚核糖體。多聚核糖體的生物學意義細胞內各種多肽的合成，不論其分子量的大小或是mRNA的長短如何，單位時間內所合成的多肽分子數(shù)目都大體相等。以多聚核糖體的形式進行多肽合成，對mRNA的利用及對其濃度的調控更為經(jīng)濟和有效。,.,三、RNA在生命起源中的地位及其演化過程,生命是自我復制的體系DNA代替了RNA的遺傳信息功能蛋白質取代了絕大部分RNA酶的功能,.,生命是自我復制的體系,三種生物大分子，只有RNA既具有信息載體功能又具有酶的催化功能。因此，推測RNA可能是生命起源中最早的生物大分子。核酶(ribosome)：具有催化作用的RNA。由RNA催化產(chǎn)生了蛋白質,.,DNA代替了RNA的遺傳信息功能,DNA雙鏈比RNA單鏈穩(wěn)定；DNA鏈中胸腺嘧啶代替了RNA鏈中的尿嘧啶，使之易于修復。,.,蛋白質取代了絕大部分RNA酶的功能,蛋白質化學結構的多樣性與構象的多變性；與RNA相比，蛋白質能更為有效地催化多種生化反應，并提供更為復雜的細胞結構成分，逐漸演化成今天的細胞。,核糖體的類型按存在的部位:有三種類型核糖體，細胞質核糖體、線粒體核糖體、葉綠體核糖體。按存在的生物類型:分為兩種類型，即真核生物核糖體和原核生物核糖體。原核細胞的核糖體較小，沉降系數(shù)為70S，相對分子質量為2.5x103kDa，由50S和30S兩個亞基組成；而真核細胞的核糖體體積較大，沉降系數(shù)是80S，相對分子質量為3.94.5x103kDa，由60S和40S兩個亞基組成。,從兩個不同角度觀察的E.coli核糖體的三維結構,Mg2+的濃度對于大小亞基的聚合和解離有很大的影響，體外實驗表明:70S核糖體在Mg2+的濃度小于1mmol/L的溶液中易解離；當Mg2+濃度大于10mmol/L，兩個核糖體通常形成100S的二聚體；在低濃度的Mg2時，完整的核糖體將分成大小兩個亞基。,不同類型核糖體的大小比較,原核生物與真核生物核糖體成分的比較,典型的原核細胞和真核細胞質核糖體的化學組成,.,發(fā)現(xiàn)核糖體及核糖體功能鑒定的兩個關鍵技術,核糖體最早是AlbertClaude于1930s后期用暗視野顯微鏡觀察細胞的勻漿物時發(fā)現(xiàn)的，當時稱為微體(Microsomes)，直到1950s中期，GeorgePalade在電子顯微鏡下觀察到這種顆粒的存在。并進一步研究發(fā)現(xiàn)多種生物的細胞質中有類似的顆粒存在，尤其在進行蛋白質合成的細胞中特別多；PhilipSiekevitz用亞細胞組份分離技術分離了這種顆粒，并發(fā)現(xiàn)這些顆?？偸前殡S內質網(wǎng)微粒體一起沉積。化學分析揭示，這種微粒富含核苷酸，隨之命名為ribosome，主要成分是核糖體RNA(rRNA)，約占60%、蛋白質(r蛋白質)約占40%。核糖體的蛋白質合成功能是通過放射性標記實驗發(fā)現(xiàn)的。將細胞與放射性標記的氨基酸短暫接觸后進行勻漿，然后分級分離，發(fā)現(xiàn)在微粒體部分有大量新合成的放射性標記的蛋白質。后將微粒體部分進一步分離，得到核糖體和膜微粒，這一實驗結果表明核糖體與蛋白質合成有關。兩個關鍵技術是亞細胞組份分離技術和放射性標記技術。,E.coli核糖體小亞單位中rRNA與r蛋白的相互關系示意圖線條表示相互作用及作用力的強（粗線）與弱（細線）（引自Albertsetal，1989）,核糖體蛋白通過電泳和層析等技術，已經(jīng)鑒定了E.coli核糖體小亞基的21種蛋白質和大亞基的34種蛋白質。小亞基的蛋白分別命名為S1S21，大亞基的核糖體蛋白命名為L1L33。核糖體中的蛋白質除了一種具有四個拷貝外，其余都是一個拷貝。圖示為E.coli小亞基21種蛋白質的排列。,E.coli核糖體結構模型,E.coli小亞基的裝配圖粗箭頭表示結合力強，細箭頭表示力弱。如S4與16SrRNA之間是粗箭頭，表示S4可直接與16SrRNA結合而不需要其他蛋白的存在。而S7與16SrRNA的結合力很弱，并且需要S4、S8、S9、S19、S20蛋白的存在。,自組裝(self-assembly):1968年，MasayasuNomura把拆開的大腸桿菌核糖體的30S小亞基的21種蛋白質與16SrRNA在體外混合后重新裝配成30S小亞基，然后把重建的小亞基同50S大亞基以及其他輔助因子混合后，進行蛋白質合成實驗，發(fā)現(xiàn)重建的核糖體具有生物活性，能催化氨基酸摻入到蛋白質多肽鏈中。這一實驗表明，核糖體是一種自組裝(self-assembly)的結構，即沒有樣板或親體結構所組成的結構。但是在組裝過程中，某些蛋白質必須首先結合到rRNA上，其他蛋白才能組裝上去，即組裝過程有先后層次,有人用核糖體重組實驗得到一些重要的結論：30S亞基的蛋白質專同16SrRNA結合;50S亞基的蛋白質只同23SrRNA結合，如果把30S亞基rRNA和50S亞基的蛋白質相混合，則不能裝配成有功能的亞基。從不同種細菌提取30S亞基的rRNA和蛋白質，可裝配成有功能的30S亞基，這表明不存在種間差異。原核生物核糖體與真核生物核糖體的亞基彼此不同，由二者的rRNA和蛋白質重組后的核糖體沒有功能。大腸桿菌的核糖體與玉米葉綠體核糖體亞基重組后具有功能。由于不同生物的線粒體核糖體大小不同，由55S到80S不等，而原核生物的核糖體基本穩(wěn)定，所以線粒體的核糖體亞基同原核生物核糖體亞基相互交換形成的雜合核糖體沒有功能。,E.coli（a）核糖體小亞單位中的部分r蛋白與rRNA的結合位點）（b）及其在小亞單位上的部位（引自Albertetal.，1989，圖a;Lewin,1997,圖b）,核糖體小亞單位rRNA的二級結構(a)E.coli16SrRNA；（紅色為高度保守區(qū)）(b)酵母菌18SrRNA，它們都具有類似的40個臂環(huán)結構(圖中140)，其長度和位置往往非常保守；P、E分別代表僅在原核或真核細胞中存在的rRNA的二級結構。(Darnelletal.，1990),核糖體rRNAHarryHoller測定了E.coli16SrRNA序列，一共有1542個核苷酸。通過計算機分析，發(fā)現(xiàn)不同生物來源的16SrRNA的序列組成具有進化上的保守性。推測16SrRNA結構有四個結構域，每個結構域都有46%的堿基配對，形成螺旋的柄狀結構。每一個柄狀結構都很短，不到8bp，且并不都是完全配對的。16SrRNA的電子顯微照片的形態(tài)與30S核糖體亞基相似，因此認為30S核糖體亞基的形態(tài)主要是由16SrRNA決定的。折疊主要是由序列中互補堿基配對引起的,SD序列(SDsequence)典型的細菌核糖體與mRNA的結合位點，mRNA中的SD序列與核糖體16SrRNA3端互補。在SD序列的下游510個堿基處是起始密碼AUG或GUG。在原核生物中,核糖體中與mRNA結合位點位于16SrRNA的3端,mRNA中與核糖體16SrRNA結合的序列稱為SD序列(SDsequence),它是1974年由J.Shine和L.Dalgarno發(fā)現(xiàn)的,故此而命名。SD序列是mRNA中5端富含嘌呤的短核苷酸序列,一般位于mRNA的起始密碼AUG的上游510個堿基處,并且同16SrRNA3端的序列互補。,L11-rRNA復合物的三維結構(引自Porseet.al.,1999),在蛋白質合成過程中，同一條mRNA分子能夠同多個核糖體結合，同時合成若干條蛋白質多肽鏈，結合在同一條mRNA上的核糖體就稱為多聚核糖體(polysome或polyribosomes),圖中所示是蠶的絲心蛋白mRNA3端多聚核糖體，箭頭所示是絲心蛋白多肽；多聚核糖體形成的意義何在:同一條mRNA被多個核糖體同時翻譯成蛋白質，大大提高了蛋白質合成的速率，更重要的是減輕了細胞核的負荷，減少了基因的拷貝數(shù)，也也減輕了細胞核進行基因轉錄和加工的壓力。,多聚核糖體的形成在mRNA的起始密碼子部位，核糖體亞基裝配成完整的起始復合物，然后向mRNA的3端移動，直到到達終止密碼子處。當?shù)谝粋€核糖體離開起始密碼子后，空出的起始密碼子的位置足夠與另一個核糖體結合時，第二個核糖體的小亞基就會結合上來，并裝配成完整的起始復合物，開始蛋白質的合成。同樣，第三個核糖體、第四個核糖體、依次結合到mRNA上。根據(jù)電子顯微照片推算，多聚核糖體中，每個核糖體間相隔約80個核苷酸。,A位點(Asite)即氨酰基位點，是與新?lián)饺氲陌滨RNA(aminoacyl-tRNA)結合的位點,又叫受位(entrysite)，主要位于大亞基，是接受氨酰tRNA的部位；P位點(Psite)即肽酰tRNA位點(peptidyl-tRNAsite),又叫供位(donorsite),或肽?；稽c,主要位于大亞基,是肽基tRNA移交肽鏈后肽酰tRNA所占據(jù)的位置,即與延伸中的肽酰tRNA結合位點；E位點(exitsite,Esite)E位點是脫氨酰tRNA(deaminoacyl-tRNA)離開A位點到完全從核糖體釋放出來的一個中間?？奎c,只是作暫時的停留。當E位點被占據(jù)之后,A位點同氨酰tRNA的親和力降低,防止了氨酰tRNA的結合,直到核糖體準備就緒,E位點騰空,才會接受下一個氨酰tRNA。,如何根據(jù)嘌呤霉素實驗的結果判斷核糖體中的A、P是兩個分開的獨立位點:在第一組實驗中，只有起始tRNA占據(jù)P位，如果A位點是一個獨立位點的話，此時的A位點就是空閑的，嘌呤霉素當然能夠結合上去，如果A位點與P位點是同一位點，那么嘌呤霉素就不能與核糖體結合，實驗結果是嘌呤霉素能夠結合；在第二組實驗中，由于A位點已經(jīng)被二肽酰tRNA占據(jù)，所以嘌呤霉素無法與A位點結合，只有加入延伸因子和GTP后，使A位點騰空，嘌呤霉素才能結合到核糖體上。因此兩根據(jù)這兩組實驗結果可以斷定A、P是兩個獨立的功能位點。,IRES進入位點：真核生物蛋白質合成的起始，IRES是內部核糖體進入位點(internalribosomeentrysite)；mRNA結合位點真核生物的mRNA同核糖體的結合主要靠5端的帽子結構，有時也通過IRES同核糖體結合,蛋白質合成的基本過程蛋白質合成，或稱mRNA翻譯是細胞中最復雜的合成活動。蛋白質的合成需要攜帶氨基酸的各種tRNA、核糖體、mRNA、不同功能的蛋白質、陽離子、GTP等的參與。蛋白質合成過程之所以復雜，是因為構成蛋白質的20種氨基酸要按照密碼精確地摻入到多肽中，不能有絲毫的差錯。蛋白質的合成，是三種不同類型的RNA通力合作的結果,在核糖體上合成多肽鏈，分為三個完全不同的過程:鏈的起始、鏈的延伸、鏈的終止,蛋白質合成的起始(initiation)蛋白質合成的起始涉及到mRNA、起始tRNA和核糖體小亞基之間的相互作用，最后裝配成完整的核糖體，起始過程分三步完成；起始過程涉及多步反應，在原核生物中需要三個起始因子，在真核生物中涉及多個起始因子；參與的因子包括起始因子1-3，以及mRNA、轉運tRNA、GTP等,多肽鏈的延伸(elongation)一旦起始復合物形成，蛋白質的合成隨即開始，此過程稱為蛋白質合成的延伸。延伸涉及四個重復的步驟氨酰tRNA進入核糖體的A位點；肽鍵形成；轉位;脫氨酰tRNA釋放。上述四步的循環(huán)，使肽鏈不斷延長。在整個過程中，需要GTP和一些延長因子的參與,終止(termination)蛋白質合成的終止是指核糖體沿著mRNA移動，如果進入A位的是終止密碼子，由于沒有與之匹配的反密碼子，而終止蛋白質的合成。一共有三種終止密碼子:UAA、UAG、UGA，其中任何一種進入A位都會終止蛋白質的合成，并導致多肽鏈從核糖體釋放出來，原核細胞使用幾種不同的釋放因子與終止密碼子作用，而真核細胞中所有的終止密碼子都是與相同的釋放因子作用。,在肽鏈延伸過程中tRNA的轉位是是如何進行的?（答案）答:通過足跡法(footprinting)分析，揭示在蛋白質合成的延伸循環(huán)中，tRNA的轉位是分兩步進行的，并且相互獨立(圖Q6-1)。肽鍵的形成引起新形成的肽酰tRNA大亞基的受體部分從A位向P位偏移，而它的小亞基的反密碼子部分仍然與A位的密碼子相連(此時的狀態(tài)稱為A/P結合狀態(tài))。新形成脫氨酰tRNA的受體從大亞基的P位向E位偏移，而它的反密碼子部分仍然在小亞基的P位，此時的狀態(tài)稱為P/E結合狀態(tài)；核糖體與EF-G-tRNA復合物結合，引起這些tRNA的反密碼子的末端與它們結合的mRNA一起相對于小亞基移動，使得肽酰-tRNA完全占據(jù)大、小亞基的P位點(P/P結合狀態(tài))，而脫氨酰tRNA則完全移到大亞基的E位點。,.,附錄：反義RNA與核酶,小分子RNA與反義RNA核酶內含子的切除:核酶的作用機理RNA編輯,.,小分子RNA與反義RNA,小分子RNA的類型真核生物中，除了mRNA，rRNA和tRNA外，細胞核和細胞質中含有許多其它類型的小分子RNA(smallRNA),雖然它們的相對分子質量很小,但卻有非常重要的作用;反義RNA與蛋白質合成的抑制反義RNA(antisenseRNA)是指與mRNA互補的RNA分子,也包括與其它RNA互補的RNA分子，原核細胞中反義RNA作用方式的不同分為三類：I類反義RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和/或編碼區(qū)；類反義RNA與mRNA的SD序列的上游非編碼區(qū)結合，從而抑制靶mRNA的翻譯功能；類反義RNA可直接抑制靶mRNA的轉錄。snRNA在pre-rRNA加工中的作用轉錄后的加工中,由這種RNP將5端的轉錄物切除。反義snRNA長度為1021個核苷酸，并且能夠與rRNA轉錄物的特定序列互補，所以屬于反義snRNA。,.,核酶,核酶的發(fā)現(xiàn)內含子切除是由26SrRNA前體自身催化的，而不是蛋白質。50S核糖體中23SrRNA的核酶活性肽酰轉移酶是催化肽鍵形成的酶。核酶的組成分類RNA和蛋白質復合物的核糖核酸P(ribonucleaseP)；小分子的RNA各種具有催化作用的小分子RNA，能夠進行分子內自我切割反應，且不需蛋白質參與；、型內含子,.,內含子的切除:核酶的作用機理,內含子的切除:核酶的作用機理除了rRNA前體中有內含子,tRNA和mRNA前體中都有內含子的存在,這些內含子都要通過加工被切除,才能得到成熟的rRNA、tRNA或mRNA。雖然這些RNA中內含子切除的機理各不相同,但都涉及到核酶的作用。外顯子重新連接成一個成熟的mRNA的過程稱為RNA剪接(RNAsplicing)I型內含子(groupIintron)和II型內含子(groupIIintrons)的剪接,.,RNA編輯,RNA編輯的意義RNA編輯是基因轉錄后在mRNA中插入、缺失或核苷酸的替換而改變DNA模板來源的遺傳信息，翻譯出多種氨基酸序列不同的蛋白質，RNA編輯的結果不僅擴大了遺傳信息，而且使生物更好地適應生存環(huán)境。向導RNA(guideRNA,gRNAs)在編輯中的作用在編輯時,形成一個編輯體(editosome),以gRNAs內部的序列作為模板進行轉錄物的校正,同時產(chǎn)生編輯的mRNA。gRNA3端的oligo(U)尾可作為被添加的U的供體。,小分子RNA(smallRNA)小分子RNAmicroRNA。MicroRNAs(miRNAs)是一種大小約2123個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關。據(jù)推測，這些非編碼小分子RNA（miRNAs）參與調控基因表達，但其機制區(qū)別于siRNA介導的mRNA降解。第一個被確認的miRNA是在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4和let-7，隨后多個研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個miRNAs。,小分子RNA(smallRNA)存在于真核生物細胞核和細胞質中，它們的長度為100到300個堿基(酵母中最長的約1000個堿基)。多的每個細胞中可含有105106個這種RNA分子，少的則不可直接檢測到,它們由RNA聚合酶或RNA聚合酶所合成,其中某些象mRNA一樣可被加帽。主要有兩種類型的小分子RNA:一類是snRNA(smallnuclearRNA),存在于細胞核中；另一類是scRNA(smallcytoplasmicRNA)，存在于細胞質中。Comparisonofgenesilencingsystematanewtranscriptionlevelwiththatataconventionalpost-transcriptionlevel,PrimarymiRNAtranscriptsareprocessedtomiRNAprecursorsinthenucleusbytheRNase-III-likeenzymeDrosha.ThemiRNAprecursorissubsequentlyexportedtothecytoplasmbymeansoftheexportreceptorexportin-5.ThemiRNAprecursorisfurtherprocessedbyDicertosiRNA-duplex-likeintermediates.TheduplexisunwoundwhileassemblingintomiRNP/RISC.MaturemiRNAsbindtoAgoproteins,whichmediatetranslationalrepressionorcleavageoftargetmRNAs.OthersourcesoflongdsRNAinthecytoplasmofacellareviralRNAs,artificiallyintroduceddsRNA,dsRNAsgeneratedbyRdRPs,andgenomicsenseandantisensetranscripts.LikemiRNAprecursors,longdsRNAisprocessedbytheRNaseIIIenzymeDicerinto2123nucleotidedsRNAintermediates.AssistedbytheRNAhelicaseArmitageandR2D2,thesingle-strandedsiRNA-containingRISCisformed.ThestabilityofthedsRNAanditsrecognitionbyDicercanberegulatedbyspecificADARsandtheexonucleaseERI-1.,pre-rRNA的修飾(a)在pre-rRNA分子中最常見的修飾是將尿苷轉變成假尿苷和在核糖的2位進行甲基化。為了將尿苷轉變成假尿苷，必須切開N1-C1鍵,并將尿嘧啶環(huán)旋轉1800,使C5與核糖的C1共價連接；(b)U20snRNA與部分pre-rRNA形成部分雙鏈,導致2核糖甲基化。在任何情況下,甲基化的部位都是與snoRNA氫鍵連接的pre-rRNA第五位的尿嘧啶(從snoRNAD盒開始)，D盒是snRNA中含有固定的CUGA的序列部分,它的作用是指導pre-rRNA的甲基化；(c)U80snRNA與pre-rRNA形成部分雙鏈,指導將尿苷轉變成假尿苷()。假尿苷的形成也是在固定的位置,同snoRNA的發(fā)夾結構有關。指導假尿苷形成的snoRNA都有相同的3末端:ACA。,四膜蟲26SrRNA前體內含子的二級結構以及內含子、外顯子的剪接點(如箭頭所指):核酶的發(fā)現(xiàn):1981年，ThomasCech和他的同事在研究四膜蟲的26SrRNA前體加工去除基因內含子時獲得一個驚奇的發(fā)現(xiàn)內含子的切除反應發(fā)生在僅含有核苷酸和純化的26SrRNA前體而不含有任何蛋白質催化劑的溶液中，可能的解釋只能是:內含子切除是由26SrRNA前體自身催化的，而不是蛋白質:核酶的證實:為了證明這一發(fā)現(xiàn)，他們將編碼26SrRNA前體DNA克隆到細菌中并在無細胞系統(tǒng)中轉錄成26SrRNA前體分子。結果發(fā)現(xiàn)這種人工制備的26SrRNA前體分子在沒有任何蛋白質催化劑存在的情況下，切除了前體分子中的內含子。這種現(xiàn)象稱為自我剪接(self-splicing),肽酰轉移酶(peptidyltransferase)肽酰轉移酶是催化肽鍵形成的酶。在蛋白質合成過程中，它催化核糖體A位tRNA上末端氨基酸的氨基與P位肽酰-tRNA上氨基酸的羧基間形成肽鍵。其結果,使A位的氨酰-tRNA上的多肽延長了一個氨基酸,而