高效液相色譜法測定化妝品中四種雌激素

1、第 34 卷 第12 期宜春學院學報Vol. 34，No.122012 年 12月Journal of Yichun CollegeDec. 2012高效液相色譜法測定化妝品中四種雌激素余曉，袁凱松，翟海云，盧綺雯，潘育方*( 廣東藥學院 物分析系，廣東 廣州 510006)摘 要: 目的: 建立反相高效液相色 法同時測定化 品中的 4 種雌激素 ( 雌 、雌三醇、炔雌醇、己 雌酚) 的方法。方法: 色 柱 Inertsil ODS C18( 4. 6 mm 250 mm，5 m) ，流 相為甲醇 水( 體 比為 60: 40) ，流速1mL /min，檢測波長279nm，柱溫:25 。結果:

2、 4 種雌激素成分在 0. 05 500 g /mL 度范 內與其對應分峰面 性關系良好。 品的平均加 回收率為 97. 3% 110. 6% ，RSD 為 2. 9% 4. 0% ，化 品中四種雌激素的檢出限 0. 02 0. 03mg /kg。 方法操作 便、靈敏度高，能 同時 化 品中 4 種雌性激素的含量。關鍵詞: 高效液相色 法; 雌激素; 化 品中圖分類號: TQ658文獻標志碼: A文章編號: 1671 380X ( 2012) 12 0091 03Determination of Four Female Sex Hormone in Cosmetics by HPLCYU Xi

3、ao，YUAN Kai song，ZHAI Hai yun，LU Qi wen，PAN Yu fang*( Guangdong College of Pharmacy，Guangzhou 510006，China)Abstract: Object: To establish the RP HPLC method for the simultaneous determination of four female sex hormones ( estrone，es-triol，ethiny，diethylstilbestrol) in cosmetics. Method: The Intersil

4、 ODS C18 ( 4. 6 mm 250 mm，5 m) column was used; themobile phase consisted of methanol water ( 60: 40) ; the flow rate was 1. 0mL /min and the detection wavelength was at 279 nm; thecolumn temperature was at25. Result: Four hormones showed good linear response in the range of 0. 05 500 g /mL，LOD were

5、0. 02 0. 03mg /kg. The average recoveries were97. 3 110. 6% ，and RSD were2. 9 4. 0% . Conclusions: The results indicate that the method is simple，sensitive and can be used for the quality control of four hormones in cosmetics.Key words: HPLC; Female Sex Hormone; Cosmetics近年來，化妝品安全問題日益引起人們關注。對人體分離條件進

6、行了比較研究，建立了高效液相色譜法同時測定有害的物質被禁止或限用于化妝品生產。我國化妝品衛(wèi)生四種雌激素成分的方法。方法重現性好，目標物之間分離效規(guī)范 ( 2007 版) 1 共列出 1208 種禁用物質、73 種限用物果好，靈敏度高，可應用于各種類型化妝品中雌酮、雌三質，這些物質一般具有強烈的毒性、致突變性、致癌性、醇、炔雌醇、己烯雌酚四種雌激素的同時檢測。致畸性，或對皮膚、粘膜可造成明顯損傷。其中，該規(guī)范1 試藥與儀器明確規(guī)定了性激素為化妝品中禁用物質。但由于在化妝品高效液相色譜儀 ( 島津 LC 10ATvp 型輸液泵，島津中添加性激素能夠快速促進毛發(fā)生長，防止皮膚老化，并SCL 10Av

7、p 型控制器，PAD 檢測器，島津 LC Solution 色譜有除皺、增加皮膚彈性或治療粉刺等作用，故常被非法添工作站) 、超聲儀 ( 昆山市超聲儀器有限公司) 、離心機加到各類化妝品中，而這些含雌激素化妝品的長久使用會( 鞏義市予華儀器有限公司) 、數控恒溫水浴鍋 ( 北京康林導致皮膚色素沉積、產生黑斑、皮膚萎縮變薄，甚至具有科技有限責任公司) 、電子分析天平、0. 45m 微孔濾膜及致癌性，如雌性激素化妝品已有報道致細胞癌、子宮內膜配套注射器。2 5，對廣大消費者甲醇為色譜純試劑 ( Dima 公司) ，水為超純水，其余癌、乳腺癌、睪丸癌和兒童性早熟等的健康產生巨大的潛在威脅。試劑均為分

8、析純。雌三醇對照品 ( 批號 100935 200701) 、6，分光光炔雌醇對照品 ( 批號 100052 200308) 、雌酮對照品 ( 批化妝品中性激素分析技術主要有薄層色譜法789 10，號 100849 200501 ) 、己烯雌酚對照品 ( 批號 100033 度法、氣相色譜 質譜聯用法、高效液相色譜法11等。本文對多種不同類型化妝品的前處理、色譜200607) ，均購于中國藥品生物制品檢定所。電色譜收稿日期: 2012 09 12基金項目: 廣東省科技計劃項目 ( 2011B04030025) 。作者簡介: 余曉 ( 1972 ) ，男，博士，湖北人，講師，從事現代儀器分析技術

9、的教學與應用研究; 通訊作者: * 潘育方 ( 1966 ) ，男，教授，從事藥物新劑型及安全性評價研究。91第 12 期宜春學院學報第 34 卷2 方法與結果2. 1 色譜條件色譜柱: Inertisl ODS C18 柱 ( 4. 6 250mm，5m) ，流動相為甲醇 水 ( 體積比為 60: 40) ; 流速為 1mL /min，柱溫為 25 ，PDA 檢測器，檢測波長為 279nm，進樣量為20L。樣品測定采用色譜峰的保留時間定性，并以紫外吸收光譜圖輔助定性，外標法峰面積定量。此條件下，四種對照品、樣品的色譜圖見圖 1 2。1. 雌三醇; 2. 雌 ; 3. 炔雌醇; 4. 己 雌酚

10、圖 1 4 種激素標準品混合物的色譜圖2. 2 對照品和供試品溶液的制備分別稱取雌三醇、雌酮、炔雌醇、己烯雌酚對照品各2mg，置于 1mL 容量瓶中，分別用甲醇溶解并定容，配成質量濃度各為 2mg /mL 的標準溶液。分別移取上述各標準溶液適量到一系列 5mL 容量瓶中，用甲醇定容，配成一系列不同濃度的混合標準溶液。分別稱取 ( 膏狀、乳膏狀和水)化妝品試樣 1. 000g 于10. 0mL 具塞離心管中。每個試樣均準確加 8. 0mL 甲醇，超聲提取 30min，于 3000r /min 轉速下離心 15min。轉移上清液于 10. 0mL 具塞離心管中，氮氣吹干。加 3. 0mL 甲醇超聲

11、 10min 溶解殘渣，溶解后轉至 5. 0mL 離心管中，繼續(xù)用氮氣吹干。濃縮后用 1. 0mL 甲醇溶解，經 0. 45m 微孔濾膜過濾，濾液供測定用。2. 3 線性關系及檢出限在設定色譜條件下，標準工作液的濃度為 0. 05 500g /mL，分別取 20L 進行 HPLC 分析。以標準溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明四種雌激素均在 0. 05 500 g /mL 范圍內線性關系良好，相關系數大于 0. 9999，得到各標準品的線性回歸方程和檢出限 ( S /N = 3) 如表 1 所示。表 14 種雌激素的回歸方程和相關系數雌激素回歸方程rLOD( mg /kg

12、)雌三醇Y = 8019X+ 10641. 00000. 020雌酮Y = 4651X+ 2790. 99990. 030炔雌醇Y = 7524X 5910. 99990. 025己烯雌酚Y = 21330X 13351. 00000. 0302. 4 精密度試驗用濃度為 20 g /mL 的混合標準溶液重復進樣 6 次，分別測定四種雌激素的峰面積，并計算出相對標準偏差為 2. 3 3. 8% 。2. 5 加樣回收率試驗準確稱取不同種類的不含雌激素的化妝品樣品 1. 000g，平行 6 份，分別添加適量混合標準溶液，充分混勻后按照2. 2 項下制備供試品溶液，按色譜條件進行測定，見圖 2( B

13、) 。雌三醇、雌酮、炔雌醇和己烯雌酚的平均回收率分別為 101. 8 110. 3% 、97. 3 105. 7% 、99. 1 106. 2% 和98. 1 110. 6，RSD 分別為 3. 9% 、3. 2% 、2. 9 和 4. 0% 。2. 6 樣品分析按本方法對祛痘、護膚、美白、清潔等類別的 9 種化妝品進行了分析測定。用保留時間和檢出峰的光譜圖進行定性分析，9 種化妝品均未檢出雌激素。從樣品分離色譜圖 2 可見樣品經前處理后，化妝品基質對雌激素的檢出無干擾。1. 雌三醇; 2. 雌 ; 3. 炔雌醇; 4. 己 雌酚圖 2化妝品樣品( A) 和加標樣品( B) 的色譜圖3 討論3

14、. 1 樣品預處理實驗曾嘗試采用中國化妝品衛(wèi)生品規(guī)范中的方法對各化1妝品樣品中的雌激素進行提取 。實驗發(fā)現提取過程中容易出現乳化現象，影響離心分離。且操作步驟較為復雜，結果的重現性較差。本實驗選取甲醇作為溶劑處理化妝品樣品，在處理過程中樣品未出現類似的乳化現象，可順利進行離心分離處理。此方法簡單易行，又避免操作過程中待測目標物的損失，提取回收率較高。本方法能實現水劑、凝膠、膏劑和乳膏劑 4 種類型化妝品的預處理。9293第 12 期余 曉，袁凱松，翟海云，等: 高效液相色譜法測定化妝品中四種雌激素第 34 卷3. 2 色譜條件的選擇4 Waring RH，Harris RM. Endocrin

15、e disrupters: A human比較了不同流動相對各雌激素成分分離的影響。實驗risk? J. Mol Cell Endocrinol，2005，244( 112) : 2 9發(fā)現用甲醇 水流動相體系比乙腈 水流動相體系更有助5 Massart F，Parrino R，Seppia P，et al. How do environmental于雌三醇在色譜柱上的保留。比較了不同比例甲醇 水流estrogen disruptors induce precocious puberty? J. Miner-動相對分析的影響，結果表明甲醇 水比例為 60 40 的條va Pediatr，200

16、6，58( 3) : 247 554件下，各組分即可達到很好的分離。流速大小直接影響柱6 王敏榮，單琴 . 薄層層析法測定化妝品中部分雌性激素及系統(tǒng)的壓力、各組分分離度及洗脫時間。在流動相為甲J. 中國公共衛(wèi)生，1997，13( 12) : 749 750醇: 水 ( 體積比為 60 40 ) 條件下，考察了不同流速:7 劉軍 . 分光光度法測定化妝品中甾體激素含量J. 中0. 6、0. 8、1. 0、1. 2、1. 4 mL /min 對分離的影響，發(fā)現隨國衛(wèi)生檢驗雜志，2000，10( 5) : 571 572著流速變慢，各組分的分離度加大，但保留時間延長。實8 吳維群，沈朝燁，楊玉林，等

17、 . GC MS 聯用技術檢測水驗選擇流速為 1. 0mL /min，該條件下峰形較好及分離度較性化妝品中性激素成分的方法研究J. 環(huán)境與職業(yè)醫(yī)大，且出峰時間適宜。學，2004，21( 4) : 307 309參考文獻:9 鹿毅，楊濤，張煌濤，等 . 高效液相色譜法同時測定化妝1 化妝品衛(wèi)生規(guī)范S. 北京: 中華人民共和國衛(wèi)生部，品中 9 種激素J. 光譜實驗室，2010，27( 1) : 224 2292007，22010張亞增，徐衛(wèi)紅 . 高效液相色譜法測定化妝品中的雌二2 鄭星泉 . 化妝品衛(wèi)生檢驗M. 天津: 天津大學出版醇和雌酮J. 實用醫(yī)技雜志，2004，11( 7) : 1159

18、社，1994，21911杭棟，汪小婭，倪鑫炯，等 . 鼠李糖脂應用于微乳毛細管3 趙辨 . 臨床皮膚病學M. 南京: 江蘇科學技術出版電動色譜快速測定化妝品中激素類物質J. 分析化社，2001，935 936學，2011，39( 2) : 168 172( 上接第 84 頁)或抗體與漢坦病毒抗體 IgM 存在交叉反應，甚至一3 討論些年齡較大的患者或患有結核、傷寒、梅毒的患者腎綜合征出血熱 ( HFRS) 又稱為流行性出血檢測漢坦病毒抗體 IgM 時也存在交叉反應，而用熱，是一類以發(fā)熱、出血和腎功能損傷為特征的急PCR 檢測 HTV RNA 則未發(fā)現上述問題。性傳染病，病死率為 0. 1% 1

19、0. 0% ，廣泛流行于本次檢測的靈敏度 92. 65% 、特異性 100% 、2。依據臨床特陽性預測值 100% 、陰性預測值 95. 82% 、診斷有亞歐等許多國家，我國為重疫區(qū)征性癥狀和體征，結合實驗室檢查，參考流行病學效率 97. 26% ，均表明 HTV RNA PCR 檢測方法史進行診斷，臨床主要表現為發(fā)熱、休克、充血出是一項能夠滿足臨床用于腎綜合征出血熱診斷的血和急性腎衰竭，感染 HTV 2 4 天后可在血清中實驗室檢測方法，HTV RNA 可以作為腎綜合征3。目前實驗室特異性出血熱診斷的特異性診斷指標，HTV RNA PCR檢出 IgM，7 10 天達高峰診斷主要是 ELISA 法或免疫熒光法檢測漢坦病毒檢測對于臨床診斷腎綜合征出血熱具有重要的臨床意義?？贵w IgM，缺乏其他特異性的實驗室診斷方法，PCR 檢測 HTV RNA 是直接檢測病毒 RNA，應而參考文獻:1 王大虎，董智強，王玉林，等 . 廣州流行性出血熱流行具有靈敏高，特異性強，只要檢測到就可證明有感趨勢分析J. 醫(yī)學動物防制