探討廈門(mén)類(lèi)孟買(mǎi)血型表型產(chǎn)生的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)

1、探討廈門(mén)類(lèi)孟買(mǎi)血型表型產(chǎn)生的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)類(lèi)孟買(mǎi)血型是一種較為罕見(jiàn)的紅細(xì)胞血型，血型血清學(xué)主要表現(xiàn)為： 紅細(xì)胞 H 抗原部分缺失，血清中存在抗 H 抗體，常導(dǎo)致 ABO 血型鑒定的錯(cuò)誤。該血型表型患者如接受含 H 抗原的血液可引起嚴(yán)重的溶血性輸血反應(yīng)，嚴(yán)重影響安全輸血。因此，類(lèi)孟買(mǎi)血型的鑒定在臨床輸血中具有重要的臨床意義。與 H 抗原形成有關(guān)的編碼基因 FUT1 位于19q13. 3。FUT1 基因突變導(dǎo)致了 H 抗原合成障礙，產(chǎn)生類(lèi)孟買(mǎi)血型表型。國(guó)內(nèi)外基礎(chǔ)研究對(duì) H 抗原缺失的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)已有較為深入的研究，結(jié)果顯示： H 抗原缺失頻率及 FUT1 基因突變分子基礎(chǔ)在不同人群的有所差異1

2、4。因此，我們對(duì)本地區(qū)3 例血型鑒定確定為類(lèi)孟買(mǎi)血型的個(gè)體進(jìn)行了FUT1 基因的克隆和測(cè)序，探討本地區(qū)類(lèi)孟買(mǎi)血型表型產(chǎn)生的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。一、材料和方法1.研究對(duì)象收集我院 3 例經(jīng)血型血清學(xué)鑒定為類(lèi)孟買(mǎi)血型表型的患者標(biāo)本，其中男性 2 例，女性 1 例； 年齡分別為：18 歲（ 個(gè)體 1） 、37 歲（ 個(gè)體 2） 、65 歲（ 個(gè)體 3） 。以正常 O 表型患者標(biāo)本為正常對(duì)照血清學(xué)檢測(cè)試劑和方法正定型用單克隆抗 A、抗 B 、抗 H 試劑及反定型用試劑 A、B、O 細(xì)胞，均購(gòu)自上海市血液生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品。用常規(guī)方法進(jìn)行 ABO 及 H 血型鑒定，同時(shí)進(jìn)行凝集抑制試驗(yàn)以檢測(cè)唾液中血型物質(zhì)

3、。2. 樣本 DNA 提取以全血 DNA 小量提取試劑盒 （ 美國(guó) Omega 公司產(chǎn)品） 抽提 3 例類(lèi)孟買(mǎi)血型患者及正常表型患者基因組 DNA，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。3.FUT1 DNA 擴(kuò)增PC 引物參考文獻(xiàn)5由上海生工生物工程公司合成。引物序列： F: 5 -CATTTGCTAATTCGCCTTTC-CTC-3‘，： 5 -CCTTCTCTCCAACTCTCCCAAC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度： 1286 bp。擴(kuò)增反應(yīng)體系體積 50 μl，其中： 2 × 緩沖液 25 μl，樣本 DNA 2 μl，LA Taq 0. 5 μ

4、l（ 日本 TaKaa 公司產(chǎn)品） ，dNTP mix 1 μl，引物 F、各 1 μl，滅菌雙蒸水 19. 5 μl。PC 參數(shù)： 94預(yù)變性5 min; 然后94變性30 s，60退火30 s，72延伸 2 min，30 個(gè)循環(huán)，72延伸 5 min 后冷卻至 4。 PC 擴(kuò)增產(chǎn)物在 2% 低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上 100 V 電泳 30 min，凝膠成像儀成像，提示擴(kuò)增成功后，從凝膠上切取目的 DNA 片段，用 AXYGEN 凝膠純化試劑盒（ AXYGEN 公司產(chǎn)品） 純化回收 DNA 片段。4. FUT1 基因測(cè)序純化的 PC 產(chǎn)物在 T4 DNA 連接酶作用下與 T 載體

5、連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取 4 個(gè)陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒 DNA 為范本測(cè)序鑒定 FUT1基因突變。二、結(jié) 果1.紅細(xì)胞 ABO、H 血型鑒定3 個(gè)研究個(gè)體在 ABO 常規(guī)血型鑒定中正定型均為：O 型，反定型也均為 O 型，但是 O 細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的凝集，同時(shí)自身對(duì)照均為陰性。進(jìn)一步的血清學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn) 3 個(gè)研究個(gè)體血清中均有抗 H 抗體，而紅細(xì)胞上 H 抗原缺失（ 表 1） 。2.唾液中 ABH 血型物質(zhì)測(cè)定凝集抑制試驗(yàn)證實(shí) 3 個(gè)研究個(gè)體均為分泌型，其中個(gè)體 1，2 唾液中均含有 A、H 物質(zhì)，而個(gè)體 3 唾液中含有 B、H 物質(zhì)（ 表 1） 。3.PC 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分

6、析高保真 DNA 聚合酶擴(kuò)增目的。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳成像，可見(jiàn)單一的特異性條帶，提示成功擴(kuò)增 FUT1 基因編碼區(qū)全長(zhǎng)。4.FUT1 基因測(cè)序分析高保真 PC 擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng) TA 克隆、測(cè)序及序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，個(gè)體 1 的 1 條染色體上 FUT1 基因?yàn)?h1（ 547-552delAG） ，另 1 條染色體上為 h4（ 35C T） ，即 FUT1 基因型為 h1h4; 個(gè)體 2，3 的 2 條染色體上FUT1 基因均為 h1（ 547-552delAG） ，即 FUT1 基因型為 h1h1。討 論類(lèi)孟買(mǎi)血型是一種罕見(jiàn)的紅細(xì)胞血型表型，其主要特征是紅細(xì)胞表面 H 抗原部分或完全缺失，

7、而分泌液中存在 H 物質(zhì)。H 抗原是 Hh 血型系統(tǒng)的唯一抗原，是 A、B 血型抗原形成的基礎(chǔ)。在正常情況下，F(xiàn)UT1 基因編碼的 α1，2 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶催化 L-巖藻糖連接到前體糖鏈上從而形成 H 抗原。因此，F(xiàn)UT1 基因的異常是形成類(lèi)孟買(mǎi)血型的重要分子基礎(chǔ)。FUT1 基因位于 19q13. 3，全長(zhǎng) 5380 bp，其中編碼序列長(zhǎng)為 1095 bp，編碼 365 個(gè)氨基酸。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 FUT1 基因異常包括缺失、錯(cuò)義突變和插入突變等，包含了 30 種不同的突變。眾多國(guó)內(nèi)外研究已表明： H 抗原缺失頻率及 FUT1 基因突變分子基礎(chǔ)在不同人群的有所差異。目前，本地區(qū)已經(jīng)報(bào)

8、道的 FUT1 基 因 突 變 分 子 基 礎(chǔ) 僅 有 h1 （ 547-552delAG） 、h2 （ 880-882delTT） 、h3 （ 658 C T） 、h9（ 424 C T）1 6。為了進(jìn)一步揭示對(duì)本地區(qū)類(lèi)孟買(mǎi)血型個(gè)體的 FUT1 基因突變類(lèi)型，我們對(duì) 3 例血型鑒定確定為類(lèi)孟買(mǎi)血型的個(gè)體進(jìn)行了 FUT1 基因的克隆和測(cè)序及比對(duì)分析。我們首先通過(guò)常規(guī)血型鑒定、抗體篩選等血清學(xué)及唾液血型物質(zhì)檢測(cè)等方法，確定了 3 例類(lèi)孟買(mǎi)血型個(gè)體。隨后，我們提取了 3 個(gè)個(gè)體的基因組DNA。通過(guò)高保真 PC 擴(kuò)增了 FUT1 DNA，經(jīng)過(guò) TA克隆及測(cè)序證實(shí)了 3 例類(lèi)孟買(mǎi)血型個(gè)體中，個(gè)體 1的

9、 1 條染色體上 FUT1 基因?yàn)?h1（ 547-552delAG） ，另 1 條染色體上為 h4（ 35C T） ，即 FUT1 基因型為h1h4; 個(gè)體 2，3 的 2 條染色體上 FUT1 基因均為 h1（ 547-552delAG） ，即 FUT1 基因型為 h1h1。本研究的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了池泉等6報(bào)道的本地區(qū)類(lèi)孟買(mǎi)血型個(gè)體的主要流行基因（ h1 和 h2） 的結(jié)論。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn) h4 基因型同樣存在于本地區(qū)類(lèi)孟買(mǎi)血型個(gè)體中。關(guān)于 h4 基因型在類(lèi)孟買(mǎi)血型形成中的作用，目前研究還存在爭(zhēng)議。許先國(guó)等7研究結(jié)果認(rèn)為，h4基因型（ 35C T） 是一種基因多態(tài)性，而不是引起類(lèi)孟買(mǎi)型的

10、基因突變，但是不能完全解釋郭忠慧等8研究發(fā)現(xiàn)的 2 例 h4h4 純合子的類(lèi)孟買(mǎi)血型個(gè)體。我們研究的個(gè)體 3 FUT1 基因?yàn)?h1/h4，由于 FUT1基因的遺傳方式是常染色體隱性遺傳，因此我們認(rèn)為，h4 基因型的存在導(dǎo)致類(lèi)孟買(mǎi)個(gè)體3 另1 條染色體上 FUT1 無(wú)效表達(dá)，最終導(dǎo)致了個(gè)體 3 類(lèi)孟買(mǎi)血型表型的形成?？傊?，類(lèi)孟買(mǎi)血型的分子基礎(chǔ)在不同人群存在著差異，并且尚有存在爭(zhēng)議的問(wèn)題。因此，擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步挖掘類(lèi)孟買(mǎi)血型個(gè)體的 FUT1 基因突變情況，將有利于我們理解類(lèi)孟買(mǎi)血型表型形成的機(jī)制。參 考 文 獻(xiàn)：1 Daniels G. Human blood groups. Oxford:

11、Blackwell Science Ltd，2002: 185 187.2 李勇，馬學(xué)嚴(yán)。 實(shí)用血液免疫學(xué)。 北京： 科學(xué)出版社。 2006: 146 155.3 Cai XH，Jin S，Liu X，et al. Molecular genetic analysis for the para-Bombay blood group revealing two novel alleles in the FUT1 gene. Blood Transfus，2011; 9（ 4） : 466 468.4 Storry J，Johannesson JS，Poole J，et al. Identification of six newalleles at the FUT1 and FUT2 loci in ethnically diverse individualswith Bombay and Para-Bombay phenotypes. Transfusion，2006; 46（ 12） : 2149 2155.5 黃豪博，范麗萍，魏世金，等。 中國(guó)福建地區(qū)類(lèi)孟買(mǎi)血型個(gè)體FUT1 基因突變研究。 中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2010; 18 （ 5） : 1338 1340.6 池泉，張愛(ài)，任本春，等。 類(lèi)孟買(mǎi)血型基因分析及 1 種 FUT1 新無(wú)效等位基因的發(fā)現(xiàn)。 中國(guó)輸