激光掃描共聚焦顯微鏡的原理和應(yīng)用

1、激光掃描共聚焦顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡的原理和的原理和操作操作 植物學(xué)植物學(xué)彭曦彭曦 201402123120140212311. 激光掃描共聚焦顯微鏡工作原理和系統(tǒng)組成激光掃描共聚焦顯微鏡工作原理和系統(tǒng)組成1.1 工作原理工作原理： 激光掃描共聚焦顯微鏡 （Confocal laser scanning micro-scope, CLSM）是在熒光成像基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像集中處理。由于該儀器使用紫外光或者可見(jiàn)光激發(fā)熒光探針，從而可以清晰觀察細(xì)胞或者組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)，并可反映出亞細(xì)胞水平上生理信號(hào)的變化。1.2 系統(tǒng)系統(tǒng)組成：組成： 激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)主要由：電動(dòng)

2、熒光顯微鏡、掃描檢測(cè)單元、激光器、電腦工作站及各相關(guān)附件組成。系統(tǒng)組成及光路示意圖系統(tǒng)組成及光路示意圖：電動(dòng)熒光顯微鏡掃描檢測(cè)單元激光器實(shí)物照片說(shuō)明實(shí)物照片說(shuō)明2. 系統(tǒng)的使用系統(tǒng)的使用2.1 開(kāi)機(jī)開(kāi)機(jī)（1）打開(kāi)穩(wěn)壓電源（綠色按鈕），等待2分鐘電壓穩(wěn)定后再開(kāi)其他開(kāi)關(guān)（2）主開(kāi)關(guān) MAIN WITCH “ON”電腦系統(tǒng) SYSTEMS/PC “ON”掃描硬件系統(tǒng) COMPONENTS “ON”（3）打開(kāi) 電動(dòng)顯微鏡開(kāi)關(guān) 打開(kāi) 熒光燈開(kāi)關(guān) （注：具有5 檔光強(qiáng)調(diào)節(jié)旋鈕）（4）Ar 離子激光器主開(kāi)關(guān) “ON”順時(shí)針旋轉(zhuǎn)鑰匙 至 “”預(yù)熱等待約15分鐘，將激光器 扳鈕 由“Standby”扳至“Las

3、er run”狀態(tài)，即可正常使用（5）打開(kāi) 電腦開(kāi)關(guān) ，進(jìn)入操作系統(tǒng)注：鍵盤上也具有 電腦開(kāi)關(guān) 2.2 軟件的快速使用說(shuō)明軟件的快速使用說(shuō)明（1）電腦開(kāi)機(jī)進(jìn)入操作系統(tǒng)界面后，雙擊桌面共聚焦軟件ZEN 圖標(biāo) 。（2）進(jìn)入ZEN 界面，彈出對(duì)話框：“Start System”初始化整個(gè)系統(tǒng)，用于激光掃描取圖、分析等?！癐mage Processing”不啟動(dòng)共聚焦掃描硬件，用于已存圖像數(shù)據(jù)的處理、分析。1 功能界面切換：掃描取圖（Acquisition）、圖像處理（Processing）、維護(hù)（Maintain）（注：Maintain僅供Zeiss專業(yè)工程師使用）2 動(dòng)作按鈕；3 工具組（多維掃描

4、控制）；4 工具詳細(xì)界面；5 狀態(tài)欄；6 視窗切換按鈕；7 圖像切換按鈕；8 圖像瀏覽/預(yù)掃描窗口；9 文檔瀏覽/處理區(qū)域；10 視窗中圖像處理模塊（3）軟件界面：激光連接狀況檢查激光連接狀況檢查眼睛觀察眼睛觀察/相機(jī)相機(jī)/共聚焦共聚焦LSM 光路切換光路切換Ocular 通過(guò)觀察筒用眼睛觀察。（激光安全保護(hù)裝置自動(dòng)阻斷激光、保護(hù)眼睛。）Camera 光路切換至相機(jī)。LSM 共聚焦掃描成像光路?！癘cular”“Light Path”點(diǎn)擊物鏡圖標(biāo)，選擇物鏡樣品聚焦。（ZEN軟件界面右上角）：顯微鏡設(shè)置：顯微鏡設(shè)置：透射光控制（Transmitted Light Control）反射光光閘控制（

5、Reflected Light Shutter）熒光激發(fā)塊選擇（Reflector）共聚焦共聚焦LSM 掃描設(shè)置掃描設(shè)置點(diǎn)擊“LSM”（ZEN軟件界面右上角），系統(tǒng)切換至共聚焦掃描光路：光路設(shè)置：選取“熒光探針”、“顏色”、掃描方法，應(yīng)用“Apply”。（注：Fastest 為最快速掃描，多條激光譜線同時(shí)掃描。Best signal 為最佳信號(hào)掃描，多條激光譜線順序掃描。Best compromise 為兼顧速度與信號(hào)的折中式掃描。）掃描圖像參數(shù)設(shè)置：掃描圖像參數(shù)設(shè)置：每個(gè)通道的精細(xì)調(diào)節(jié)：每個(gè)通道的精細(xì)調(diào)節(jié)：包括：（1）Pinhole的調(diào)節(jié)（一般設(shè)為1AU。該值越大，則信號(hào)越強(qiáng)，但共聚焦圖像效

6、果會(huì)降低。原則上，在保證圖像質(zhì)量的前提下，該值越接近于1AU 越好）；（2）Master Gain的調(diào)節(jié)（增大則信號(hào)和噪音都增強(qiáng)，減小則信號(hào)和噪音均減小。原則上，在保證圖像質(zhì)量的前提下，Gain值越小越好）；（3）Digital Offset的調(diào)節(jié)（可扣除背景噪音，但標(biāo)本信號(hào)也有一定程度的扣除。原則上，在保證圖像質(zhì)量的前提下，Digital Offset值越接近于0越好）；（4）Digital Gain的調(diào)節(jié)（增大則信號(hào)和噪音都增強(qiáng)，減小則信號(hào)和噪音均減小。原則上，在保證圖像質(zhì)量的前提下，Gain值越接近于1.01.2越好）；（5）另外，對(duì)于每個(gè)通道，需要靈活調(diào)節(jié)激光的強(qiáng)度（激光強(qiáng)度越高，則信

7、號(hào)越強(qiáng)，但噪音也相應(yīng)增強(qiáng)，同時(shí)標(biāo)本更容易被漂白或淬滅。原則上，在保證圖像質(zhì)量的前提下，激光強(qiáng)度越低越好。）三種方法：（1）“File”菜單下，“Save”或者“Save AS”。（2）點(diǎn)擊右下角按鈕 。（3）點(diǎn)擊工具欄按鈕 。（如圖所示）2.3 圖像圖像的保存的保存：另外，通過(guò)“File”菜單下的“Export”，也可將圖像以其它格式輸出。（1）關(guān)閉軟件：主菜單“File”“Exit”，退出共聚焦軟件ZEN。（2）關(guān)閉主電腦操作系統(tǒng)、顯示器電源。（3）關(guān)閉 熒光燈電源 。（4）關(guān)閉 電動(dòng)顯微鏡電源。（5）關(guān)閉Ar 激光器：先將 扳鈕 從 “Laser run” 扳到 “Standby” 狀態(tài)；

8、再將 鑰匙 逆時(shí)針從“”旋轉(zhuǎn)到“O”狀態(tài)；等待約8-10分鐘、激光器風(fēng)扇停止轉(zhuǎn)動(dòng)后（切記?。?，將 主開(kāi)關(guān) 按鈕按到“OFF”。（6）掃描硬件系統(tǒng) COMPONENTS “OFF” 電腦系統(tǒng) SYSTEMS/PC “OFF” 主開(kāi)關(guān) MAIN SWITCH “OFF”（7）等 燈箱 充分冷卻后，再放防塵罩。（8）如果系統(tǒng)長(zhǎng)時(shí)間（超過(guò)5個(gè)小時(shí)）不使用，則關(guān)閉穩(wěn)壓電源。關(guān)機(jī)順序：關(guān)機(jī)順序：（1）打開(kāi)穩(wěn)壓電源時(shí)，應(yīng)等待2 分鐘（電壓穩(wěn)定）后，再開(kāi)其它開(kāi)關(guān)。（2）嚴(yán)格遵守激光器的開(kāi)、關(guān)流程（詳見(jiàn)“2.1、2.4 開(kāi)/關(guān)機(jī)順序”）。（3）如果使用過(guò)油鏡，或者物鏡表面較臟，則需用擦鏡紙擦干凈物鏡的前表面（清

9、潔液使用無(wú)水乙醇和無(wú)水乙醚的混合液，混合比例：無(wú)水乙醇30%、無(wú)水乙醚70%）。（4）不使用熒光時(shí)，不打開(kāi)熒光燈。避免頻繁開(kāi)/關(guān)熒光燈。（5）必須等燈箱充分冷卻后，再小心地蓋上防塵罩。（6）顯微鏡可由TFT觸摸屏控制，使用觸摸屏?xí)r注意：手指保持清潔、干燥狀態(tài)，并且為了保證他人使用安全，觸摸時(shí)嚴(yán)禁配戴有可能接觸污染物或危險(xiǎn)樣品的手套；觸摸屏已足夠靈敏，不要大力按壓觸摸屏；不要旋轉(zhuǎn)、插拔觸摸屏。（7）刻錄圖像數(shù)據(jù)資料：應(yīng)使用刻錄光驅(qū)刻錄，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)準(zhǔn)備好刻錄光盤。切記：為了防止計(jì)算機(jī)病毒，嚴(yán)禁在共聚焦電腦上使用U盤、硬動(dòng)硬盤或者上網(wǎng)?。?）未經(jīng)授權(quán)，嚴(yán)禁自行安裝任何軟件?。?）實(shí)驗(yàn)室溫度應(yīng)保持在222，濕度40%-60%。（10）避免空調(diào)直接對(duì)著顯微鏡吹風(fēng)。（11）整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)注意保持顯微鏡周圍環(huán)境清潔。主要注意事項(xiàng)如下：主要注意事項(xiàng)如下：參考資料參考資料:1 德國(guó)Zeiss 激光掃描共聚焦顯微鏡快速操作手冊(cè)2 Pa