生物技術制藥復習題

生物技術制藥復習題第一章 緒論第一節(jié) 生物技術的發(fā)展史1、生物技術：以生命科學為基礎，利用生物體的特性和功能，設計構建具有與其性狀的新物種或新品系，并與工程結合，利用這樣的新物種進行加工生產，為社會提供商品服務的一個綜合性技術體系。它的范疇：基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程、生化工程?；蚬こ淌巧锛夹g的核心。P12、蛋白質工程-第二代基因工程；海洋生物技術-第三代生物技術P13、生物技術發(fā)展史：傳統(tǒng)、近代（抗生素、發(fā)酵罐）、現代（DNA重組）P31974年，Boyer和Cohen建立了DNA重組技術1975年，Koher 和 Milstein 建立了單克隆抗體技術1982年，第一個基因工程藥物重組人胰島素被批準上市1989年，我國第一個基因工程藥物干擾素批準上市2003年，中國的重組腺病毒-p53注射液成為石階上第一個正式批準的基因治療藥物。第二節(jié) 生物技術藥物1、生物技術制藥：生物技術制藥：采用現代生物技術人為地創(chuàng)造一些條件，借助某些微生物、植物或動物來生產所需的醫(yī)藥品。P42、生物技術藥物：采用DNA重組技術活其他生物技術研制的蛋白質或核酸類藥物。它與天然生化藥物、微生物藥物、海洋藥物和生物制品共同歸為生物藥物。3、現代生物藥物分為4類：重組DNA技術制造的基因重組多肽、蛋白質類治療劑；基因藥物；天然藥物；合成與部分合成藥物。4、生物藥物按用途分為：治療藥物；預防藥物；診斷藥物。5、生物技術藥物的特征：（1）分子結構復雜；（2）具有種屬特異性；（3）治療針對性強、療效高；（4）穩(wěn)定性差（5）基因穩(wěn)定性；（6）免疫原性；（7）體內半衰期短；（8）受體效應；（9）多效性和網絡性效應；（10）檢驗的特殊性。第三節(jié) 生物技術制藥1、生物技術制藥的特征：高技術、高投入、長周期、高風險、高收益。P52、生物技術在制藥中的應用有哪些？P7（1）基因工程制藥： 開發(fā)基因工程藥物，如干擾素（IFN）、紅細胞生成素（EPO）等 基因工程疫苗，如乙肝基因工程疫苗 基因工程抗體，它可以作為導向藥物的載體 基因診斷與基因治療應用基因工程技術建立新藥的篩選模型 應用極影工程激活素改良菌種，產生新的微生物藥物 改進藥物生產工藝 利用轉基因動、植物生產蛋白質類藥物。（2）細胞工程制藥單克隆抗體技術 動物細胞培養(yǎng) 植物細胞培養(yǎng)生產次級代謝產物。（3）酶工程制藥 ：酶與細胞的固定化及酶轉化制藥（4）發(fā)酵工程制藥：發(fā)酵工藝改進、新藥研制、菌種改造。第二章 基因工程制藥第一節(jié) 概述（略）第二節(jié) 基因工程藥物的生產過程P151、基因工程技術：將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉入新的宿主細胞，構建成工程菌(或細胞），實現遺傳物質的重新組合，并使目的基因在工程菌內進行復制和表達的技術。2、基因工程藥物制造的主要程序 （過程）（重點和后面幾節(jié)聯系起來）（1）目的基因的克?。ǚ蛛x目的基因）：通過逆轉錄、反轉錄-聚合酶鏈式反應、化學合成方法來制備cDNA，再通過核酸探針雜交或免疫反應來篩選目的基因（2）目的基因與載體連接構建DNA重組體：通過限制性內切酶DNA連接酶等核酸酶，把目的基因組入載體的相關克隆位點，常用的載體有質粒載體和噬菌體載體（3）將DNA重組體轉入宿主菌構建工程菌：常用的宿主菌有大腸桿菌、酵母菌等，先使宿主菌處于感受態(tài)，再通過轉化、轉導等方式把重組DNA導入宿主菌，以構建工程菌（4）工程菌發(fā)酵：提供適當的培養(yǎng)基、反應器、控制好發(fā)酵過程中的各種參數，如溫度、PH、溶氧等，并通過升溫來誘導產物表達（5）目的基因表達產物的分離純化：通過固液分離、初步純化、高度純化、成品加工來制備產品；若是胞內產物需要細胞破碎，若是包涵體則需要變性和復性（6）產品的檢驗：檢測產品的質量和性能 。第三節(jié) 目的基因的獲得1、利用基因工程生產蛋白質或多肽需要得到其基因，制備目的基因常用的方法有哪些？P16 （1）逆轉錄法 以mRNA為模板，經逆轉錄的到cDNA，構建cDNA文庫，從cDNA文庫中篩選目的基因。由于RNA轉錄加工過程中，內含子序列已被剪切掉，因此，cDNA文庫中無內含子，適于在原核系統(tǒng)中表達。但是，cDNA只包含蛋白質的結構基因部分，缺少有關的調控序列，因此在原核系統(tǒng)中表達，還需要根據表達載體的結構，配以相應的調控序列。 （2）利用反轉錄-聚合酶鏈式反應制備基因 （3）化學合成法：只適用于克隆小分子肽的基因 2、利用逆轉錄法獲得目的基因的基本過程P16 （1）mRNA的純化 ：從表達目的基因的細胞中提取總RNA，用寡聚脫氧胸苷（dT）纖維素柱從總RNA中提取純化mRNA。 （2）cDNA的合成 ：以mRNA為模板，利用逆轉錄酶合成cDNA第一鏈，再用DNA聚合酶合成cDNA的雙鏈。（3）cDNA克隆：利用合適的連接方法，將產生的雙鏈cDNA片段插入到合適的載體中。 （4）構建cDNA文庫 ：將cDNA與載體連接的重組體轉入大腸桿菌中，產生的克隆群體為cDNA文庫。 （5）從cDNA文庫中篩選目的基因 ：得到cDNA文庫后，通常采用核酸探針雜交法和免疫反應鑒定法從數以萬計的DNA片段中篩選出目的基因。3、載體分為：表達型載體和非表達型載體。P17第四節(jié) 基因表達1、基因表達：指結構基因在生物體中的轉錄、翻譯以及所有加工過程。P202、基因高效表達研究：指外源基因在某種細胞中的表達活動，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個基因表達體系中，使其能獲得原生物活性又可高產的表達產物。P203、基因表達的微生物宿主細胞分為兩大類：P21第一類為原核細胞（常用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等）； 大腸桿菌（目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達體系）：表達基因產物形式多樣，大腸桿菌中的表達不存在信號肽，產品多為胞內產物，提取困難。因分泌能力不足，真核蛋白質常形成不溶性的包含體，表達產物需經變性復性才恢復活性。蛋白質不能糖基化。產物蛋白質N端多余一個蛋氨酸殘基。其內毒素很難除去?？莶菅堪麠U菌：分泌能力強，蛋白質不形成包含體。產物蛋白質不能糖基化。有很強的胞外蛋白酶對產物降解。鏈霉菌：作為外源性基因表達受到重視。不致病、使用安全、分泌能力強、表達產物可糖基化。第二類為真核細胞（常用的真核微生物有酵母、絲狀真菌等） 酵母：酵母菌是研究基因表達最有效的單細胞真核微生物。其基因組小，世代時間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無毒性。能外分泌，產物可糖基化。已有不少真核基因成功表達絲狀真菌：分泌能力強，能正確進行翻譯后加工（肽剪切糖基化）有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。4、目前使用最廣泛的宿主菌是大腸桿菌和釀酒酵母。P225、大腸桿菌基因表達載體P23（1）pBV220系統(tǒng)pBV220系統(tǒng)國內使用最多的載體,其組成：來源于pUC8多克隆位點；核糖體rrnB基因終止信號；pBR322第42253735位；pUC18第2066680位；噬菌體cIts857抑制子基因及PR啟動子；pRC23的PL啟動子及SD序列（2）pET系統(tǒng)6、影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素P22外源基因表達產量與細胞濃度和細胞表達產量呈正相關。單個細胞產量取決于：（1）外源基因的劑量 ：一般來說細菌內基因拷貝數增加，基因的表達產物也增加。 （2）外源基因的表達效率 啟動子的強弱： 啟動子是在轉錄水平上影響基因表達的因素。需要尋找強的啟動子。 核糖體結合位點的有效性：大腸桿菌核糖體結合位點對真核基因在細菌中的高效表達是十分重要的。 SD 序列和起始密碼ATG的間距 ：表達非融合蛋白的關鍵是原核SD序列和真核起始密碼ATG之間的距離，距離過長過短都影響真核基因的表達。 密碼子組成：應選擇使用大腸桿菌偏愛的密碼子。 （3）表達產物的穩(wěn)定性： （4）細胞的代謝負荷 ：必須使宿主細胞的代謝負荷不至過重，又能高效表達出外源基因產物。 （5）工程菌的培養(yǎng)條件 外源基因的高水平表達，不僅涉及宿主、載體和克隆基因三者之間的相互關系，而且與其所處的環(huán)境條件息息相關，必須進行優(yōu)化。 7、真核基因在大腸桿菌中的表達形式P26以融合蛋白的形式表達藥物基因 以原核多肽和真核蛋白結合在一起稱融合蛋白。 優(yōu)點：操作簡便，表達蛋白在菌體內穩(wěn)定，易實現高效表達； 缺點：只能作抗原用。以非融合蛋白的形式表達藥物基因 非融合蛋白指在大腸桿菌中表達的蛋白質以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細菌多肽序列。 優(yōu)點：保持原有蛋白活性； 缺點：易被蛋白酶破壞。分泌型表達藥物基因（外源基因融合到編碼原核蛋白信號肽序列的下游） 優(yōu)點：在周質中穩(wěn)定，有活性，不 含蛋氨酸殘基； 缺點：產量不高， 信號肽不被切割。8、載體相關定義載體：在基因工程重組DNA技術中將DNA片段(目的基因)轉移至受體細胞的一種能自我復制的DNA分子?？寺≥d體：從病毒、質?；蚋叩壬锛毎蝎@取的DNA作為載體，在其上插入合適大小的外源DNA片段，將重組后的載體引入到宿主細胞中，并在宿主細胞中大量繁殖。表達載體：在克隆載體基本骨架的基礎上增加表達元件(如啟動子、RBS、終止子等)，是目的基因能夠表達的載體。穿梭載體：指含有兩個親緣關系不同的復制子，能在兩種不同的生物中復制的載體（例如既能在原核生物中復制,又能在真核生物中復制的載體）。9、載體的復制系列可分四類： P27（1）Yep類（酵母附加體質粒）（2）YRp類（酵母復制型質粒）（3）YCp類（酵母著絲粒質粒）（4）YIp類（酵母整合型質粒）10、影響目的基因在酵母菌中表達的因素外源基因的拷貝數外源基因的表達效率：啟動子分泌信號的效率終止序列的影響外源蛋白的糖基化宿主菌株的影響：菌體生長力強 菌體內源蛋白酶要較弱 菌體性能穩(wěn)定 分泌能力強11、精確表達載體P28酵母載體有兩類：普通表達載體和精確表達載體。精確表達載體：要求在啟動子或前導肽編碼序列的適當部位有內切酶位點，以利于接入外源基因，并使它在表達和加工后氮末端氨基酸序列與天然產物相同，既無多余的氨基酸，也無缺失的氨基酸的克隆載體。第五節(jié) 基因工程菌生長代謝的特點1、碳源物質為細胞提供能量，當菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時，菌體會產生乙酸，導致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長。適當提高pH，可減少乙酸的抑制作用；P31第六節(jié) 基因工程菌的不穩(wěn)定性1、質粒不穩(wěn)定分為那兩類？P32工程菌在傳代過程中經常出現質粒不穩(wěn)定的現象，質粒不穩(wěn)定分為分裂不穩(wěn)定和結構不穩(wěn)定。 質粒的分裂不穩(wěn)定是指工程菌在分裂時出現一定比例的不含質粒的子代菌的現象。與含質粒菌產生不含質粒子代菌的頻率；這兩種菌比數率差異的大小有關質粒的結構不穩(wěn)定是指外源基因從質粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變?；?、提高質粒穩(wěn)定性的方法P33（1）選擇合適的宿主菌：遺傳穩(wěn)定（2）選擇合適的載體：高拷貝數；（3）選擇壓力：如加抗生素提高穩(wěn)定性；（4）分階段控制培養(yǎng)：先使菌體生長至一定密度；再誘導外源基因的表達 （5）控制培養(yǎng)條件 （6）固定化第八節(jié) 重組工程菌的培養(yǎng)1、基因工程菌的培養(yǎng)方式P36（1） 分批培養(yǎng)（2）補料分批培養(yǎng)：將種子接入發(fā)酵反應器中進行培養(yǎng),經過一段時間后間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的方法。（3）連續(xù)培養(yǎng)（4）透析培養(yǎng)（5）固定化培養(yǎng)2、基因工程菌的培養(yǎng)工藝P37（1） 培養(yǎng)基的影響（2） 接種量的影響（3）溫度的影響（4）溶氧量的影響（5）誘導時機的影響（6）誘導表達程序的影響：一般在對數生長期或對數生長后期升溫誘導表達。（7） pH的影響：生長pH在6.87.4左右，后期外源蛋白的表達其最佳pH為6.06.5。第九節(jié) 高密度發(fā)酵1、什么是高密度發(fā)酵？影響高密度發(fā)酵的因素有哪些？可采取哪些方法實現高密度發(fā)酵？P41（1）高密度發(fā)酵：一個相對概念，一般指培養(yǎng)基中工程菌的菌體濃度在50gDCW/L以上，理論上的最高值可達200gDCW/L。（2）影響高密度發(fā)酵的因素：培養(yǎng)基；溶氧濃度；pH；溫度；代謝副產物（3）實現高密度發(fā)酵的方法P43發(fā)酵條件的改進a.培養(yǎng)基的選擇（普遍采用6g/L的甘油為碳源）；b.建立流加式培養(yǎng)的方式；c.提高供氧能力構建出產乙酸能力低的工程化宿主菌a.阻斷乙酸產生的主要途徑；b.對碳代謝流進行分流；c.限制進入糖酵解途徑的碳代謝流；d.引入血紅蛋白基因構建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌第十節(jié) 基因工程藥物的分離純化1、表達的產物都是多肽或蛋白質 ，它的制得具有以下特點：P46（1）表達產物在初始料中含量較低；（2）含有大量細胞及代謝產物；（3）表達產物穩(wěn)定性差，易失活變性；（4）表達產物的種類繁多、結構不一、活性各異；（5）對其質量要求純度高、無菌、無熱原。2、分離純化的基本過程若是論述題最好對過程進行一定的介紹3、建立分離純化工藝的根據P46（1）含目的產物的起始料的特點基因工程菌的發(fā)酵產物其上游過程的各種因素對分離、純化工藝有影響。包括：菌種的類型及其代謝特性。原材料培養(yǎng)基的來源及其質量。生產工藝及條件。（2）物料中雜質的種類和性質。（3）目的產物特性。（4）產品質量的要求4、細胞破碎與固液分離 細胞收集： 離心法、膜分離法。 細胞破碎：機械破碎法、非機械破碎法；物理法、化學法、生物法 固液分離：離心、膜過濾、雙水相萃取5、細胞破碎的方法；P47（1）物理方法：勻漿法、珠磨法、超聲波法（2）化學法：滲透沖擊法（高滲+低滲）、增溶法（表面活性劑等）（3）生物法：酶溶法6、分離純化常用的色譜分離方法有那些？P50分離純化主要依賴色譜分離方法。色譜技術是醫(yī)藥生物技術下游過程精制階段的常用手段，其優(yōu)點是該法具有多種多樣的分離機制、設備簡單、便于自動化控制和分離過程中無發(fā)熱等 有害效應。色譜技術分為離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過濾色譜、高 壓液相色譜等。 （1）離子交換層析P51離子交換介質由三部分構成：（1）不溶性高分子聚合物載體；（2）共價鍵結合于載體上-活性基團或功能集團（3）與活性基團帶相反電荷-平衡離子或反離子（決定是陰離子交換樹脂還是陽離子交換樹脂）如：酸性陽離子交換樹脂R-SO3H蛋白質的等電點和表面電荷的分布主要影響離子交換的性能。它由平衡、上樣、洗脫（分為梯度洗脫和階段洗脫2種）、再生4個主要步驟構成。（2）疏水層析P54利用蛋白質分子表面上的疏水區(qū)域和介質中的疏水基團之間的相互作用，無機鹽的存在能使相互作用力增強。流動相為pH68鹽水溶液。常用的介質是多聚糖（如瓊脂糖）和硅膠。（3）親和層析P4756親和層析是利用固定化配基與目的蛋白質之間特異的生物親和力進行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用。洗脫時分為特異性洗脫和非特異性洗脫。（4）凝膠過濾層析P59凝膠過濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質，小分子能進入孔內，在柱中緩慢移動，而大分子不能進入孔內，快速移動，大分子量物質先流出，小分子物質后流出。利用這種移動差別可使大分子與小分子分開。7、用于分離純化的技術應滿足那些要求？P62(1)技術條件溫和，能保持目的產物的生物活性。 (2)選擇性好，能從復雜的混合物中有效地將目的產物分離出來，達到較高純化倍數。 (3)收率要高。 (4)兩個技術之間不需要對物料加以處理或調整，這樣可以減少工藝步驟。 (5)整個分離純化過程要快速，能夠滿足高生產率的要求。 第十一節(jié) 變性蛋白的復性1、外源基因在大腸桿菌中的高表達常常導致包涵體的形成P632、包涵體：指細菌表達的蛋白在細胞內凝集，形成無活性的固體顆粒。 3、包涵體的分離和溶解P63（1）包涵體的分離：重組菌破碎后，離心得沉淀部分，再用低濃度變性劑（脲或鹽酸胍）、去垢劑（Triton X-100）、脫氧膽酸鈉洗滌。（2）包涵體溶解：般用強的變性劑如脲（6-8M）、鹽酸胍（6M），或用去垢劑，如SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物等，溶解涵體蛋白質。 （3）包涵體復性：稀釋復性和透析復性；含二硫鍵的蛋白的復性；封閉蛋白的疏水蔟促進復性；凝膠過濾層析復性；小分子添加劑促進的復性；分子伴侶或折疊酶促進的復性；人工分子伴侶的復性第十二節(jié) 基因工程藥物的質量控制1、由基因重組技術所獲得的蛋白質藥物產品進行鑒定時，常作那些項目分析？P68（1）肽圖分析 肽圖分析是用酶法或化學法降解目的蛋白質后，對生成的肽段進行的分離分析。它是一種可檢測蛋白質一級結構中細微變化的最有效方法，該技術靈敏高效的特點使其成為對基因工程 藥物的分子結構和遺傳穩(wěn)定性進行評價和驗證的首選方法。 （2）氨基酸成分分析 在氨基酸成分分析中，一般含50個左右的氨基酸殘基的蛋白質的定量分析是接近理論值的，即與序列分析結果一致。 （3）部分氨基酸序列分析 部分氨基酸序列分析（N端15個氨基酸）可作為重組蛋白質和多肽的重要鑒定指標。 （4）重組蛋白質的濃度測定和分子量測定蛋白質濃度測定方法主要有凱氏定氮法、雙縮脲法、染料結合比色法、福林-酚法和紫外法等。蛋白質分子量測定最常用的方法有凝膠過濾法和SDS-PAGE法，凝膠過濾法是測定完整的蛋白質分子量，而SDS-PAGE法測定的是蛋白質亞基的分子量。（5）蛋白質二硫鍵分析 二硫鍵和巰基與蛋白質的生物活性密切相關，基因工程藥物產品的硫-硫鍵是否正確配對 是一個重要問題。第三章 動物細胞制藥第一節(jié) 概述細胞工程：是指以細胞為對象，應用生命科學理論，借助工程學原理與技術，有目的地利用或改造生物遺傳特性，以獲得特定的細胞、組織產品或新型物種的一門綜合性科學技術。P79第二節(jié) 動物細胞的形態(tài)和生理特點（重點）1、離體培養(yǎng)的動物細胞分為那些類型？P81 動物細胞適應功能,形態(tài)各異。離體培養(yǎng)細胞分兩類：貼壁細胞；懸浮細胞（1）貼壁細胞 生長須有貼附的支持物表面， 自身分泌或培養(yǎng)基中提供的貼 附因子才能在該表面上生長。兩種形態(tài)： 成纖維細胞型和上皮細胞型（2）懸浮細胞： 生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長。如淋巴細胞。（3）兼性貼壁細胞：生長不嚴格依賴支持物。如中國地鼠卵巢細胞，小鼠L929細胞。2、什么是接觸抑制現象？P84當細胞在基質上分裂增殖，逐漸匯合成片時，即每個細胞與其周圍的細胞相互接觸時， 細胞就停止增殖。此時若能保持充足的營養(yǎng)，細胞仍可存活相當一段時間，但細胞密度不再 增加，所以該現象又稱之謂接觸抑制或密度依賴抑制現象。一旦細胞轉化為異倍體后，該現 象隨之消失，細胞可多層生長。細胞密度也就可大大增加。 3、動物細胞的生理特點P83（1）細胞的分裂周期長 動物細胞分裂所需的時間一般為1248h，它不僅隨細胞種屬的不同而不同，就是同一種屬的，不同部位的細胞其所需的時間也不同。周期=間期+分裂期 間期（G1+S+G2） 分裂期（M） （2）細胞生長需貼附于基質，并有接觸抑制現象 (3)正常二倍體細胞的生長壽命是有限的 (4)動物細胞對周圍環(huán)境十分敏感。動物細胞對各種物理化學因素，如滲透壓，pH，離子濃度，剪切力，微量元素等的變化耐受力很弱。 (5)動物細胞對培養(yǎng)基的要求高 氨基酸、維生素，多種無機鹽和微量元素，細胞生長因子、貼壁因子。 (6)動物細胞對蛋白質的合成途徑和修飾功能與細菌不同 動物細胞的蛋白質合成除了在游離的核糖體上進行外，還在與糙面內質網上結合的核糖 體上進行。（游離核糖體合成蛋白質用于細胞質基質內。粗面內質網的核糖體合成蛋白質是分泌的和膜中的整合蛋白多為糖蛋白。）3、動物細胞作為宿主細胞生產藥物的特點；P85（1）優(yōu)點：產品多分泌在胞外，收集純化方便，得到較完善的翻譯后修飾，特別是糖基化，因此與天然產品更一致，適于臨床（2）缺點：培養(yǎng)條件要求高，成本貴，產量低第三節(jié)生產用動物細胞的要求和獲得1、生產用動物細胞的種類及其特點P86用于生產的動物細胞有三類，即原代細胞、已建立的二倍體細胞系、以及可無限期傳代 的轉化細胞系，以及用這些細胞進行融合和重組的工程細胞。 (1)原代細胞 原代細胞是直接取自動物組織、器官，經過分碎，消化而獲得的細胞懸液。用得最多的是雞胚細胞，原代兔腎或鼠腎細胞，以及血液的淋巴細胞。 (2)二倍體細胞系 原代細胞經過傳代、篩選、克隆，從而從多種細胞成分的組織中挑選，并純化出某種具有一定特征的細胞株。該細胞株仍具備“正常”細胞的特點，一般均從動物的胚胎組織中獲取。 (3)轉化細胞 這類細胞是通過某個轉化過程形成的，它常常由于染色體的斷裂變成了異倍體，從而失去了“正?！奔毎奶攸c，而獲得了無限增殖的能力。由于轉化的細胞具有無限生命力，而且常常倍增時間較短，對培養(yǎng)條件和生長因子等要求較低，故更適于大規(guī)模工業(yè)化生產的需要。 (4)其他：融合細胞系（物理法如高壓電場和化學法如仙臺病毒、聚乙二醇）和重組工程細胞系2、真核細胞基因表達載體的構建，使用的載體有兩類：（1）病毒載體：牛痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、桿狀病毒；（2）質粒載體：穿梭質粒載體P883、重組DNA導入動物細胞的常用方法：融合法、化學法、物理法、病毒法，最常用磷酸鈣沉淀法、 電穿孔法P894、生產用的工程細胞必須建立兩個細胞庫：原始細胞庫（MCB）、生產用細胞庫（MWCB）或工作細胞庫（WCB）P91第四節(jié) 動物細胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基1、動物細胞的培養(yǎng)條件P92(1)器材的清洗和消毒 器材的清洗:浸泡、刷洗、泡酸、沖洗 器材的消毒滅菌: 物理消毒/化學消毒(2)水質 :電阻值大于18M,去熱原。(3) pH:7.27.4(4)滲透壓:290300mOsm/kg(5)溫度:哺乳動物370.5 C；(6)空氣:氧的飽和質60%,氧分壓 40.7kPa2、培養(yǎng)動物細胞的培養(yǎng)基的種類和組成P95動物細胞培養(yǎng)基大致可以分成三類：天然培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基。 （1）天然培養(yǎng)基：血清、羊水、腹水等,成分復雜、成分不穩(wěn)定（2）合成培養(yǎng)基：成分明確、大量供應，DME、MEM、DMEM等（第一個合成培養(yǎng)基是199培養(yǎng)基；氨基酸：12種必需氨基酸+谷氨酰胺維生素：形成輔基和輔酶糖類：能源，用葡萄糖和谷氨酰胺無機鹽：維持滲透壓其它成分：核酸前體和氧化還原劑如谷胱甘肽添加5%10%小牛血清：作用是提供生長因子和激素；提供貼附因子和伸展因子；提供結合蛋白；提供必需脂肪酸和微量元素（3）無血清培養(yǎng)基： 無血清培基的優(yōu)點如下： 提高了細胞培養(yǎng)的可重復性，避免了由于血清批間差異的影響。 減少了由血清帶來病毒、霉菌和支原體等微生物污染的危險。 供應充足，穩(wěn)定。 細胞產品易于純化。 避免了血清中某些因素對有些細胞的毒性。 減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于對實驗結果的分析。（簡答題時候可以不寫優(yōu)點） 無血清培養(yǎng)基加入添加劑：生長因子和激素（胰島素）；結合蛋白（鉄傳遞蛋白和白蛋白）；貼附因子和伸展因子（膠原等）；有利細胞生長的因子和元素（谷胱甘肽）第五節(jié) 動物細胞培養(yǎng)的基本方法1、細胞傳代；P101原代培養(yǎng)形成的單層細胞匯合以后，需要進行分離培養(yǎng)，否則細胞會因生成空間不足或由于細胞密度過大引起營養(yǎng)枯竭，都將影響細胞的生長，這一程序常稱為傳代或傳代培養(yǎng)。傳代方法：（1）懸浮細胞：加生長液，然后分種（2）貼壁生長細胞傳代：采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。第六節(jié) 動物細胞大量培養(yǎng)方法和操作方式1、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法P103（1）懸浮培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)即讓細胞自由地懸浮于培養(yǎng)基內生長增殖。優(yōu)點是操作簡便，培養(yǎng)條件比較均一，傳質和傳氧較好，容易擴大培養(yǎng)規(guī)模，不但細胞體積較小，較難采用灌流培養(yǎng)，因此細胞密度一般較低。（目前在生產中用于懸浮培養(yǎng)的設備主要是通氣攪拌罐式生物反應器和氣升式生物反應器。） 2貼壁培養(yǎng) 貼壁培養(yǎng)是必須讓細胞貼附在某種基質上，細胞才能生長繁殖的培養(yǎng)方法。較容易采用灌流 培養(yǎng)的方式使細胞達到高密度。但操作比較麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易均一，傳質和傳氧較差。 3貼壁懸浮培養(yǎng) 微載體培養(yǎng)：可創(chuàng)造相當大的貼附面積供細胞貼附生長增殖，載體的體積很小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內。 包埋和微囊培養(yǎng)：包埋和微囊培養(yǎng)培養(yǎng)細胞不是貼附在載體表面，而是被包埋或包裹在凝膠載體或微囊內。 包埋或包裹在載體或微囊內的細胞可獲得保護，避免了剪切力的損害；可以獲得較高的細胞密度；可采用多種生物反應器進行大規(guī)模培養(yǎng)。（目前最普遍的是瓊脂糖和海藻酸鈣凝膠） 結團培養(yǎng) ：結團培養(yǎng)的實質是用細胞本身作為基質，相互貼附后，再用懸浮的方法進行培養(yǎng)，所以它也是一種貼附懸浮培養(yǎng)。該培養(yǎng)方法操作簡便，節(jié)省了微載體的成本。 2、動物細胞培養(yǎng)的操作方式；P106動物細胞培養(yǎng)的操作方式一般可分為分批式、加料分批或流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式和灌流式。 （1）分批式操作 （一種是將細胞和培養(yǎng)基一次性加入反應器內進行培養(yǎng)，此后細胞不斷增長，產物不斷形成和積累。最后將條件培養(yǎng)基，即經培養(yǎng)已含有細胞產物的培養(yǎng)基，或連同細胞一并取出，培養(yǎng)結束。另一種是先將細胞和培養(yǎng)基加入反應器，待細胞生長至一定密度后，往反應器內加入誘導劑或病毒等，經一段時間作用后，將反應物取出。） （2）半連續(xù)式操作 （該方式是當細胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后，在細胞增長和產物形成過程中，每間隔一 段時間，取出部分培養(yǎng)物，或單純是條件培養(yǎng)基，或連同細胞、載體一起，然后補充同樣數 量的新鮮培養(yǎng)基，或另加新鮮載體，繼續(xù)培養(yǎng)。該操作方式在動物細胞培養(yǎng)和藥品生產中被 廣泛采用。） （3）灌流式操作 （該方式是當細胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后，在細胞增長和產物形成過程中，不斷地將 部分條件培養(yǎng)基取出，同時不斷地補充新鮮培養(yǎng)基。它與連續(xù)式操作不同處，在于取出部分 條件培養(yǎng)基時，絕大部分細胞仍保留在反應器內，而連續(xù)式培養(yǎng)則同時也取出部分細胞。） 括號部分的內容重在理解 第七節(jié) 動物細胞生物反應器1、動物細胞生物反應器必需具備的基本要求；P107（1）一切材料，對細胞必須無毒性。（2）具有良好的傳質、傳熱和混合的性能。（3）密封性能良好（4）對多種物理化學參數能自動檢測、調節(jié)和高精度控制（5）可長期連續(xù)運轉 （6）容器內面光滑，無死角（7）拆裝、連接和清潔方便，能耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修。設備成本盡可能低。2、動物細胞生物反應器的類型及特點；P108（1）攪拌罐式生物反應器（目前最廣泛應用的動物細胞反應器）：靠攪拌槳提供液相攪拌的動力，它有較大的操作范圍、良好的混合性和濃度均勻性（2）氣升式生物反應器：其特點是結構簡單，操作方便。（3）固定床式生物反應器：結構簡單、裝填材料無毒且利于細胞貼壁，剪切力小的特點（4）流化床式生物反應器 ：可連續(xù)操作（5）袋式或膜式生物反應器：可取出某些有害代謝物（6）中空纖維生物反應器：用途較廣，既可培養(yǎng)懸浮生長的細胞，又可培養(yǎng)貼壁依賴性細胞，細胞的密度高，如果控制系統(tǒng)不受污染，能長期運轉。3、反應器及檢測；P114（1）溫度檢測元件：電阻溫度計；（2）PH：復合式參比電極（3）溶氧：極普電極或電流式覆膜電極第十節(jié) 動物細胞制藥的前景與展望1、動物細胞制藥有哪些新進展？P135（1）改進表達載體，提高表達水平和產量：采用更強的啟動子和增強子更好的利用擴增系統(tǒng)或尋找高表達位點采用和改造更好的宿主細胞（2）利用代謝工程，改進培養(yǎng)工藝，降低生產成本：采用代謝工程改造工程細胞改進培養(yǎng)工藝，降低生產成本（3）抑制細胞凋亡，延長培養(yǎng)周期（4）采用糖基化工程，提高產品質量（5）轉基因動物的研究（6）組織工程的研究2、代謝工程：采用基因工程的手段，使工程細胞增加或減少某種酶，改造它的代謝能力和途徑，使其降低對某些營養(yǎng)物質的需求，減少某些代謝產物的產生和無害，以及控制工程細胞的增殖速度和制造產品的能力。P137第四章 抗體制藥第一節(jié) 概述P1431、抗體：即Ig，指能與相應抗原特異性結合具有免疫功能的球蛋白。2、1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細胞雜交瘤技術制備出單克隆抗體（McAb）。3、單克隆抗體：將抗體產生細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產生的特異性完全相同的高純度抗體。 單克隆抗體有缺陷：分子量過大；鼠源性抗體；所以要改造：降低單克隆抗體的免疫源性和降低其相對分子量。P144第二節(jié) 單克隆抗體及其制備（重點）1、克隆化：指單個細胞通過無性繁殖而獲得細胞集團的整個培養(yǎng)過程。P1482、什么是單克隆抗體？它是如何制備的？P144（1）抗原與動物免疫制備高純度抗原：抗原可以用化學合成，如精制地高辛。 多數抗原物為混合物須經免疫、篩選、克隆化。用抗原免疫脾細胞的制備 ：有體內免疫法和體外免疫法 。體內免疫就是將抗原注射到小鼠腹腔，使小鼠產生免疫反應，B細胞迅速增殖；體外免疫小鼠脾細胞的懸浮液與抗原一起培養(yǎng)后，再分離脾細胞。 （2）細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)骨髓瘤細胞：和免疫動物同源，目前常用的骨髓瘤細胞系多來自BALB/c小鼠（最常用）和 LOU大鼠。脾細胞和骨髓瘤細胞融合：脾細胞（1108）和骨髓瘤細胞（2107）混合，在聚乙二醇誘導下融合2分鐘，然后用培養(yǎng)液將融合液緩慢稀釋。（常用PEG相對分子量4000，濃度為40-50%， 二甲基亞砜增加融合率）選擇性培養(yǎng):選擇培養(yǎng)基 為HAT培養(yǎng)液。 次黃嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。其上脾瘤融合細胞可以生長，脾脾、瘤瘤融合細胞死亡。（培養(yǎng)基中需要加入飼養(yǎng)細胞才能繁殖，常用飼養(yǎng)細胞是小鼠腹腔巨噬細胞、脾細胞、胸腺細胞等）（3）篩選陽性克隆與克隆化篩選陽性克隆常用檢測方法：免疫酶技術、免疫熒光技術、放射免疫技術等。克隆化：有限稀釋法（將對數生長期的雜交瘤細胞用培養(yǎng)液作一定的稀釋后，按每孔1個細胞接種在培養(yǎng)皿中，細胞增值后成為單克隆細胞系。）和軟瓊脂法（將雜交瘤細胞稀釋到一定密度，然后與瓊脂混懸。在瓊脂中的細胞不能自由移動，彼此互不相混，從而達到單細胞培養(yǎng)的目的）（4）雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定 雜交瘤細胞鑒定：染色體分析。另外還檢測抗體特異性、純度、分子量等。（5）單克隆抗體的大量制備 體外培養(yǎng)法和體內誘生法，多采用后者 體內誘生法：降脂烷注射小鼠腹腔后再接種雜交瘤細胞，取腹水，離心 ，取上清。（6）單克隆抗體的純化 依單抗IgG類和亞類不同，選各種不同的純化方法。 體內誘生法單克隆抗體的純化方法：離心 取上清，超濾，鹽析。分離：凝膠過濾用于IgG IgM單抗純化；陰離子交換層析IgG單抗純化；親和層析 IgG單抗純化。3、ELISA法：酶聯免疫吸附試驗，基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應板 ) 表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。原理：酶分子與抗體或抗抗體分子共價結合，此種結合不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。此種酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現顏色反應。因此，可通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。P147第三節(jié) 基因工程抗體及其制備（即鼠源性單克隆抗體的改造）1、基因工程抗體：過PCR技術獲得抗體基因或抗體基因片段，與適當載體重組后引入不同表達系統(tǒng)所產生的抗體，被廣泛應用于疾病的臨床臨床診斷、預防、治療及基礎理論研究等領域。P1502、Ig分子結構P150（1）由2條重鏈(簡稱H鏈)和2條輕鏈（簡稱L鏈）組成Y字型結構分子，鏈與鏈之間由一對或一對以上的二硫鍵互相連接（2）Ig分子氨基酸端L鏈的1/2與H鏈的1/4的氨基酸組成及順序多變，構成可變區(qū)(簡稱V區(qū))，V區(qū)中某些特定位置構建抗體和抗原特異結合的關鍵部位，稱為互補決定區(qū)（CDR）它賦于抗體以特異性。（3）羧基端L鏈的1/2與H鏈的134的氨基酸組成及順序較恒定，構成恒定區(qū)(簡稱C區(qū))，它決定Ig分子的異種抗原性。（4）L鏈有VL和CL連個功能區(qū)，H鏈有VH、CH1、CH2、CH3四個功能區(qū)，VL和VH的CDR區(qū)共同構成一個抗原結合部位。3、基因工程抗體及其特性和制備方法（P152圖4-4）（1）人鼠嵌合抗體：在基因水平上將鼠源單抗的H 和L鏈可變區(qū)（V區(qū)）基因分離出來，分別與人Ig的H 和L鏈的穩(wěn)定區(qū)（C）基因連接成人-鼠嵌合抗體的H 和L鏈基因，再共轉染骨髓瘤細胞，就能表達完整人-鼠嵌合抗體。人IgC-小鼠IgV（2）改形抗體（CDR移植抗體）：用鼠源單抗的CDR序列替換人Ig 分子中CDR序列，則可使人的Ig 分子具有鼠源單抗的抗原結合特異性。可消除免疫源性。小鼠CDR替代人CDR（3）Fab抗體：重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與整個輕鏈以二硫鍵形式連接而成，主要發(fā)揮抗體的抗原結合功能。Fab抗體只有完整IgG的1/3。（Fd：重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)）完整L鏈+重鏈V區(qū)+CH1功能區(qū)（4）Fv抗體：由VH和VL組成的具有完整抗原結合位點的最小抗體片段；VH+VL（5）單鏈抗體：即scFv，由VH和VL通過連接肽（接頭）重組并表達而成的一種小分子抗體，其分子量為整個Ig分 子的1/6具有較好的抗原結合能力，且分子量小、穿透力強、免疫原性低等特性。VH-多肽-VL（6）單域抗體：只有VH或VL一個功能結構域，也能保持原單克隆抗體的特異性。其分子量僅為整個Ig分子的1/12。VH或VL（7）最小識別單位：即MRU，只含有一個CDR多肽的抗體，也為超變區(qū)多肽。第四節(jié) 多功能抗體及其制備1、雙功能抗體：bisFvs，即雙特異性單鏈抗體，（天然Ig是由兩個完全相同的VH和VL區(qū)域構成，該區(qū)域是特異性識別并結合抗原的關鍵部位）經人工設計構建的雙特異性抗體由兩個不同的抗原結合位點組成，可同時與兩種不同的抗原決定簇結合，并可將其偶連的藥物、酶或放射性核素等導向到靶部位，這種具有雙價雙特異性的抗體又稱為雙功能抗體。P1552、多功能抗體：在scFv的基礎上，可以把兩個或兩個以上的scFv重組在一起，由此可制備成多價小分子抗體即微型抗體（簡稱多價微抗）。P1573、抗體融合蛋白：抗體的一部分被非抗體序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性，稱之為抗體融合蛋白。P158第五節(jié) 抗體工程1、抗體工程：指利用重組DNA和蛋白質工程技術，對抗體基因進行加工改造和重新裝配，經轉染適當的受體細胞后，表達抗體分子，或用細胞融合、化學修飾等方法改造抗體分子的工程。P159現在普遍使用噬菌體作為抗體庫技術的載體。6噬菌體抗體庫技術基本方法（過程）P159噬菌體抗體庫技術：它是將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉染工程細菌進行表達，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。基本過程：噬菌體抗體庫技術基本路線為用RT-PCR方法擴增抗體全套可變區(qū)基因（VH+ VL），重組到噬菌體載體中，并通過與絲狀噬菌體的外殼蛋白形成融合蛋白，把Fab段或ScFv表達到噬菌體表面。通過“吸附洗脫擴增”的富集過程，從中篩選出特異性抗體的可變區(qū)基因。（右圖）第六節(jié) 抗體診斷試劑一、三大類抗體診斷藥物：血清學鑒定用抗體制劑、免疫標記技術用抗體制劑、體內導向診斷藥物。P161二、抗體診斷藥物有哪些類型？P1611. 血清學鑒定用的抗體類試劑 （1）鑒定病原菌用的抗體試劑 （2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被動血凝診斷試劑 （3）妊娠診斷試劑 （4）抗ABO血型系統(tǒng)血清2、免疫標記技術用的抗體類試劑P164給抗體標記放射性核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應放大，使常規(guī)不能觀察的反應得以顯現，可對微量抗原進行定性定量測定，靈敏度提高。結合顯微鏡技術，還可對抗原物質作出組織內或細胞內的定位測定。 （1）熒光抗體診斷試劑：熒光抗體是用熒光色素,如異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明（RB200）、藻紅素（PE）等標記抗體蛋白，即成熒光抗體。用熒光抗體浸染含有抗原物質的組織切片或細胞，熒光抗體就與抗原結合，在熒光顯微鏡下成為發(fā)光的可視物，從而達到診斷和定位的目的。 （2）免疫酶抗體診斷試劑：酶標診斷試劑 a、 HBsAg(乙型肝炎表面抗原)酶標診斷試劑 b、HBeAg(乙型肝炎e抗原)酶標診斷試劑 c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶標診斷試劑 d、測定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶標診斷試劑 e、AFP（甲胎蛋白）酶標診斷試劑 f、CEA（癌胚抗原）酶標診斷試劑（3）放射免疫用抗體診斷試劑 把放射性核素分析的高靈敏性與抗原抗體反應的特異性兩大特點結合起來建立的檢測技術。能測出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物質。 常用的標記抗體試劑： a、 HBsAg放射性核素標記抗體診斷試劑： 125 I 標記，靈敏度0.1 ng/ml b、HBeAg放射性核素標記抗體診斷試劑： 125 I 標記，靈敏度0.1 ng/ml c、HAV抗原放射性核素標記抗體診斷試劑： 125 I 標記 d、 AFP放射性核素標記抗體診斷試劑： 125 I 標記，靈敏度15 ng/ml e、 CEA放射性核素標記抗體診斷試劑： 125 I 標記，靈敏度1 ng/ml 3、導向診斷藥物 由于腫瘤的特異性小分子抗體尚在研究之中，所以導向藥物還未愛臨床廣泛應用。三、CD單克隆抗體系列P169應用以單克隆抗體鑒定為主的方法，將來自不同實驗室的單克隆抗體所識別的同一種白細胞分化抗原歸稱為CD（cluster of differentiation）。人CD的編號已從CD1命名至CD247，大致分為13組。 第七節(jié) 抗體治療藥物1、抗體治療藥物有哪些？P173以抗體為載體的導向治療藥物，還不成熟。（1）放射性核素標記的抗體治療藥物抗體作為放射性核素的導向載體，標記操作簡便用量小。放射性核素標記的抗體對腫瘤細胞殺傷較大。（2）抗癌藥物偶聯的抗體藥物常用的抗癌藥物 氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、絲裂霉素（MMC）等。以人血漿白蛋白作為中間載體，可明顯提高每分子抗體所攜帶的MTX量，使體外細胞毒性體高二倍?？贵w類藥物逆轉耐藥性（3）毒素偶聯的抗體藥物在導向藥物中，毒素和抗體的交聯物稱為免疫毒素。 第一代免疫毒素是包含有A、B鏈完整毒素和抗體的交聯物，其中B鏈非特異性結合，使其僅在體外應用。 第二代免疫毒素是利用抗體或抗體片段與毒素的A鏈或與A鏈相似的單鏈核糖體失活蛋白的結合物。因避免了第一代免疫毒素的非特異性，故能在體內有一定的抗腫瘤作用。第三代免疫毒素重組免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗體基因重組表達。特異性好、穩(wěn)定性強、滲透性佳、免疫源性低、可大量制備。（3）免疫毒素的臨床應用 治療腫瘤、自身免疫病，并能克復組織移植排斥反應，可單獨給藥也可包裹在脂質體及其它微粒中給藥。第五章 植物細胞制藥第一節(jié) 基本概念1、植物細胞的全能性。P177植物體中任何一個具有完整細胞核（完整染色體組）的細胞，在一定條件下都可以重新再分化形成原來的個體。第二節(jié) 植物細胞工程發(fā)展簡史（略）第三節(jié)植物細胞的形態(tài)及生理特性1、植物細胞是由細胞壁、原生質體、后含物三大部分組成P1812、細胞壁、質體、液泡三部分是植物細胞特有的結構，動物細胞沒有3、植物培養(yǎng)細胞重量的增加主要取決于對數期，而次級代謝產物的積累主要在穩(wěn)定期（植物細胞培養(yǎng)時期：延遲期、加速期、對數期、穩(wěn)定期四個時期）4、植物培養(yǎng)細胞的生理特性;P183（1）生長階段特征v 延遲期：細胞數量不變，核酸及蛋白合成較快v 加速期：最大生長期，最大細胞濃度v 對數期：細胞數呈對數增加v 穩(wěn)定期：細胞高液泡化，非常脆弱（2）植物細胞與動物細胞、微生物細胞比較特征哺乳動物細胞植物細胞微生物細胞大小（m）1010010100110生長懸浮、貼壁懸浮懸浮營養(yǎng)要求很復雜較復雜很簡單生長速度（倍增時間：h）慢；15100慢；20120快；0.55細胞分化有有限分化無環(huán)境影響非常敏感敏感一般細胞壁無有有產物存在部位胞內或胞外胞內或胞外胞內或胞外產物濃度低低高含水量-約90約75供氧需求12520301001000產物種類疫苗、單抗、酶、生長因子、激素、免疫調節(jié)劑酶、天然色素、天然有機化合物等發(fā)酵食品、抗生素、有機化合物、酶等第