宮頸癌細胞MFGE8表達與生物學的相關性

1、宮頸癌細胞MFGE8表達與生物學的相關性目的探討宮頸癌細胞乳脂肪球表皮生長因子8蛋白(MFGE8)表達與生物學行為的相關性。方法Si-Ha細胞分為三組:對照組、實驗1組與實驗2組，對照組不進行轉染，實驗1組與實驗2組分別轉染siNA1-MFGE8與siNA2-MFGE8，采用實時熒光定量PC檢測MFGE8mNA表達，Westernblot檢測MFGE8蛋白表達，CCK-8法檢測細胞增殖能力，流式細胞術檢測細胞周期與細胞凋亡。結果轉染24h與48h后，實驗1組與實驗2組的MFGE8mNA與蛋白相對表達水平、細胞增殖指數(shù)都低于對照組(P005)，細胞凋亡指數(shù)顯著高于對照組(P005)，實驗1組與實

2、驗2組之間對比差異無統(tǒng)計學意義(P005)。轉染后48h，三組的細胞G1、S、G2/M期對比差異都無統(tǒng)計學意義(P005)。結論宮頸癌細胞中MFGE8表達呈現(xiàn)高表達情況，抑制MFGE8能抑制宮頸癌細胞的增殖，促進其凋亡，但是對細胞周期無顯著影響。宮頸癌;乳脂肪球表皮生長因子8蛋白;生物學行為;相關性宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，宮頸癌在我國的發(fā)病率逐年增加，嚴重威脅女性的身心健康1。高危型人乳頭瘤病毒(humanpapillomavims，HPV)的持續(xù)感染是宮頸癌的主要誘發(fā)因素，至少80%左右的宮頸癌患者在病程進展中存在生殖器HPV感染2-3。乳脂肪球表皮生長因子8蛋白(milkfat

3、globuleEGFfactor8，MFGE8)作為1種分泌性糖蛋白，在巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、肌上皮細胞、樹突狀細胞等都有廣泛分布4。MFGE8在腫瘤組織中表達明顯高于正常組織，其表達分布與病程長短密切相關，可能成為判斷腫瘤患者預后的特異性指標5-7，但是在宮頸癌中的應用還無相關報道。本文具體探討了宮頸癌細胞MFGE8表達與生物學行為的相關性，希望可豐富對宮頸癌致癌分子機制的認識，并為發(fā)現(xiàn)宮頸癌治療的新靶點提供一定的基礎?，F(xiàn)報告如下。1材料與方法11實驗材料SiHa細胞株由本實驗室保存，其為宮頸癌HPV16陽性的鱗癌細胞，培養(yǎng)條件:10%胎牛血清(美國Hy-Clone公司)+DMEM培養(yǎng)基(美國

4、HyClone公司)，37、5%培養(yǎng)箱。025%胰酶消化液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑購自上海碧云天生物技術有限公司，CCK-8試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司，Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。12實驗分組與處理根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中MFGE8基因的序列設計si-siNA-MFGE8序列兩條，交由上海吉瑪公司合成。siNA1-MFGE8:5-ACAGAACACUCAUGGAUUATT-3(正鏈)，5-UAAUCCAUGAGUGUUCUGUTT-3(負鏈);siNA2-MFGE8:5-CGAGCACAAACGGAAACAAT

5、T-3(正鏈)，5-UUGUUUCCGUUUGUGCUCGTT-3(負鏈)。SiHa細胞分為3組:對照組、實驗1組與實驗2組，對照組不進行轉染，實驗1組與實驗2組分別轉染siNA1-MFGE8與siNA2-MFGE8。在轉染過程中，配制細胞轉染混合液，在6孔板(對數(shù)生長期且細胞狀態(tài)良好的SiHa細胞)相應孔內(nèi)依次加入500μl無血清培養(yǎng)基，5μlsi-NA轉染試劑LipofectamineNAiMAX，混勻靜置5min后再加入2μlsi-NA，在混勻靜置20min。將細胞懸液按滴加入各孔，然后常規(guī)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)6h后進行換液。13實時熒光定量PC檢測MFGE8mNA表達使用T

6、aKaaSYBPremix試劑進行實時熒光定量PC反應，配置體系:2×mix50μl，正鏈引物05μl，負鏈引物05μl，模板20μl，滅菌水65μl，將混合液加入實時熒光定量PC8連排管中，每個樣品設置3個復孔。14Westernblot檢測MFGE8蛋白表達胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的細胞，收集細胞，加入預冷的IPA裂解液，冰上裂解30min，4，12000rpm，離心15min，取上清，即細胞總蛋白。使用BCA法測定蛋白濃度，然后上樣SDS-PAGE膠進行電泳，電泳后進行轉膜，室溫封閉3h后加入抗MFGE8抗體與抗β-actin抗體各2

7、μl(一抗稀釋濃度11000)，4過夜;洗膜后加入二抗(稀釋濃度110000)2μl，室溫1h，然后進行ECL曝光，記錄MF-GE8蛋白相對表達水平。15CCK-8法檢測細胞增殖能力胰蛋白酶消化細胞并接種于96孔板中，每孔細胞數(shù)量大約為30004000個，每組細胞設置3個復孔。培養(yǎng)48h后向每孔加入10μlCCK-8工作液，振蕩混勻后繼續(xù)培養(yǎng)2h，使用酶標儀測定450nm處的吸光光度值，記錄與計算細胞增殖指數(shù)。16流式細胞術檢測細胞周期與細胞凋亡胰蛋白酶消化細胞并收集細胞，采用用100μl預冷的PBS重懸細胞，再加入500μl預冷的75%乙醇固定細胞，4放置12h

8、后采用流式細胞術檢測細胞周期。在細胞凋亡檢測中，用400μl1×AnnexinV結合液懸浮細胞，加入5μlAnnexinV-FITC染色體，混勻后4避光條件下孵育15min，加入10μlPI染色液后輕輕混勻于4避光孵育5min，采用流式細胞術檢測細胞凋亡指數(shù)。上述所有實驗都重復3次，取3次檢測的平均值。17統(tǒng)計方法應用SPSS2200軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以(x珋±s)表示，兩兩對比采用t檢驗、LSD方法，多組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準為α=005，P005為存在統(tǒng)計學差異。2結果21MFGE8mNA與蛋白表達水平對比轉染24

9、h與48h后，與對照組相比，實驗1組與實驗2組的MFGE8mNA與蛋白相對表達水平都顯著降低(P005)，實驗1組與實驗2組之間對比差異無統(tǒng)計學意義(P005)。見表1。22細胞增殖指數(shù)對比轉染24h與48h后，實驗1組與實驗2組的細胞增殖指數(shù)顯著低于對照組(P005)，實驗1組與實驗2組之間對比差異無統(tǒng)計學意義(P005)。見表2。23細胞凋亡指數(shù)對比轉染24h與48h后，實驗1組與實驗2組的細胞凋亡指數(shù)顯著高于對照組(P005)，實驗1組與實驗2組之間對比差異無統(tǒng)計學意義(P005)，見表3。24細胞周期對比轉染后48h，三組的細胞G1、S、G2/M期對比差異都無統(tǒng)計學意義(P005)，見

10、表4。3討論宮頸癌是由于宮頸細胞的增生異常引起的惡性腫瘤，當前在我國年輕女性中的發(fā)病人數(shù)逐年增加，嚴重威脅著女性的生命和健康8。該病在發(fā)生發(fā)展過程中多伴隨有異常的陰道出血、骨盆疼痛等癥狀，嚴重情況下可出現(xiàn)下腹部劇烈疼痛，導致無法下地行走等9。該病的高危因素比較多，包括機體免疫系統(tǒng)功能低下、HPV病毒感染、吸煙、長期使用避孕藥等10-11。雖然HPV多價疫苗能夠有效預防宮頸癌的發(fā)生，但是在臨床上的普及仍存在很大問題，為此早期分析宮頸癌的發(fā)生機制具有重要價值12。MFGE8是1種存在于多種物種乳汁脂肪小球表面的親脂性糖蛋白，主要由膽固醇、磷脂、糖蛋白、蛋白脂構成，主要由分化的乳腺上皮細胞合成，然后

11、經(jīng)膜包被分泌人乳導管腔13。MFGE8在乳腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)MFGE8的分泌量顯著提高，可通過辨認暴露于凋亡上皮細胞表面的絲氨酸與凋亡的上皮細胞結，從而加快對凋亡細胞的清除14。MFGE8在惡性腫瘤的高表達還可抑制病毒的表達，促進凋亡上皮細胞的清除，從而促進腫瘤細胞的快速增殖與轉移15。本研究顯示轉染24h與48h后，實驗1組與實驗2組的細胞增殖指數(shù)顯著低于對照組，細胞凋亡指數(shù)顯著高于對照組，實驗1組與實驗2組之間對比差異無統(tǒng)計學意義，表明抑制MFGE8的表達能抑制宮頸癌細胞增殖與促進細胞凋亡。從機制上分析，MFGE8可以通過調(diào)節(jié)NF-kB、P53等多種轉錄因子與DNA的結合能力，加快血管內(nèi)皮生長

12、因子的表達量，從而促進腫瘤細胞快速增長16。并且MFGE8可通過促使DNA前體合成、抑制由細胞黏附促發(fā)的應激信號等多種途徑促進腫瘤細胞的增殖及生長17。當前在臨床上主要采取手術、放療和化療等手段對宮頸癌進行治療，但是很難持續(xù)改善患者的預后18。而無論是抑癌基因還是癌基因，均是細胞中的正?；颍吖餐{(diào)控細胞的分化、凋亡、周期、增殖等生物學行為，當癌基因過度表達或者抑癌基因表達被抑制，都會導致細胞的異常增殖與分化，也會導致細胞周期失控19。本研究顯示轉染后48h，三組的細胞G1、S、G2/M期對比差異都無統(tǒng)計學意義，表明抑制MFGE8的表達對宮頸癌細胞的細胞周期無顯著影響。當前有研究顯示MFGE8的高表達通過結合腫瘤細胞膜上磷脂酰絲氨酸，促進細胞向前移動爬行，導致細胞的形態(tài)及骨架結構發(fā)生改變，從而加速細胞的侵襲，并且還通過增強對抗癌藥物的耐藥作用影響患者的預后2