電化學發(fā)光免疫分析法ppt課件

1、電化學發(fā)光免疫分析法electro-chemiluminescence immunoassay (ecli ) w免疫分析法w發(fā)光和化學發(fā)光w化學發(fā)光免疫分析法w電化學發(fā)光w電化學發(fā)光免疫分析法免疫分析w 基于抗原和抗體的特異性反應進行檢測的一種手段；w 免疫標記技術是將一些既易測定又具有高度敏感性的物質(zhì)標記到特異性抗原或抗體分子上，通過這些標記物的增強放大效應來顯示反應系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。免疫學檢測歷史演進w 放射免疫檢測（興起于20世紀70年代，現(xiàn)仍普遍使用于縣級以上醫(yī)院）；w 酶聯(lián)免疫檢測（興起于20世紀80年代，各臨床機構普遍使用）；w 以化學發(fā)光為代表的光生物學標記及免疫檢

2、測技術（20世紀90年代開始推廣使用，產(chǎn)品步入成長期）三個階段。w免疫分析法w發(fā)光和化學發(fā)光w化學發(fā)光免疫分析法w電化學發(fā)光w電化學發(fā)光免疫分析法發(fā)光現(xiàn)象螢火蟲發(fā)光深海魚發(fā)光發(fā)光分類w 光照發(fā)光:發(fā)光劑經(jīng)短波長入射光照射后進入激發(fā)態(tài)，當回復至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。w生物發(fā)光：反應底物在熒光素酶的催化下利用atp產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回復到基態(tài)時多余的能量以光子形式放出。w化學發(fā)光化學發(fā)光化學發(fā)光chemiluminescence (cl) w 化學發(fā)光是指在某些特殊的化學反應中，反應的中間體或產(chǎn)物由于吸收了反應釋放的化學能而處于電子激發(fā)態(tài)，當其回到基態(tài)時伴隨產(chǎn)生的光輻射現(xiàn)象

3、。 化學發(fā)光反應包括兩個關鍵步驟，即化學激發(fā)和發(fā)光?；瘜W發(fā)光反應能級圖化學發(fā)光分析w 根據(jù)化學發(fā)光反應在某一時刻的發(fā)光強度或反應的發(fā)光總量來確定反應中相應組分含量的分析方法，稱為化學發(fā)光分析?；瘜W發(fā)光分析優(yōu)點w 化學發(fā)光具有熒光的特異性，同時不需要激發(fā)光，就避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響有很高的靈敏度，w 并且不象放射分析那樣存在強烈的環(huán)境污染和健康危害，是一種非常優(yōu)秀的定量分析方法?；瘜W發(fā)光分析缺點w 雖然化學發(fā)光具備很高的特異性和很小的干擾，但化學分析本身的不特異性，制約了整個方法的使用。w免疫分析法w發(fā)光和化學發(fā)光w化學發(fā)光免疫分析法w電化學發(fā)光w電化學發(fā)光免疫分析法化學發(fā)光免疫分析

4、chemiluminescence immunoassay（ clia）w clia是將化學發(fā)光分析和免疫反應相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術。w 這種方法兼有發(fā)光分析的高靈敏度和抗原抗體反應的高度特異性。 化學發(fā)光免疫分析（ clia）分類w 按分離方法不同分n微粒子化學發(fā)光免疫測定n磁顆?；瘜W發(fā)光免疫測定化學發(fā)光免疫分析（ clia）分類w 按發(fā)光劑不同分為n發(fā)光酶免疫測定（chemiluminescence enzyme immunoasssay， cleia ）n化學發(fā)光免疫測定技術 （chemiluminescence immunoassay， clia ）n電化學發(fā)光免疫測定技術

5、（electrochemiluminescence immunoassay， ecli ）w免疫分析法w發(fā)光和化學發(fā)光w化學發(fā)光免疫分析法w電化學發(fā)光w電化學發(fā)光免疫分析法電致化學發(fā)光（ecl)w 電致化學發(fā)光 (ecl) 是通過在電極上施加一定波形的電壓或電流信號進行電解反應的產(chǎn)物之間或與體系中共存組分反應產(chǎn)生化學發(fā)光的現(xiàn)象。電致化學發(fā)光（ecl)w ecl與cl的差異在于ecl是電啟動發(fā)光反應，而cl是通過化合物混合啟動發(fā)光反應。因此ecl反應易精確控制，具有靈活性。電化學發(fā)光劑w 定義：指通過在電極表面進行電化學反應而發(fā)出光的物質(zhì)。w 特點n反應在電極進行n化學發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕n電子供

6、體為：三丙胺（tpa）三聯(lián)毗啶釕分子結(jié)構圖nnnnnnruoonoo三聯(lián)吡啶釕（ ru(bpy)32+ ）特點w ecl分析中采用ru(bpy)32+作為標記物，其活化衍生物是ru(bpy)32+n羥基琥珀酸胺酯（nhs） ，該衍生物具有水溶性，且高度穩(wěn)定，保證電化學發(fā)光反應的高效和穩(wěn)定，而且避免了本底噪聲的干擾。三聯(lián)吡啶釕（ ru(bpy)32+ ）特點w ru(bpy)32+衍生物與免疫球蛋白結(jié)合的分子比超過20仍不會影響抗體的可溶性和免疫活性；w ru(bpy)32+分子量小，空間位阻小 ，即便小分子的核酸也能標記，使檢測的菜單大大豐富，更重要的是為其檢測菜單的開發(fā)前景提供了廣闊空間。電

7、化學發(fā)光原理圖tpa+tparu(bpy)3+ru(bpy)ru(bpy)2+光 子(620nm)333*基態(tài)激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定w免疫分析法w發(fā)光和化學發(fā)光w化學發(fā)光免疫分析法w電化學發(fā)光w電化學發(fā)光免疫分析法電化學發(fā)光免疫分析(electro-chemiluminescence immunoassay, ecli)w ecli是繼eia、ria、fia、時間分辨熒光免疫技術（trfia）之后的新一代標記免疫測定技術； w ecli是電化學發(fā)光(ecl)和免疫測定相結(jié)合的產(chǎn)物；w ecli是目前最先進的標記免疫測定技術之一。 ecli原理w 在電極表面由電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光反應，用電化學發(fā)光劑

8、三聯(lián)吡啶釕ru(bpy)32+標記ab，通過ag-ab反應和磁珠分離技術，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強度對待測的ag或ab進行定量/定性。eclia檢測流程圖一（雙抗體夾心的形成）eclia檢測流程圖二 （生物素與親和素結(jié)合）eclia體系結(jié)構圖eclia檢測流程圖三 （磁珠吸引吸附于電極表面）eclia檢測流程圖四 （電極充電啟動電化學反應）eclia檢測流程圖五 （撤消磁場沖洗磁珠）方法評價w 采用的固相載體是帶有磁性的直徑約2.8 m的聚苯乙烯微粒。其特點是反應面積比板式擴大2030倍，吸附效率高；在液體中形成均勻的懸液，參與反應時類似液相，反應速度大大加快；方法評價w “鏈霉親和素-生物素”是是具有很強的非共價相互作用的一對化合物，具有牢固而特異的結(jié)合，應用此放大系統(tǒng)，使檢測的靈敏度大大提高；方法評價w 利用氧化鐵的磁性，使用電磁場分離結(jié)合態(tài)和游離態(tài)，方便迅速，實現(xiàn)了精確的全自動化；w 標記物的再循環(huán)利用，使發(fā)光時間更長、強度更高、易于測定。elia優(yōu)越性w 高度敏感，可達pgml或pmol水平；w 特異性強，重復性好，cv5。w 測定范圍寬，可達7個數(shù)量級。w 試劑穩(wěn)定，無毒害，無污染，