高通量測(cè)序在生物學(xué)的應(yīng)用.ppt

1、高通量測(cè)序技術(shù)在生物學(xué)中的應(yīng)用,主要報(bào)告內(nèi)容,高通量測(cè)序簡(jiǎn)介 從頭測(cè)序及其應(yīng)用 重測(cè)序及其應(yīng)用 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及其應(yīng)用 Small RNA測(cè)序及其應(yīng)用,HGP項(xiàng)目：20世紀(jì)90年代美國(guó)能源部資助啟動(dòng)人類基因組計(jì)劃，六個(gè)國(guó)家的科學(xué)家耗資4.37億，于2000年完成人類基因組工作草圖。 方法和結(jié)果：應(yīng)用分層shotgun+Sanger測(cè)序法，結(jié)果預(yù)測(cè)了31,000個(gè)基因，證明基因組的95%是非編碼序列。 意義：人類基因組測(cè)序的完成標(biāo)志著分子醫(yī)學(xué)時(shí)代的到來(lái)；此項(xiàng)目也催生了高通量測(cè)序技術(shù),Nature (2001) 409:860-921,人類基因組從頭測(cè)序分析,分層的shotgun測(cè)序法,Sanger測(cè)

2、序技術(shù),PCR末端終止技術(shù)+電泳檢測(cè)技術(shù) 單個(gè)片段序列測(cè)定 最高通量：小于4MB/天,基于平板膠的測(cè)序技術(shù),96通道毛細(xì)管陣列,高通量測(cè)序技術(shù),Shot Gun文庫(kù)構(gòu)建,簇序列讀取反應(yīng),圖像獲得和處理,序列組裝和比較,3,T T T T,T G C T,高通量測(cè)序技術(shù),主要測(cè)序技術(shù)平臺(tái),Metzker, Nature Reviews Genetics (2010) 11:31,主要報(bào)告內(nèi)容,高通量測(cè)序簡(jiǎn)介 從頭測(cè)序及其應(yīng)用 重測(cè)序及其應(yīng)用 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及其應(yīng)用 Small RNA測(cè)序及其應(yīng)用,454技術(shù)完成5倍測(cè)序深度； GAII技術(shù)完成20倍測(cè)序深度； Sanger技術(shù)完成6倍覆蓋度,Dall

3、oul et al. PLoS Biol (2010)8:e1000475,多種技術(shù)平臺(tái)聯(lián)合應(yīng)用完成火雞基因組從頭測(cè)序,測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),火雞基因組從頭測(cè)序,結(jié)果：覆蓋火雞基因組 90%（0.92 /1.1Gb），發(fā)現(xiàn)6M SNP，預(yù)測(cè) 16K個(gè)基因,火雞和家雞測(cè)序拼接結(jié)果,火雞基因組從頭測(cè)序,發(fā)現(xiàn)了數(shù)千個(gè)禽類特有的基因，尤其是性染色體基因研究令人興奮,禽類中的特有基因,火雞基因組從頭測(cè)序,為研究者提供火雞質(zhì)量和數(shù)量生產(chǎn)性狀和抗病候選基因，加速了火雞育種進(jìn)展,與家雞基因組比較火雞基因組中20種基因家族的分布情況,三種鳥(niǎo)類基因比對(duì)結(jié)果,四種禽類不同氨基酸含量情況,意義：第一個(gè)完全運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)模

4、式完成的動(dòng)物基因組從頭測(cè)序； 方法和結(jié)果：不同插入片段測(cè)序文庫(kù)雙末端測(cè)序技術(shù)的嘗試：包括150bp、 500 bp、2 kb、5 kb 和10 kb不同插入片段，測(cè)序深度達(dá)73倍，覆蓋94%的基因組區(qū)域；獲得2.7M SNP位點(diǎn)，證明大熊貓仍然具備很高的雜合率和較高的遺傳多態(tài)性,Li et al., Nature (2009) 463：311-317,大熊貓基因組從頭測(cè)序和組裝,大熊貓基因組從頭測(cè)序和組裝,利用9個(gè)Sanger測(cè)序的BAC序列評(píng)價(jià)測(cè)序的質(zhì)量，表明98%的BAC序列可以比對(duì)到scaffold上 預(yù)測(cè)大熊貓約有21001個(gè)基因,大熊貓與人、狗和鼠的基因進(jìn)化分析,測(cè)序數(shù)據(jù)與BAC序列

5、比較,基因組從頭測(cè)序經(jīng)典策略,從頭測(cè)序的數(shù)據(jù)分析和產(chǎn)出,從頭測(cè)序的覆蓋度指標(biāo),從頭測(cè)序主要數(shù)據(jù)分析,原始數(shù)據(jù),比對(duì),組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì),覆蓋度、深度評(píng)價(jià),基因注釋,比較基因組 及進(jìn)化分析,藍(lán)藻 1 Mb,線蟲(chóng) 100 Mb,果蠅100 Mb,人 3,000 Mb,基因和基因組進(jìn)化,小鼠 3,000 Mb,生物進(jìn)化譜系樹(shù),大鼠、小鼠 、狗、大熊貓、牛,家雞、火雞,斑馬魚(yú),擬南芥、水稻、楊樹(shù)、 釀酒葡萄、短柄草、 黃瓜、高粱、玉米,1535個(gè)細(xì)菌基因組、49個(gè)真菌基因組和78個(gè)古細(xì)菌,利什曼原蟲(chóng)、椎體蟲(chóng),四類藍(lán)藻,隱藻,蜜蜂,單分子測(cè)序技術(shù)及其對(duì)從頭測(cè)序的影響,單分子實(shí)時(shí)測(cè)序，無(wú)需PCR擴(kuò)增 運(yùn)行時(shí)間1

6、5min或者更短，讀長(zhǎng)達(dá)到5-50K，數(shù)據(jù)產(chǎn)出100-1000G；使人類基因組測(cè)序成本低于1000美元,主要報(bào)告內(nèi)容,高通量測(cè)序簡(jiǎn)介 從頭測(cè)序及其應(yīng)用 重測(cè)序及其應(yīng)用 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及其應(yīng)用 Small RNA測(cè)序及其應(yīng)用,瑞士和美國(guó)科學(xué)家 對(duì)8個(gè)家雞品系和1個(gè)野生品系進(jìn)行測(cè)序 該研究可以用于動(dòng)物育種及提高家雞在生物醫(yī)藥研究模式動(dòng)物中的應(yīng)用,Rubin et al., Nature (2010) 464:doi:10.1038,通過(guò)全基因組重測(cè)序分析雞馴養(yǎng)過(guò)程中的位點(diǎn)選擇,通過(guò)全基因組重測(cè)序分析雞馴養(yǎng)過(guò)程中的位點(diǎn)選擇,測(cè)序完成44.5倍測(cè)序深度，測(cè)序覆蓋度達(dá)92% 發(fā)現(xiàn)7,000,000 SNP位

7、點(diǎn)，約1,300插入/缺失位點(diǎn) 研究發(fā)現(xiàn)基因功能缺失突變?cè)陔u馴養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有顯著性作用,缺失影響編碼區(qū)的基因,測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),篩選到兩個(gè)基因GHR（以前驗(yàn)證）和SH3RF2在育種中具有功能 在400個(gè)F8群體中分析SH3RF2的缺失對(duì)雞體重的影響 表明SH3RF2是篩選不同雞品系的一個(gè)重要指標(biāo),通過(guò)全基因組重測(cè)序分析雞馴養(yǎng)過(guò)程中的位點(diǎn)選擇,分析SH3RF2基因,中科院上海生命科學(xué)院、北京基因組所 等六家科研機(jī)構(gòu) 對(duì)150個(gè)水稻RIL系進(jìn)行測(cè)序 利用Illumina GA，每16個(gè)樣一個(gè)道，以3個(gè)堿基為標(biāo)簽，測(cè)序讀長(zhǎng)為36堿基，每個(gè)樣的測(cè)序深度約0.02倍 第一次利用全基因組重測(cè)序篩選SNP位點(diǎn)，對(duì)

8、群體進(jìn)行表型分析,利用全基因組重測(cè)序分析表型差異,利用全基因組重測(cè)序分析表型差異,分析兩個(gè)親本的基因組差異發(fā)現(xiàn)1,226,791 SNP位點(diǎn)，即3.2 SNPs/kb 分析150個(gè)RILs發(fā)現(xiàn)了1,493,461 SNP位點(diǎn)，即1 SNP/40kb,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),與以前的該RILs的重組圖譜比較分析，在150個(gè)RILs中鑒定出2334個(gè)重組框，平均每個(gè)框的大小約164 kb 利用sliding window方法分析SNP位點(diǎn)與表型間的關(guān)系與重組位點(diǎn),利用全基因組重測(cè)序分析表型差異,Sliding window方法,分析株高，共鑒定出4個(gè)QTL，其中貢獻(xiàn)率最強(qiáng)的1個(gè)QTL位點(diǎn)含有一個(gè)sd1基因，該基

9、因在2002年已被報(bào)道。 表明利用全基因組重測(cè)序可以進(jìn)行精確的QTL定位及基因定位,利用全基因組重測(cè)序分析表型差異,重測(cè)序生物信息學(xué)分析內(nèi)容,Genetech公司（已被羅氏制藥收購(gòu)）生物信息學(xué)與計(jì)算機(jī)生物學(xué)部，與Complete Genomics公司合作 對(duì)一名煙齡超過(guò)15年，平均每天吸煙25根的原發(fā)性肺部腫瘤患者進(jìn)行分析，將這名患者的癌細(xì)胞和相鄰正常組織的基因組進(jìn)行測(cè)序 對(duì)癌細(xì)胞完成了60倍的測(cè)序深度，相鄰正常組織完成了46倍的測(cè)序深度,Lee et al. Nature (2010) 465:473,肺癌組織的比較基因組學(xué)研究,測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),肺癌組織比較基因組研究,發(fā)現(xiàn)了超過(guò)5萬(wàn)個(gè)基因點(diǎn)突

10、變，其中530個(gè)得到確認(rèn)，它們當(dāng)中392個(gè)在編碼區(qū)域，包括以前已知的變異，如KRAS“原致癌基因”突變和放大,體細(xì)胞單核苷酸突變趨勢(shì)和模式統(tǒng)計(jì),MAPK信號(hào)通路中多個(gè)基因的突變的作用模式,肺癌組織比較基因組研究,表明遺傳上復(fù)雜的腫瘤可能包含很多部分冗余的突變，而且要識(shí)別復(fù)發(fā)性致癌“驅(qū)動(dòng)突變”（driver mutation），將需要對(duì)很多尚未測(cè)序的樣本進(jìn)行測(cè)序。這些癌基因的發(fā)現(xiàn)對(duì)于未來(lái)研究肺癌靶向治療，以及基因突變具有重要的意義,猶他大學(xué)（University of utah），Complete Genomics公司，華盛頓大學(xué)等 對(duì)一對(duì)夫妻和他們的兩個(gè)孩子進(jìn)行了全基因組測(cè)序。這家的兩個(gè)孩子都

11、患有米勒綜合征和原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙，這兩種疾病都是常染色體隱性遺傳病 測(cè)序深度分別為父親 88倍，母親51 倍，兒子52 倍，女兒54 倍,Coach et al., Science (2010) 328 (597):636 639,應(yīng)用全基因組測(cè)序技術(shù)在家系中分析遺傳力,父母和子女的測(cè)序覆蓋度分別達(dá)到91%、85%、92%和91% 與參考序列相比，96%序列至少在一個(gè)家系成員中被檢測(cè)到，81%序列在家系四個(gè)成員中都檢測(cè)到,應(yīng)用全基因組測(cè)序技術(shù)在家系中分析遺傳力,測(cè)序數(shù)據(jù)與NCBI參考基因組序列比較分析,測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),通過(guò)比較兩代之間的基因組序列，科學(xué)家們對(duì)兒童基因組描繪出精確的重組圖譜。這讓

12、他們校正了70%的測(cè)序錯(cuò)誤，使測(cè)序準(zhǔn)確率達(dá)99.999% 。使研究人員精確確定了重組位點(diǎn)和稀有的單核苷酸多態(tài)性。 在他們最終的分析中，只保留了四個(gè)候選基因的突變，包括已知在纖毛運(yùn)動(dòng)障礙中突變的基因以及導(dǎo)致米勒綜合征的變異體,應(yīng)用全基因組測(cè)序技術(shù)在家系中分析遺傳力,重組圖譜,SNP分析,這些結(jié)果暗示對(duì)任何簡(jiǎn)單的單基因遺傳病，一個(gè)或兩個(gè)家庭的全基因組測(cè)序就有可能鑒定出致病突變 研究人員還第一次估算出兩代人之間的遺傳突變率，即基因組從一代人到下一代人的遺傳過(guò)程中會(huì)發(fā)生多大程度的改變，約為1.110-8。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從父母到孩子的基因變異率僅為之前醫(yī)學(xué)界預(yù)期的一半,應(yīng)用全基因組測(cè)序技術(shù)在家系中分析遺傳力

13、,哈佛醫(yī)學(xué)院計(jì)算遺傳中心主任George Church提出 PGP目標(biāo)是創(chuàng)建一個(gè)包含100,000人、公眾可以公開(kāi)訪問(wèn)的在線基因庫(kù)，幫助科學(xué)家了解基因之間的聯(lián)系和遺傳特征 現(xiàn)已公布了1000人的基因組序列 個(gè)人基因組測(cè)序是個(gè)性化醫(yī)療保健的基礎(chǔ),個(gè)人基因組計(jì)劃（PGP,,George Church 和他的研究團(tuán)隊(duì),重測(cè)序意義,在個(gè)體或群體水平進(jìn)行差異性分析 輔助分子育種，能夠快速的進(jìn)行種質(zhì)資源普查篩選 遺傳進(jìn)化分析及重要性狀候選基因預(yù)測(cè) 遺傳疾病分析,主要報(bào)告內(nèi)容,高通量測(cè)序簡(jiǎn)介 從頭測(cè)序及其應(yīng)用 重測(cè)序及其應(yīng)用 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及其應(yīng)用 Sm

14、all RNA測(cè)序及其應(yīng)用,RNA是遺傳信息的載體,應(yīng)用RNA-seq分析葡萄漿果發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)錄組,意大利維羅納大學(xué) Vitis vinifera（葡萄）漿果發(fā)育三個(gè)階段中（開(kāi)花后5周、10周和15周，即著果期、轉(zhuǎn)色期和成熟期三種發(fā)育階段中）的轉(zhuǎn)錄組研究 數(shù)據(jù)量超過(guò)59M的36至44bp讀長(zhǎng) ，82%的測(cè)序序列能夠比對(duì)到基因組上 第一次使用RNA-seq分析葡萄漿果發(fā)育過(guò)程中的基因轉(zhuǎn)錄差異,有參考序列,分析92,051剪切點(diǎn)，大約0.8%剪切點(diǎn)參與385個(gè)基因的可變剪切 與葡萄參考基因組（Pinot Noir 40024 ）比較，檢測(cè)到85870個(gè)eSNP,應(yīng)用RNA-seq分析葡萄漿果發(fā)育轉(zhuǎn)

15、錄組,分析基因的可變剪切,鑒定了漿果發(fā)育過(guò)程中的17324個(gè)基因，其中的6695的基因是以時(shí)期特異性方式表達(dá)的 分析漿果發(fā)育過(guò)程中的marker基因，表明RNA-seq分析的準(zhǔn)確性,應(yīng)用RNA-seq分析葡萄漿果發(fā)育轉(zhuǎn)錄組,中科院上海生命科學(xué)院、北京基因組 所和上海交通大學(xué) 對(duì)一個(gè)japonica (Nipp) 和兩個(gè) indica (Gla4 and 93-11)發(fā)芽?jī)芍艿臉悠愤M(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 每個(gè)樣本兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣本測(cè)三次，240堿基測(cè)兩次和276堿基測(cè)一次 第一次運(yùn)用高通量測(cè)序分析轉(zhuǎn)錄組以鑒定外顯子剪切位點(diǎn),運(yùn)用RNA-seq對(duì)水稻轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行功能注釋,有參考序列,與參考序列比較，約

16、38.8%57.3%能夠比對(duì)到基因組的一個(gè)位置上 共鑒定了15708個(gè)新的TARs（transcriptional active regions,運(yùn)用RNA-seq對(duì)水稻轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行功能注釋,測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),新的TAR統(tǒng)計(jì),約48%的水稻基因具有可變剪切，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以前預(yù)測(cè)的頻率 檢測(cè)到參考基因注釋中的83.1%基因 6228個(gè)基因的5和/或3末端至少比預(yù)測(cè)的延長(zhǎng)50bp,運(yùn)用RNA-seq對(duì)水稻轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行功能注釋,浙江大學(xué) 對(duì)白粉虱的蟲(chóng)卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 用1個(gè)flow cell進(jìn)行測(cè)序，可用數(shù)據(jù)約43M，讀長(zhǎng)為75bp,無(wú)參考序列,從頭分析白粉虱轉(zhuǎn)錄組,從頭分析白粉虱轉(zhuǎn)錄組,拼接

17、完成4,274,766 contigs，170,115 scaffolds 利用TGICL軟件分析產(chǎn)生168,900個(gè)unique序列（平均長(zhǎng)度=266bp) 由于unique序列較短，83.8% unique序列無(wú)法進(jìn)行基因功能注釋 與NCBI數(shù)據(jù)比對(duì)成功的序列97%序列長(zhǎng)度超過(guò)2000bp,GO分析能夠把7,330 unigene序列歸類到52個(gè)有功能群中 COG分析歸類7790 unigene序列到25類中 KEGG通路分析能夠?qū)?1,104個(gè)unigene序列歸類到214個(gè)通路中,從頭分析白粉虱轉(zhuǎn)錄組,列入研究白粉虱對(duì)殺蟲(chóng)劑具有很高的抗性 昆蟲(chóng)基因組中約有1011個(gè)煙酰胺乙酰膽堿受體亞

18、基基因 檢測(cè)到28個(gè)煙酰胺乙酰膽堿受體相關(guān)的序列，分析共鑒定9個(gè)不同的受體序列,從頭分析白粉虱轉(zhuǎn)錄組,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序生物信息學(xué)分析內(nèi)容,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序應(yīng)用領(lǐng)域,轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究：UTR鑒定、Intron邊界鑒定、可變剪切研究、Start codon鑒定等 基因轉(zhuǎn)錄水平研究 全新轉(zhuǎn)錄區(qū)域研究 Non-coding RNA研究,主要報(bào)告內(nèi)容,高通量測(cè)序簡(jiǎn)介 從頭測(cè)序及其應(yīng)用 重測(cè)序及其應(yīng)用 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及其應(yīng)用 Small RNA測(cè)序及其應(yīng)用,miRNA是調(diào)控基因表達(dá)的一種普遍方式,俄克拉荷馬州立大學(xué) ，生物化學(xué)與分子生物學(xué)系 對(duì)逆境條件干旱、高鹽和正常條件下的水稻4周幼苗進(jìn)行miRNA測(cè)序 三種處理分別得到102,876、54,016 和174,530 測(cè)序序列( 43003、80990和58781個(gè)miRNAs,利用高通量測(cè)序鑒定水稻miRNA,目前水稻中公布的miRNA家族為53個(gè)，鑒定了23種新的miRNA 6種新的miRNA為單子葉植物特有的miRNA 預(yù)測(cè)了40個(gè)候選miRNA,利用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定水稻miRNA,單子葉植物特有的miRNA,預(yù)測(cè)了9種新發(fā)現(xiàn)miRNA的20個(gè)靶點(diǎn) 分析miRNA的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)特異性表達(dá)的miRNA，而保守