細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)課件第十四章細(xì)胞工程

第十四章細(xì)胞工程,細(xì)胞工程（cellengineering）:也稱(chēng)細(xì)胞技術(shù)。指在細(xì)胞水平上，采用細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)及分子生物學(xué)等學(xué)科的理論與方法，按照人們的意愿來(lái)改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得具有產(chǎn)業(yè)化價(jià)值的細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)品的一門(mén)綜合技術(shù)體系.廣義細(xì)胞工程,微生物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程,第一節(jié)主要相關(guān)技術(shù),基因操作,細(xì)胞的遺傳修飾,細(xì)胞的表型分析,工程化細(xì)胞的應(yīng)用,1）微載體（microcarrier）基質(zhì)材料：交聯(lián)葡聚糖1g交聯(lián)葡聚糖提供6000cm2附著面積微載體是大規(guī)模培養(yǎng)方法中最有使用價(jià)值的支持物。,一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù),(一)基本策略1.增加培養(yǎng)容積2.增加細(xì)胞的附著面積,2）中空纖維（hollowfiber）管壁半透性，細(xì)胞附于管外壁，管內(nèi)可供培養(yǎng)液通過(guò)。有利于分泌型表達(dá)蛋白的純化，但不易放大培養(yǎng)。,3）微膠囊（microcapsule）半透性膜囊，細(xì)胞長(zhǎng)于內(nèi)壁。微囊顆粒需要自行制備，無(wú)商業(yè)購(gòu)買(mǎi)途徑。細(xì)胞密度大、產(chǎn)物在單位體積中濃度高、分離純化簡(jiǎn)單。,3、抑制細(xì)胞的凋亡,在生產(chǎn)特定蛋白質(zhì)（如疫苗、抗體等）的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中宜用無(wú)血清培養(yǎng)：避免血清中的蛋白質(zhì)對(duì)目的蛋白純化的影響。延長(zhǎng)G1期或促使細(xì)胞停于G0期，使細(xì)胞較長(zhǎng)時(shí)間維持在高密度狀態(tài)，利于產(chǎn)生更多目的產(chǎn)物。降低細(xì)胞死亡率，避免死亡細(xì)胞的蛋白酶釋放至培養(yǎng)基導(dǎo)致目的蛋白降解。,4、無(wú)血清培養(yǎng)：,延長(zhǎng)G1期，或促使細(xì)胞停于G0期，細(xì)胞活力正常，可有效抑制凋亡。,（二）基本培養(yǎng)系統(tǒng),傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)：不銹鋼發(fā)酵罐（高度：直徑=1：13：1）和攪拌器，產(chǎn)生氣泡易引起機(jī)械損傷。旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)：模擬失重狀態(tài)，有效降低機(jī)械損傷，應(yīng)用面廣。,1.懸浮培養(yǎng)系統(tǒng),2.氣流驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng),主要優(yōu)勢(shì)在于簡(jiǎn)化設(shè)計(jì)，因?yàn)椴恍枰獢嚢杵髦械陌l(fā)動(dòng)機(jī)和攪拌裝置。,3.微載體培養(yǎng)系統(tǒng)：微載體與攪拌懸浮培養(yǎng)相結(jié)合的培養(yǎng)系統(tǒng)。4.灌注培養(yǎng)系統(tǒng)：能自動(dòng)地將“舊”的培養(yǎng)液排除，同時(shí)自動(dòng)地將新的培養(yǎng)液以相同速率補(bǔ)入到細(xì)胞生長(zhǎng)的容器中。,細(xì)胞的基本生長(zhǎng)特征：,（三）影響大規(guī)模細(xì)胞生長(zhǎng)的因素：,優(yōu)化大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)量化評(píng)估指標(biāo)：1）考慮細(xì)胞密度、生存能力、有絲分裂指數(shù)、一般形態(tài)及破碎數(shù)量的信息；2）采用檢測(cè)生化指標(biāo)來(lái)判斷。葡萄糖和乳酸鹽的濃度可以反映培養(yǎng)液的質(zhì)量情況；乳酸脫氫酶可以判斷細(xì)胞損傷或破碎情況。,利用顯微注射裝置，將一個(gè)細(xì)胞的核移植入另一個(gè)去核細(xì)胞中，已得到重組細(xì)胞。是克隆的關(guān)鍵技術(shù)。,二、細(xì)胞核移植（nucleartransfer）,（一）技術(shù)路線,1.細(xì)胞質(zhì)的選擇：受精卵、處于MII期的卵母細(xì)胞，可以使植入細(xì)胞核的基因組行為發(fā)生重編程（regrogramming），從而去分化恢復(fù)全能性狀態(tài)。,2.供核細(xì)胞的選擇：胚胎細(xì)胞、未分化的原始生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、胎兒體細(xì)胞、成體體細(xì)胞。分化程度，克隆效率。,3.去核：（1）紫外線照射去核通過(guò)破壞DNA去核。損傷較大，基本棄用。（2）盲吸法去核依據(jù)MII期卵母細(xì)胞中第一極體與細(xì)胞核的對(duì)位關(guān)系，用去核針吸去第一極體及其附近胞質(zhì)，成功率約80%。,（3）蔗糖高滲處理去核法先經(jīng)高滲蔗糖（0.30.9mol/L）處理，使核微凸，以去核針去除。（4）透明帶打孔去核法先以顯微針在透明帶打孔，以細(xì)胞松弛素處理后去核，提高卵母細(xì)胞存活率。（5）超速離心法,4.重構(gòu)胚的構(gòu)建：直接將供核細(xì)胞移植到MII期卵母細(xì)胞/受精卵透明帶下，經(jīng)細(xì)胞融合實(shí)現(xiàn)重組已應(yīng)用于多種家畜。取供核細(xì)胞核直接注入已去核的受體細(xì)胞質(zhì)多用于克隆小鼠。,5.重構(gòu)胚的激活（1）化學(xué)激活（2）電激活處理后能夠卵裂則表明激活成功。,6.重構(gòu)胚的培養(yǎng)與移植培養(yǎng)發(fā)育至囊胚或桑葚胚期后，方移植入子宮。,（二）不同供核細(xì)胞的核移植,1.胚胎細(xì)胞核移植：,童第周（1902-1979）中國(guó)的“克隆先驅(qū)”,Megan&MoragfromEnglish,目前核移植已成功：兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物,目前核移植未成功：爬行類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi),2.體細(xì)胞核移植：,1962，非洲爪蟾,Dolly，1997，RoslinInstitute,體細(xì)胞核移植的成功，證明高度分化的成體細(xì)胞核仍具發(fā)育全能性，能在成熟卵母細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)重編程，發(fā)育為完整個(gè)體。MII期的卵母細(xì)胞中含大量MPF，可誘導(dǎo)供體核發(fā)生一系列早熟變化，尤其易使S期細(xì)胞核出現(xiàn)染色體異常，對(duì)G1期染色體損害較小。選取G0或G1期細(xì)胞為核供體，選MPF水平低時(shí)的卵母細(xì)胞為受體。,三、基因轉(zhuǎn)移,目的基因需通過(guò)特定載體（如質(zhì)粒、病毒載體等）攜帶進(jìn)入細(xì)胞。,（1）電穿孔法：以脈沖電場(chǎng)使細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)小空洞，使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。（2）顯微注射法：將DNA直接注入細(xì)胞，多用于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。優(yōu)點(diǎn)：不含病毒基因組片段缺點(diǎn)：基因隨機(jī)整合于染色體，易導(dǎo)致受體細(xì)胞基因滅活或轉(zhuǎn)化基因不表達(dá)。,1.物理轉(zhuǎn)化法,2.化學(xué)轉(zhuǎn)化法,（1）脂質(zhì)體包埋法脂質(zhì)體包裹DNA，通過(guò)與受體細(xì)胞膜融合使DNA片段進(jìn)入細(xì)胞。（2）磷酸鈣共沉淀法DNA與磷酸鈣形成共沉淀顆粒，吸附于細(xì)胞表面，通過(guò)胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞。（3）DEAE-葡聚糖吸附法,通過(guò)病毒感染的方式導(dǎo)入外源基因。病毒載體為缺陷型病毒，感染后將基因組轉(zhuǎn)入細(xì)胞，無(wú)法產(chǎn)生包裝的病毒顆粒。常用：腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。,3.生物學(xué)方法,第二節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程的應(yīng)用,一.醫(yī)用蛋白質(zhì)的生產(chǎn),1.單克隆抗體,一種B淋巴細(xì)胞能接受一種抗原決定簇的刺激，分化繁殖成為可分泌相應(yīng)抗體的克隆系。大量B淋巴細(xì)胞可分泌出識(shí)別許多抗原決定簇的抗體。,單克隆抗體：來(lái)源于單個(gè)B淋巴細(xì)胞的抗體，只能識(shí)別一種特定抗原決定簇。,單克隆抗體制備技術(shù)（B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)）：將骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，用于制備單克隆抗體。所獲得的雜交瘤細(xì)胞既具有腫瘤細(xì)胞無(wú)限生長(zhǎng)的特性，又具有B淋巴細(xì)胞分泌抗體的能力。,單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)：專(zhuān)一性、均質(zhì)性、靈敏性以及無(wú)限量制備的可能性。,單克隆抗體的制備過(guò)程,應(yīng)用價(jià)值：,作為體外診斷試劑。作為體內(nèi)診斷試劑，用作腫瘤定位等。作為導(dǎo)向藥物的載體：?jiǎn)慰寺】贵w上連接抗癌藥物等,特異地治療癌癥等疾病。,-生物導(dǎo)彈,由于微生物缺乏蛋白質(zhì)翻譯后的加工修飾系統(tǒng)，因此許多復(fù)雜人體蛋白必須用真核動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)。如：溶血栓藥物-組織型纖溶酶原激活劑（tPA）血友病藥物凝血因子VIII促紅細(xì)胞生成素治療腫瘤化療或腎臟疾病導(dǎo)致的紅細(xì)胞減少癥,2.復(fù)雜人體蛋白質(zhì),二.基因工程動(dòng)物的產(chǎn)生,基因工程動(dòng)物,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenicanimal）,基因剔除動(dòng)物（geneknockoutanimal）,1、疾病動(dòng)物模型目前已有多種遺傳疾病的模型小鼠，是研究人類(lèi)疾病的有利工具。,2、動(dòng)物生物反應(yīng)器（bioreactor）主要用于生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)，如：乳腺生物反應(yīng)器,3、人類(lèi)移植用器官通過(guò)遺傳改造減少排斥。,三.基于細(xì)胞的組織工程,組織工程皮膚組織工程膀胱,將體外培養(yǎng)的功能細(xì)胞植入患者體內(nèi)，以代償病變細(xì)胞所喪失的功