HPV分子生物學(xué)與宮頸病變病理診斷

1、HPV分子生物學(xué)及宮頸病變病理診斷,一，HPV簡介 二，HPV與宮頸癌的關(guān)系 三，HPV相關(guān)細(xì)胞學(xué)形態(tài)改變及判讀要點(diǎn) 四，HPV檢測方法及宮頸病變的病理診斷 五，HPV疫苗的研究進(jìn)展,一）HPV簡介,1.完整的病毒顆粒為一個感染單位，外形呈20面體對稱型，外殼有72個衣殼體。 2.HPV基因組為環(huán)狀雙鏈DNA，含有近8000個堿基對。分為早期區(qū)，晚期區(qū)和長控區(qū),Human papillomavirus（HPV,早期轉(zhuǎn)錄區(qū)：參與病毒DNA的復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，翻譯，調(diào)控和細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)：編碼病毒的衣殼蛋白。 上游調(diào)控區(qū)：又稱長控區(qū)，通過與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用調(diào)節(jié)早期區(qū)基因的轉(zhuǎn)錄，參與病毒復(fù)制，轉(zhuǎn)錄

2、的調(diào)控,二）HPV與宮頸癌的關(guān)系,宮頸癌是第一個被確定有單一明確病因的癌癥，即高危型HPV感染。 HPV感染普遍存在，但是引起的宮頸癌卻相對少見。 高危型HPV總感染率大概在10%，15歲到25歲感染率最高。 HPV感染平均為6-9個月，70%的HPV感染在一年內(nèi)清楚，兩年內(nèi)的清除率可達(dá)90,HPV感染引起的低度病變（CIN1）不是癌前病變，大多會自然轉(zhuǎn)愈，對于任何致癌性HPV，診斷CIN1并不意味著發(fā)展成CIN3的風(fēng)險比活檢陰性者高。 HPV病毒量的多少跟宮頸癌的發(fā)生有一定的相關(guān)性，但是不成正比，不能預(yù)測疾病的進(jìn)展。 有效預(yù)防HPV感染，就能減少甚至不得宮頸癌,通過微小破損感染上皮組織。 通

3、過胞吞作用使整個病毒顆粒侵入上皮基底層細(xì)胞，繼而通過不明的機(jī)制被傳送到細(xì)胞核。 正常情況下，病毒基因中的E1，E2，E4，E5低表達(dá)，有利于病毒基因組的維持和細(xì)胞增生。表達(dá)水平增高促進(jìn)病毒基因組復(fù)制。 隨著宿主角質(zhì)細(xì)胞開始分裂并逐漸分化為上皮表層，L1和L2蛋白表達(dá)促使病毒組裝形成感染性病毒顆粒，而E4高表達(dá)則使細(xì)胞胞漿破壞，凹陷，促進(jìn)病毒釋放,HPV自然生活史（游離狀態(tài),高危型HPV病毒持續(xù)性感染。 病毒DNA與宿主細(xì)胞DNA發(fā)生整合，病毒與之整合的部 位位于E2編碼區(qū)。 HPV整合導(dǎo)致E2片段缺失，失去了對E6，E7的正常調(diào)控，導(dǎo)致其過度表達(dá)。 E6與P53結(jié)合并使之降解，并能阻止和干擾細(xì)

4、胞凋亡，引起細(xì)胞無限增生并向惡性轉(zhuǎn)化。 E7與pRB結(jié)合，使E2F得以釋放，從而使細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)化，細(xì)胞周期失控而發(fā)生永生化。 E6，E7編碼的原癌蛋白表達(dá)，導(dǎo)致人類染色體端粒體酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因（hTERC）擴(kuò)增，維持端粒長度，細(xì)胞永生，免于凋亡，發(fā)生癌變,HPV致癌機(jī)制（整合狀態(tài),宮頸癌發(fā)生過程,三）HPV相關(guān)細(xì)胞學(xué)形態(tài)改變及判讀要點(diǎn),多數(shù)HPV感染并沒有細(xì)胞學(xué)異常，大約只有30%的HPV感染會產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞病理學(xué)變化。 HPV引起的細(xì)胞學(xué)形態(tài)改變不僅僅表現(xiàn)挖空細(xì)胞特征，還包括ASC和HSIL的病變特點(diǎn)。 挖空細(xì)胞只說明有HPV感染，但無法分清楚是低危型還是高危型。 HPV分子生物學(xué)

5、行為對應(yīng)TBS報(bào)告術(shù)語,典型的挖空細(xì)胞判讀為LSIL，不典型的挖空細(xì)胞判讀為ASC-US或ASC-H. 理解LSIL的定義，其實(shí)就是要弄清楚以下這個問題： 組織學(xué)的CIN1指的是下1/3的細(xì)胞異型，而與之對應(yīng)的LSIL則是表層細(xì)胞形態(tài)的異常，如何解釋,LSIL,LSIL,糖原溶解細(xì)胞VS挖空細(xì)胞,LSIL（HPV病毒游離狀態(tài)，一過性感染） 細(xì)胞學(xué)診斷的要點(diǎn)： 1.細(xì)胞成熟，為表層細(xì)胞來源。 2.核周空暈透亮，為胞漿塌陷或被破壞造成,LSIL ASC-US,ASC-US,ASC-US（可疑HPV一過性感染，無典型挖空表現(xiàn)） 細(xì)胞學(xué)診斷要點(diǎn)： 1.核有一定異型，有挖空趨勢，但核周空暈不透亮。 2.

6、成片聚集的表層細(xì)胞，核輕度增大或雙核，可伴有角化不全現(xiàn)象,HSIL,HSIL（HPV病毒整合狀態(tài)，持續(xù)性感染） 細(xì)胞學(xué)診斷要點(diǎn)： 1.高核漿比。 2.核的異型性，主要體現(xiàn)在核膜的不規(guī)則以及核染色質(zhì)增粗,CIN3,CIN3,CIN3（ HPV病毒整合狀態(tài)，持續(xù)感染，向?qū)m頸癌進(jìn)展） 組織學(xué)診斷要點(diǎn)： 1.核異型明顯（腫瘤異倍體細(xì)胞的表現(xiàn)）。 2.中表層細(xì)胞出現(xiàn)病理性核分裂像。 3.全層細(xì)胞密度增加，極性紊亂，喪失正常的組織結(jié)構(gòu)。 4.表層細(xì)胞不出現(xiàn)典型的挖空細(xì)胞形態(tài),四）HPV檢測方法及宮頸病變的病理診斷,HPV檢測： 1.病毒DNA檢測 2.病毒mRNA檢測 3.病毒相關(guān)蛋白檢測 4.病毒靶向檢

7、測,低危型HPV主要見于生殖器疣，常見的型別為6型和11型。 高危型HPV與癌前病變和宮頸癌相關(guān)，常見的型別為16型和18型。 檢測方法有分型檢測與不分型檢測,HPV-DNA檢測,HC2（不分型,操作步驟： 裂解雜交捕獲抗原抗體反應(yīng)信號放大結(jié)果判讀,HC2結(jié)果判讀：1.0pg/ml為陽性，相當(dāng)于5000拷貝。 如何正確理解HC2的檢測結(jié)果,PCR-RDB（分型檢測,DA8000全自動核酸分子雜交儀,HPV-DNA分型檢測的臨床意義？ 能區(qū)分持續(xù)或反復(fù)感染。 不同型別有不同的患病風(fēng)險。 不同型別有不同的處理方案。 ASCCP2009版指南指出：30歲女性 細(xì)胞學(xué)陰性，而HPV16或18型陽性者，

8、建議陰道鏡檢測。 細(xì)胞學(xué)陰性，其它HR-HPV型陽性者，一年后復(fù)查HPV-DN 和細(xì)胞學(xué),HPV E6，E7 mRNA檢測,HPV 的E6、E7是病毒癌基因，它們的翻譯產(chǎn)物介導(dǎo)抑癌基因p53和Rb的降解，從而干擾細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。如若癌基因沒有表達(dá)，則細(xì)胞本身不會發(fā)生癌變。 E6蛋白能與細(xì)胞內(nèi) E6相關(guān)蛋白 ( E6 AP)形成復(fù)合物 ,特異性地結(jié)合 p53,并通過依賴蛋白酶系統(tǒng)將其水解 ,使其對細(xì)胞生長負(fù)調(diào)節(jié)功能喪失 ,從而引起細(xì)胞無限增生并向惡性轉(zhuǎn)化。 E7蛋白是 HPV的主要轉(zhuǎn)化蛋白 ,與控制細(xì)胞周期有關(guān)的腫瘤抑制蛋白視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白 (Rb)親和力極高 . E7與 Rb結(jié)合使 Rb E2

9、F復(fù)合物解離 , E2F被游離 ,從而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的作用 ,導(dǎo)致細(xì)胞周期失控而發(fā)生永生化。 HPV E6/E7mRNA 在宮頸組織中表達(dá)，說明HPV 病毒表達(dá)出癌基因活性,bDNA技術(shù)原理,HPV 相關(guān)蛋白檢測,人體的細(xì)胞周期包括G1，S,G2，M四個時相，且存在多個檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)各時相點(diǎn)的轉(zhuǎn)換及細(xì)胞周期進(jìn)程。其中以G1S期最為重要，因?yàn)榧?xì)胞一旦從G1期進(jìn)入S期，則不再依賴外界信息刺激而很快自動完成分裂過程，因此G1卡點(diǎn)可以決定細(xì)胞繼續(xù)增值或進(jìn)入G0期或離開細(xì)胞周期進(jìn)入終末分化或死亡。 細(xì)胞周期卡點(diǎn)的轉(zhuǎn)換受控于“細(xì)胞周期蛋白（cyclins）-細(xì)胞周期依賴性激酶（cdks）-細(xì)胞周期依賴性激酶抑

10、制因子（clks）”這組分子網(wǎng)絡(luò)。 研究最為廣泛的一組是：Cyclin D1/cdk4/P16。P16在細(xì)胞周期G1卡點(diǎn)中與CyclinD1競爭結(jié)合cdk4并特異性抑制其活性，組織細(xì)胞尤其是帶有損傷DNA的細(xì)胞進(jìn)入S期，從而控制細(xì)胞分裂,P16： 1.在LSIL的敏感性和特異性為74%，在HSIL中則達(dá)到97%以上。 2.在LSIL中的表達(dá)為點(diǎn)狀，散在分布；在HSIL中的表達(dá)為灶狀，片狀連續(xù)分布,P16,P16,Cyclin D1： 1.在正常宮頸組織中低表達(dá)，在CIN和宮頸鱗癌中表達(dá)增加并逐漸加強(qiáng)。 2.促進(jìn)細(xì)胞周期紊亂，細(xì)胞異常增殖。CyclinD1過度表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞G1期縮短，細(xì)胞過度

11、增殖失控而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生,Ki-67: 1.在細(xì)胞周期的G1后期，S,G2，M期呈高表達(dá)，而在靜止的G0期細(xì)胞呈低表達(dá)。 2.Ki-67半衰期短，脫離細(xì)胞周期后迅速降解，檢測結(jié)果的可靠性明顯優(yōu)于半衰期長的增殖細(xì)胞核抗原，是最能反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的蛋白標(biāo)志物之一。 3.Ki-67用于CIN的鑒別診斷，主要用于萎縮性病例，而對反應(yīng)性改變，化生性改變，修復(fù)性改變意義不大（細(xì)胞增殖指數(shù)也很高,Ki-67,HPV分子靶向檢測,hTERC: 宮頸細(xì)胞由非典型性發(fā)育異常向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)變的過程中幾乎都伴有3號染色體長臂擴(kuò)增。其中，涉及到的最重要的基因可能是人類染色體末端酶（hTERC）基因。該基因的擴(kuò)增可阻止細(xì)胞凋

12、亡，因而可導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生?，F(xiàn)已得知，3號染色體長臂擴(kuò)增能準(zhǔn)確區(qū)分宮頸細(xì)胞高度癌前病變與低度癌前發(fā)育異常，鑒別診斷的敏感性及特異性均在90%以上,人類染色體末端酶基因-hTERC基因,hTERC基因定位在3q26.3 hTERC基因的作用： 編碼人類染色體端粒酶的重要基因， 影響細(xì)胞凋亡,端粒酶活性,端粒,影響,影響,與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),hTERC基因狀態(tài),hTERC檢測的意義,49,ASCUS CIN1,CIN2/3,TERC 基因,ASC CIN1,LSIL與HSIL的輔助判斷指標(biāo),宮頸脫落細(xì)胞FISH探針,CSP3,TERC,hTERC基因定位于3q26.3,3號染色體著絲粒信號,正常,擴(kuò)增

13、,hTERC基因檢測（fish,四）HPV疫苗,目前已分離出的HPV達(dá)100多型，其中至少14型可導(dǎo)致宮頸癌。 16型與18型是最常見的高危型，大約70%宮頸癌由這兩種型別引起。 6型和11型是最常見的低危型，與90%生殖器尖銳濕疣相關(guān)。 中國：HPV16（76.7%），HPV18（7.8%），HPV31（3.2%），HPV52（2.2%），HPV58（2.2,HPV流行病學(xué),HPV疫苗： 四價疫苗（6,11,16,18） 2006年6月，美國FDA正式批準(zhǔn)美國默克公司生成的四價預(yù)防性疫苗Gardasil的注冊。 建議針對9-26歲的女性使用。在美國和其它部分國家，該疫苗還被批準(zhǔn)用于預(yù)防性男性生殖器疣,二價疫苗（16,18）： 2007年注冊的英國葛蘭素史克生成的二價疫苗Cervarix. 批準(zhǔn)用于10歲以上的女性。尚未申請?jiān)谀行灾惺褂玫倪m應(yīng)癥,疫苗為無菌混懸液，需儲存在2-8環(huán)境下，不能冷凍。 肌肉注射，注射后觀察15分鐘。 接種分三次進(jìn)行（第一針,1或2個月后第二針，6個月后第三針） 對其它疫苗有嚴(yán)重過敏史的人或孕期女性禁用。 預(yù)防性HPV疫苗