(工藝技術(shù))年產(chǎn)噸中性淀粉酶發(fā)酵工藝設(shè)計(jì)

1、年產(chǎn)3噸中性淀粉酶發(fā)酵工藝設(shè)計(jì)刖言淀粉酶屬于水解酶類，是水解淀粉和糖原的酶類總稱。通常通過淀粉酶 催化水解織物上的淀粉漿料，由于淀粉酶的高效性及專一性，酶退漿的退 漿率高，退漿快，污染少，產(chǎn)品比酸法、堿法更柔軟，且不損傷纖維。此類 酶廣泛存在于動(dòng)、植物和微生物中，幾乎所有動(dòng)物、植物和微生物都含有淀粉酶。淀粉酶是研究較多、生產(chǎn)最早、產(chǎn)量最大和應(yīng)用最廣泛的一類酶。特別是20世紀(jì)60年代以來由于淀粉酶在淀粉糖工業(yè)生產(chǎn)和食品工業(yè)中的大規(guī)模應(yīng)用， 它的需要量與日俱增，到目前為止，其產(chǎn)量幾乎占到整個(gè)酶制劑的50%以上，銷售金額占到55%60%。按照水解淀粉的方式不向，主要的淀粉酶有a定粉 酶、B淀粉酶、葡

2、萄糖淀粉酶、脫支酶、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶等。淀粉酶已經(jīng)成為工業(yè)應(yīng)用中最為重要的酶之一， 并且大量的微生物可以用以 高效生產(chǎn)淀粉酶，但是酶的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)仍然局限于幾種特定的真菌和細(xì)菌 中。對(duì)于高效的淀粉酶的需求越來越多，這可以通過對(duì)現(xiàn)有酶的化學(xué)改良或者通 白質(zhì)工藝改良得到。得益于現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，淀粉酶在制藥方面的重要性日 益凸顯。當(dāng)然，食品和淀粉工業(yè)仍然是主要市場， 淀粉酶在這些領(lǐng)域的需求仍然 是最大的。中性淀粉酶是目前使用最廣泛的一種酶，主要運(yùn)用于發(fā)酵、食品、醫(yī)藥、紡 織及造紙工業(yè)。就我國而言一般采用液態(tài)深層發(fā)酵法生產(chǎn)， 但發(fā)酵水平低，過濾 困難，使其發(fā)展受到了較大的限制。本課題中以枯

3、草桿菌為實(shí)驗(yàn)菌株，采用液體搖瓶發(fā)酵，并在培養(yǎng)基中添加發(fā) 酵助劑如Na+和Tween 80等來提高酶活。枯草芽抱桿菌可利用蛋白質(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是 a淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產(chǎn)菌?？莶菅勘U菌菌體自身 合成a淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，可在消化道中與動(dòng)物 體內(nèi)的消化酶類一同發(fā)揮作用?？莶菅勘U菌廣泛分布在土壤及腐敗的有 機(jī)物中，易在枯草浸汁中繁殖。1. 菌種的選育1.1菌種的選育及制備不管是在過去、現(xiàn)在和將來，微生物是各種生物活性產(chǎn)物的豐富資源。在發(fā) 酵前期，微生物的選擇至關(guān)重要，此課題設(shè)計(jì)的是利用枯草芽抱桿菌發(fā)酵生產(chǎn)中 性淀粉酶的整體過程。選擇性分離的

4、步驟一般是：含微生物材料采集 一一標(biāo)本材料的預(yù)處理 一一菌種的分離一一富集培養(yǎng) 菌種初選一一菌種復(fù)選一一性能鑒定一一菌種保藏。1.1.1含微生物材料的選擇土壤是微生物聚集最豐富的場所，菜園和農(nóng)田耕作層土壤含有豐富的有機(jī)物常以細(xì)菌和放線菌居多，由于枯草芽抱桿菌生活在中性的環(huán)境中，可以采集中性的土壤。采土?xí)r先用小鏟除去表土，取515 cm深處的土樣，選好35點(diǎn)，每 點(diǎn)取土 10g混在一起裝入滅過菌的牛皮紙袋，并記錄時(shí)間、地點(diǎn)、植被等情況。1.1.2預(yù)處理在培養(yǎng)過程中以淀粉作為唯一或主要碳源，控制 pH在6.77.2。那些在所 采用的條件下最適用于淀粉代謝的微生物最終將占優(yōu)勢(shì)， 并可在淀粉瓊脂糖平板

5、 上分離到產(chǎn)生中性淀粉酶的菌株。1.1.3所需菌種的純化和分離可用平板劃線法進(jìn)行菌種分離。方法如下：用接種管蘸取少量經(jīng)增殖培養(yǎng)后的菌液，在含無菌固體培養(yǎng)基的平板表面上進(jìn)行規(guī)則劃線，操作時(shí)由右向左輕輕劃線，劃線時(shí)平板面與接種環(huán)成3040以手腕力量在平板表面輕巧滑動(dòng)劃線， 線條要平行密集，使兩線不能重疊，充分利用表面積，劃線時(shí)接種環(huán)不要嵌入板 內(nèi)劃破培養(yǎng)基，密集的含菌樣品，經(jīng)過多劃線稀釋，使菌體在平板培養(yǎng)基上逐漸 分離成單個(gè)菌株，經(jīng)培養(yǎng)繁殖成單個(gè)菌落，反復(fù)進(jìn)行幾次平板劃線分離，可得枯 草芽抱桿菌野生菌株。1.1.4菌株的培養(yǎng)常用培養(yǎng)基配方：1L蒸餾水+10g蛋白胨+3g牛肉膏+1520g瓊脂+5g

6、NaCI。 本課題以麩皮、豆餅粉作為天然培養(yǎng)基，在37C保溫箱中培養(yǎng)，至培養(yǎng)基中部分出現(xiàn)成熟顏色即可進(jìn)行保藏。1.1.5菌落的選擇初篩米用透明圈法，方法為在培養(yǎng)基里接入淀粉天青，接入含菌樣品后，可 在菌落周圍清晰地觀察到淡藍(lán)色暈環(huán)，初篩選出的微生物經(jīng)過菌株性狀試驗(yàn)后已 確定具有一定生產(chǎn)能力的菌株還要進(jìn)行復(fù)篩。方法：將初篩后的少數(shù)菌株接種于 40 ml錐形瓶內(nèi)的液體培養(yǎng)基中，110次 /min往復(fù)式搖床式震蕩培養(yǎng)，得到搖瓶種子。1.2誘變育種誘變育種可以利用物理、化學(xué)因素誘導(dǎo)遺傳特性發(fā)生變異，再從變異 群體中選擇符合人們某種要求如高產(chǎn)的個(gè)體，進(jìn)而培育成新的品種或種質(zhì)。誘變育種操作程序如下：出發(fā)菌

7、株純化培養(yǎng)液細(xì)胞或抱子懸液誘變劑處理中間培養(yǎng)平 板分離-初篩一復(fù)篩一生產(chǎn)性能實(shí)驗(yàn)菌種保藏。1.2.1出發(fā)菌株的選擇由于野生型菌株生產(chǎn)性能較差，通常采用經(jīng)歷過生產(chǎn)條件考驗(yàn)的菌株， 即經(jīng) 過液體培養(yǎng)的搖瓶種子，這類菌株一定的生產(chǎn)性狀，對(duì)生產(chǎn)環(huán)境有較好的適應(yīng)性， 正突變的可能性也很大。1.2.2菌懸液的制備細(xì)菌一般要求處于對(duì)數(shù)生長中期的菌，用玻璃珠振蕩5 min，使細(xì)胞均一分散，然后用滅菌脫脂棉過濾，得到分散菌株。菌懸液的細(xì)胞濃度不宜過高，本課 題中的枯草芽胞桿菌，宜將其濃度控制在108個(gè)/ml。菌懸液介質(zhì)一般用生理鹽水。1.2.3誘變劑的處理誘變劑包括物理、化學(xué)、生物誘變，在微生物誘變育種中，可用

8、物理化學(xué)復(fù) 合誘變因素處理菌種，這樣可以擴(kuò)大培養(yǎng)幅度，提高誘變效果獲得中性淀粉酶高 產(chǎn)突變株。方法及步驟如下：吸取制備好的枯草芽抱桿菌懸液 5 ml于直徑為6 cm的無菌培養(yǎng)皿中，然后用 0.5%1%的二乙酯處理30 min,處理時(shí)采用pH 7.0的磷酸緩沖液，再將磁力攪 拌器于紫外燈下（距離30 cm） 1 min，接著在紅燈下吸取經(jīng)處理的菌液 0.5 ml， 稀釋至10-6,取10-610-1稀釋液滴一滴于6個(gè)平板中，10-610-1依次涂布均勻， 再置暗箱內(nèi)與37C培養(yǎng)48 h0注意：一般化學(xué)誘變劑均有毒性，多數(shù)還具有致癌作用，故操作時(shí)切忌用口 吸取并勿與皮膚直接接觸，做好安全工作。12

9、4突變菌株的篩選包括：瓊脂塊透明圈法初篩。方法：倒入選擇培養(yǎng)基6皿，取其中較厚的2皿，用打孔器或玻璃打制圓形 培養(yǎng)基一平移瓊脂塊至一個(gè)選擇平板上，再用接種針挑取單菌落的少量菌體分別 接種于瓊脂塊中心并與一瓊脂塊接入出發(fā)菌株作為對(duì)照-正置于37C培養(yǎng)45小時(shí)一于培養(yǎng)好的選擇平板中滴加幾滴淀粉天青， 觀察到透明圈的直徑一選擇透明 圈大的菌落接入斜面?zhèn)鋸?fù)篩用。搖瓶發(fā)酵復(fù)篩：將經(jīng)初篩處的菌株分別接入增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 13小時(shí)一 分別接種于錐形瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中 一置37C搖床上發(fā)酵40小時(shí)一選出酶活力較高 者進(jìn)一步復(fù)篩直至選出中性淀粉酶高產(chǎn)突變株。1.3菌種的保藏菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本

10、材料，特別是利用微生物進(jìn)行有關(guān)生產(chǎn)，如氨基酸、抗生素、釀造等工業(yè)，更離不開菌種。所以菌種保藏是進(jìn) 行微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分。其任務(wù)是使菌種不死亡，同 時(shí)還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn)，人工創(chuàng)造條件，使抱子或菌體的 生長代謝活動(dòng)盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低 水平、缺氧狀態(tài)、干燥和低溫，使菌種處于 休眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力。常用 的菌種寶藏方法有：斜面冰箱寶藏法、沙土管寶藏法、菌絲速凍法、石蠟油封存 法、真空冷凍干燥保藏法、液氮超低溫保藏法。在這里我們采用沙土保藏法。方法：將需保藏

11、的菌種經(jīng)斜面培養(yǎng)后用無菌水 制成抱子懸液，加入經(jīng)滅菌處理的沙和土的混合物（或純沙亦可）作為載體，減 壓抽去水分，這些吸附有抱子的干燥沙土載體，在低溫下保存。操作步驟：斜面抱子先加滅菌蒸餾水22.5ml，沿斜面輕刮抱子后，再吸0.20.3 ml到滅菌備用的沙土管中，在真空度 100 Pa以下進(jìn)行干燥，直至沙土 管外貌呈松散狀態(tài)，然后低溫（4 C）保存。經(jīng)真空干燥后的沙土管，最好放在 密閉容器內(nèi)，容器內(nèi)可放入吸潮劑CaCb或硅膠等，保藏期間整個(gè)容器置于冰箱 內(nèi)。一般保存期為一年左右。2. 培養(yǎng)基的配制2.1培養(yǎng)基的類型培養(yǎng)基的種類很多，可以根據(jù)組成、狀態(tài)和用途等進(jìn)行分類，按照用途可以 分成抱子培養(yǎng)

12、基，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。微生物大規(guī)模發(fā)酵設(shè)計(jì)主要用到抱 子，種子和發(fā)酵培養(yǎng)基這三種類型。2.1.1抱子培養(yǎng)基抱子培養(yǎng)基配制的目的是供菌體繁殖抱子的，常采用的是固體培養(yǎng)基，對(duì)這類培養(yǎng)基的要求是能使菌體生長快速， 產(chǎn)生數(shù)量多而優(yōu)質(zhì)的抱子，并且不會(huì)引起 菌體變異。對(duì)抱子培養(yǎng)基的要求：營養(yǎng)不要太豐富；所用無機(jī)鹽的濃度要適 量；注意培養(yǎng)基的pH和濕度。中性淀粉酶的抱子培養(yǎng)基配置如下：將麩皮5%、豆餅粉3%、蛋白胨0.25%、 瓊脂2% （pH 7.1）制成斜面培養(yǎng)基，在O.IMPa蒸汽滅菌20 min。2.1.2種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基是供抱子發(fā)芽、生長和大量繁殖菌絲體，并使菌絲體長得粗壯成 為活力強(qiáng)的

13、種子。對(duì)于種子培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求比較豐富和完全， 氮源和維生素的 含量也比較高些，濃度以稀薄為好，可以達(dá)到較高的溶解氧，供大量菌體生長和 繁殖。中性淀粉酶的種子培養(yǎng)基的配置：將豆餅 1%、蛋白胨和酵母膏各0.4%、氯化鈉0.05%配置成種子培養(yǎng)基（pH 7.17.2），在0.1MPa蒸汽滅菌20 min。2.1.3發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基的要求是營養(yǎng)要適當(dāng)豐富和完全適合于菌種的生理特性和要求， 使菌種迅速生長、健壯，能在比較短的周期內(nèi)充分發(fā)揮產(chǎn)生菌合成發(fā)酵產(chǎn)物的能 力，但要注意成本和能耗。中性淀粉酶的發(fā)酵培養(yǎng)基配方是：麩皮 70%、小米糠20%、木薯粉10%、 燒堿0.5%，加水使水量達(dá)60%，常壓

14、蒸汽滅菌1h。2.2培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求培養(yǎng)基的成分大致分為碳源、氮源、無機(jī)鹽、微量元素、特殊生長因子、促 進(jìn)劑、前體和水等幾大類。對(duì)不同的微生物，微生物不同的生長階段，不同的發(fā) 酵產(chǎn)物以及不同發(fā)酵工藝條件等，所使用的培養(yǎng)基都是不同的，這些也都是培養(yǎng) 基配制需要考慮的因素。2.2.1 水水是所有培養(yǎng)基的主要成分，也是微生物機(jī)體的重要組成成分。水是良好的溶劑，又是活細(xì)胞中一切代謝反應(yīng)的媒介物，還可以維持細(xì)胞中的滲透壓，同時(shí)水又是熱的良好導(dǎo)體，有利于散熱，可調(diào)節(jié)細(xì)胞溫度。在中性淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn) 中，為了避免水質(zhì)變化給生產(chǎn)帶來不良影響，發(fā)酵用水采用深井水，并定期檢查水質(zhì)，要求：pH 6.87.2，電導(dǎo)率

15、5001500 /cm總硬度100230 mmol/L。2.2.2碳源碳源的主要為微生物細(xì)胞的生長繁殖提供能源。目前生產(chǎn)中性淀粉酶的菌種 為異養(yǎng)型微生物，所以只能利用有機(jī)碳；大量的農(nóng)副產(chǎn)品是主要的有機(jī)碳源，如 山芋、麩皮、玉米、米糠、馬鈴薯、木薯、土茯苓等淀粉質(zhì)原料，這里用到的碳 源是麩皮、馬鈴薯、木薯。2.2.3氮源氮源是組成蛋白質(zhì)和核酸的主要元素，酶自身即為蛋白質(zhì)。因此，氮源是必 不可少的重要原料。常用的有機(jī)氮源油花生餅粉、豆餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、 玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉等。我們用到的氮源是豆餅粉劑和蛋白胨。常用的無機(jī)氮源有銨鹽、硝酸鹽和氨水等。2.2.4無機(jī)鹽類及微量元素酶在生長和

16、繁殖生長過程中，需要某些無機(jī)鹽及微量元素如磷、 鎂、硫、鉀、 鈉、鈣、鐵、錳、鋅等。鈉離子具有控制細(xì)胞和培養(yǎng)基之間的滲透壓的作用，從 而促進(jìn)產(chǎn)酶，添加適量亞硝酸鈉可提高酶活力；鈣對(duì)淀粉酶有穩(wěn)定和活化作用。 中性淀粉酶生產(chǎn)中通常以氯化鈣提供鈣離子。2.2.5生長因子和產(chǎn)酶促進(jìn)劑酶的生產(chǎn)中所需的生長因子大多由天然原料提供。玉米漿、麥芽汁、豆芽汁等，都含有豐富的生長因子。產(chǎn)酶促進(jìn)劑一般是該酶的底物和底物類似物，對(duì)于中性淀粉酶，可添加適量濃度的淀粉瓊脂糖作為誘導(dǎo)劑。2.3培養(yǎng)基的滅菌生物化學(xué)反應(yīng)過程中，特別是細(xì)胞培養(yǎng)過程，往往要求在沒有雜菌污染的情 況下進(jìn)行，這是由于生物反應(yīng)系統(tǒng)中通常含有比較豐富的營

17、養(yǎng)物質(zhì)，因而很容易受到雜菌污染，進(jìn)而產(chǎn)生各種不良后果：（1）由于雜菌的污染，使生物化學(xué)反應(yīng) 的基質(zhì)或產(chǎn)物消耗，造成產(chǎn)率下降；（2）由于雜菌所產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物，或染 菌后發(fā)酵液的某些理化性質(zhì)的改變， 使產(chǎn)物的提取變得困難，造成收得率降低或 使產(chǎn)品質(zhì)量下降；（3）污染的雜菌可能會(huì)分解產(chǎn)物而使生產(chǎn)失?。唬?）污染的雜 菌大量繁殖，會(huì)改變反應(yīng)介質(zhì)的 pH，從而使生物化學(xué)反應(yīng)發(fā)生異常變化；（5） 發(fā)生噬菌體污染，微生物細(xì)胞被破裂而使生產(chǎn)失敗等。2.3.1滅菌方法所謂滅菌，就是指用物理或化學(xué)方法殺滅或去除物料或設(shè)備中一切有生命物 質(zhì)的過程。常用的滅菌方法有：化學(xué)滅菌、射線滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌和過 濾

18、滅菌等。本實(shí)驗(yàn)米用濕熱滅菌。2.3.2 培 養(yǎng)基 的濕熱滅菌條件為在121 C（表壓約O.IMPa）維持30分鐘。濕熱滅菌即利用飽和水蒸氣進(jìn)行滅菌， 是工業(yè)中最重要的滅菌方法。在同樣 的溫度下，溫?zé)岬臍⒕Ч雀蔁岷茫湓蛴校旱鞍踪|(zhì)凝固所需的溫度與其 含水量有關(guān)，含水量愈大，發(fā)生凝固所需的溫度愈低。濕熱滅菌中菌體蛋白質(zhì)吸 收水分，較同一溫度的干熱空氣中易于凝固而殺滅各種微生物。溫?zé)釡缇^程 中蒸氣放出大量潛熱，加速提高溫度。因而濕熱滅菌比干熱所要溫度低。 如在同 一溫度下，則濕熱滅菌所需時(shí)間比干熱短。 濕熱的穿透力比干熱大，使深部也 能達(dá)到滅菌溫度，故濕熱比干熱收效好。一影響滅菌效果的因素微

19、生物的種類和數(shù)量；培養(yǎng)基性質(zhì)、濃度、成分；滅菌的溫度、時(shí)間。二. 熱阻：微生物對(duì)熱的阻抗能力。三. 滅菌原理對(duì)數(shù)殘留定律：經(jīng)加工滅菌，死亡微生物速度和存在的微生物數(shù)量成正比。2.4空氣滅菌此課題為好氧發(fā)酵，以空氣作為氧源。根據(jù)國家藥品質(zhì)量管理規(guī)范的要求，生物制品、藥品的生產(chǎn)場地業(yè)需要符合空氣潔凈度的要求。獲得無菌空氣的方法有：輻射滅菌、化學(xué)滅菌、加熱滅菌、靜電除菌、過濾介質(zhì)除菌等。過濾介質(zhì)除菌是目前發(fā)酵工業(yè)中空氣除菌的主要手段，其介質(zhì)有棉花過濾器、超細(xì)玻璃纖維紙、石棉濾板、金屬燒結(jié)管等。2.4.1過濾除菌流程及設(shè)備流程如下：采風(fēng)塔-空氣粗過濾器一空氣壓縮機(jī)一儲(chǔ)氣罐一冷卻器一旋風(fēng)分 離器一冷卻器

20、一絲網(wǎng)除沫器一空氣加熱器一總空氣過濾器。設(shè)備如下：1. 采風(fēng)塔：采風(fēng)塔建在工廠的上風(fēng)頭，高至少 10 m,氣流速度8 m/s。2. 粗過濾器：主要作用是攔截空氣中較大的灰塵以保護(hù)空氣壓縮機(jī)，同時(shí)起一定的除菌作用，減輕總過濾器的負(fù)擔(dān)。3空氣壓縮機(jī)：作用是提供動(dòng)力，以克服隨后各設(shè)備的阻力。4空氣儲(chǔ)罐：作用是消除壓縮空氣的脈動(dòng)。要求：H/B=2 2.5 V= （0.1 0.2） V其中，H為罐咼；B為罐直徑；V1為空壓機(jī)每分鐘排氣量（20C，1 X105Pa狀況下）。5. 旋風(fēng)分離器：是利用離心力進(jìn)行氣-固或氣-液沉降分離的設(shè)備。作用是分 離空氣中被冷卻成霧狀的較大的水霧和油霧粒子。6. 冷卻器：空

21、壓機(jī)出口溫度氣溫在 120C左右，必須冷卻。另外在潮濕的地 域和季節(jié)還可以達(dá)到降濕的目的。7. 絲網(wǎng)除沫器：可以除去空氣中絕大多數(shù)的20以上的液滴和1何以上的霧滴，一般采用規(guī)格為直徑 0.25mm40孔且高度為150 mm的不銹鋼絲網(wǎng)。8. 空氣加熱器：列管內(nèi)走空氣，管外走蒸汽。可將空氣濕度由100%降低到 70%以下9. 總過濾器：填充物按下面順序安裝：孔板 f鐵絲網(wǎng)f麻布f活性炭f麻布 一棉花一麻布一鐵絲網(wǎng)一孔板。介質(zhì)要緊密均勻，壓緊一致，上下棉花層厚度為 總過濾層厚度的1/4,中間活性炭層為1/3。242無菌空氣的檢查現(xiàn)在米用的無菌檢查實(shí)驗(yàn)方法有肉湯培養(yǎng)法、斜面培養(yǎng)法和雙碟培養(yǎng)法。這 里

22、采用斜面培養(yǎng)法來檢查。具體方法如下：500ml三角瓶內(nèi)裝斜面培養(yǎng)基50m1,其組成為麥芽糖6%、豆粕水解液6%、Na2HPO4 12H2O 0.8%、（NH4）2SO40. 4%、CaCl2 0.2%、NH4C1 0.15%,pH 6.57.0,接種后置旋轉(zhuǎn)式搖床亡，（37 ）C下培養(yǎng)28h左右備用。2.5發(fā)酵罐的滅菌發(fā)酵罐的滅菌可采用空罐滅菌和實(shí)罐滅菌，此處采用空罐滅菌?？展逌缇菍⑺械耐饪诙忌晕⒋蜷_，然后通入熱水蒸汽，讓水蒸汽盡量通過每一個(gè) 菌落達(dá)到滅菌效果。具體方法是：在 121 C滅菌30分鐘。3. 種子擴(kuò)大培養(yǎng)本發(fā)酵屬于一級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，二級(jí)發(fā)酵。設(shè)計(jì)流程如下：抱子f錐形瓶f種

23、子罐f種子罐f發(fā)酵罐3.1抱子制備將保存在淀粉瓊脂斜面上的枯草芽抱桿菌抱子用無菌水洗下，接種到錐形瓶中，在35C靜置培養(yǎng)24天，待長出大量抱子后作為接種用的種子。3.2種子制備將保藏的菌種接種到馬鈴薯茄子瓶斜面 （20%馬鈴薯煎出汁加MgSO4 7H2O5 mg/L，瓊脂2%，pH 6.77.0），37C培養(yǎng)3天。然后接入到20L種子罐，37C 攪拌，通風(fēng)培養(yǎng)1214小時(shí)。此時(shí)菌種進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期（鏡檢細(xì)胞密集，粗壯 整齊，大多數(shù)細(xì)胞單獨(dú)存在，少數(shù)呈鏈狀，發(fā)酵液pH 6.36.8,酶活510U/mL）， 再接種到發(fā)酵罐。3.3發(fā)酵罐培養(yǎng)培養(yǎng)基的配制：用麥芽糖液配置成含麥芽糖6%、豆粕水解液6%7

24、%、Na2HPO4l2H2O 0.8%、（NH4）2SO 0.4%、CaCl2 0.2%、NH4CI0.15%、豆油 1kg、 深井水20L，調(diào)pH至6.57.0。發(fā)酵罐培養(yǎng)基經(jīng)消毒滅菌冷卻后接入 3%5%種子培養(yǎng)成熟液。培養(yǎng)條件 為：溫度 37C，罐壓 0.5kg/cm2,風(fēng)量 1 20h 為 1: 0.48vvm, 20 h 后 1: 0.67vvm，培養(yǎng)時(shí)間為2836 h。4. 發(fā)酵罐的設(shè)計(jì)4.1發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)通用發(fā)酵罐的主要組成部件有：1. 罐體：是發(fā)酵罐的主要結(jié)構(gòu)，其內(nèi)壁有擋板，作用是防止液內(nèi)中心產(chǎn)生漩 渦，一般用35塊擋板。2. 攪拌裝置：主要功能是使罐內(nèi)物料混合均勻，攪拌器葉輪多采

25、用攪拌渦輪式，攪拌軸要與罐體密封嚴(yán)實(shí)，防止漏液和染菌。攪拌轉(zhuǎn)速為200r/mi n.3. 傳熱裝置：有夾套，列管等，這里采用外夾套。4. 通氣部分：通過空氣分布器將通入的無菌空氣均勻分布到發(fā)酵液中，發(fā)酵罐通風(fēng)量012 h為1: 0.67vvm ,12 h至發(fā)酵結(jié)束通風(fēng)量為1： （1.01.33） vvm。 分布器有單管式和環(huán)形管式。5. 消泡裝置：用于消除產(chǎn)生的泡沫，最簡單實(shí)用的消泡裝置是耙式消泡器， 直接裝在攪拌軸上。6. 進(jìn)出料口：罐頂設(shè)有進(jìn)料口，罐底有出料口。其他附屬設(shè)備還包括試鏡、 人孔（手孔）、取樣管等，用以觀測(cè)和檢修。4.2發(fā)酵罐的工藝尺寸常用的機(jī)械通風(fēng)發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)和主要幾何尺寸標(biāo)

26、準(zhǔn)化設(shè)計(jì)（見附圖）其幾何尺寸比例如下：H0/D=1.73.5 H/D=2 5 d/D=1/3 1/2 W/D=1/12 1/8 B/D=0.81.0（S/d）2=12 （2表示攪拌器擋數(shù)）h/D=1/4 單位全部為m發(fā)酵罐大小用公稱體積表示，V0=nD 2H/4+0.15D3其中：Ho-發(fā)酵罐圓柱形筒身高度D-發(fā)酵罐內(nèi)徑H-罐頂?shù)焦薜椎母叨萪-攪拌器直徑 W-擋板寬度B-下攪拌器距罐底的距離S-攪拌器間距h-底封頭或頂封頭高度計(jì)算：已知年產(chǎn)量為3噸，中性淀粉酶產(chǎn)量為292g/L, 年有300個(gè)工作日，發(fā)酵 周期為48小時(shí)，即2天，清理發(fā)酵罐1天，對(duì)淀粉的轉(zhuǎn)化率為42%，預(yù)處理收 率85%，提取

27、率為70%，發(fā)酵罐個(gè)數(shù)為3個(gè)，裝料系數(shù)為0.75, Vo是公稱容積， 指筒身容積與底封頭容積之和，貝U：發(fā)酵罐體積為：V0=3X1OOO/292/ (300/3) /42%X85%X70%/3/0.75=0.18 m3 祠.200 m3由：V0=nDxH/4+0.15D3=nD3/2+0.15 D3=0.200m3得: D=0.43 mH=3D=3X 0.93=1.29 mW=D/12=0.93/12=0.036 mS=2D=24.88=0.43 m那么：H0=2.5D=2 0.93=1.075 m d=D/2=0.5 .93=0.215 m B=0.9D=0.9 0.93=0.387 m h

28、=D/4=0.93/4=0.108 m液面高度 HL=0.75(H+h)=0.75 (2.79+0.233)=1.049 m4.3物料衡算本系統(tǒng)采用3個(gè)發(fā)酵罐，每個(gè)為200 L=0.2 m3,中性淀粉酶產(chǎn)量為292g/L,對(duì) 糖的轉(zhuǎn)化率為42%，提取率為70%，裝料系數(shù)為0.75,則：每個(gè)發(fā)酵罐在一個(gè)發(fā)酵周期中性淀粉酶產(chǎn)量為：0.2 292 42%X70%X0.75 = 12.877 (kg)那么3個(gè)發(fā)酵罐1年的總產(chǎn)量為：(12.877 300/3) $ = 3863.16 ( kg) = 3.86 噸故符合年產(chǎn)量為3噸的生產(chǎn)要求。5. 發(fā)酵過程的工藝控制5.1發(fā)酵過程的補(bǔ)料策略中間補(bǔ)料是在發(fā)

29、酵過程中補(bǔ)充某些營養(yǎng)物料、水或產(chǎn)酶促進(jìn)劑，以滿足微生 物的代謝活動(dòng)和產(chǎn)酶的需要。中性淀粉酶生產(chǎn)中要經(jīng)常補(bǔ)料，用3倍年度濃度碳 源的培養(yǎng)基補(bǔ)料，體積相當(dāng)基礎(chǔ)料的1/2,從培養(yǎng)12h開始，每小時(shí)1次，分30 余次補(bǔ)加完畢。延長了發(fā)酵時(shí)間，提高了酶活力和單罐產(chǎn)量。5.2發(fā)酵過程pH值的控制各種微生物需要在一定的pH環(huán)境中方能正常生長繁殖。培養(yǎng)基中C/N比值高，發(fā)酵液傾向于酸性，pH偏低；C/N比值低，發(fā)酵液 傾向于中性或堿性，pH偏高。中性淀粉酶最適 pH為6.87.2。因此，在發(fā)酵 過程中，可通過添加適量的尿素或碳酸鈣等來調(diào)節(jié) pH上升或下降。5.3發(fā)酵過程溫度的控制溫度對(duì)微生物的生長、產(chǎn)物的合成

30、和代謝調(diào)節(jié)有重要作用。溫度變化一方面 影響各種酶反應(yīng)的速率和蛋白的性質(zhì)， 另一方面影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)。 不同的 菌種有著不同的最適溫度?？莶輻U菌發(fā)酵溫度控制在 35C37C最適宜。5.4溶氧的控制中性淀粉酶發(fā)酵是需氧發(fā)酵，無論是基質(zhì)的氧化，菌體的生長還是產(chǎn)物的合 成均需大量的氧氣。若發(fā)酵液中氧氣不足，可通過加大通氣量，適當(dāng)降低溫度， 提高罐壓，補(bǔ)水，提高攪拌速度來控制。中性淀粉酶發(fā)酵過程中，012 h通氣量為1: 0.67 vvm, 12 h至發(fā)酵結(jié)束通氣量為1:( 1.01.33) vvm攪拌轉(zhuǎn)速 200r/min。 罐壓 0.5kg/cm2。5.5染菌的控制在工業(yè)發(fā)酵中，染菌輕則影響產(chǎn)品

31、的質(zhì)和量、重則倒罐或停產(chǎn)、影響工廠 效益。因此要嚴(yán)格無菌操作，種子滅菌要徹底，凈化空氣設(shè)備，操作要慎重，設(shè) 備滅菌要徹底。若在前期染菌，應(yīng)重新滅菌；中期染菌，應(yīng)偏離雜菌生長條件； 后期染菌，可提前或及時(shí)放罐。可能出現(xiàn)的異常發(fā)酵現(xiàn)象：1. 培養(yǎng)基變?。嚎赡苁鞘删w污染或營養(yǎng)成分缺乏；2. 培養(yǎng)基過濃：會(huì)抑制微生物的生長，考慮可能是污水污染；3. 耗糖較慢：可能原因是種子生長能力降低，檢測(cè)種子是否衰退，發(fā)酵條件是否合適，以及營養(yǎng)成分是否全面，尤其注意缺磷；4. pH值不正常：用緩沖對(duì)來調(diào)節(jié)，檢查是否染雜菌，碳氮比是否合適；5生長緩慢：最可能的原因就是營養(yǎng)成分不足。6. 下游加工下游加工過程是生物工

32、程的一個(gè)組成部分，是生物化工產(chǎn)品通過微生物發(fā)酵 過程、酶反應(yīng)過程或動(dòng)植物細(xì)胞大量培養(yǎng)獲得，以上述發(fā)酵、反應(yīng)液或培養(yǎng)液分 離、精制有關(guān)產(chǎn)品的過程。下游加工過程的一般工藝流程為：固體一細(xì)胞破碎一分離發(fā)酵液一預(yù)處理一固液分離 液體一初步純化f高度純化f成品加工6.1發(fā)酵液的過濾和預(yù)處理預(yù)處理就是除去高價(jià)離子和蛋白質(zhì)，對(duì)高價(jià)離子的去除可以采用草酸或磷 酸，草酸它與鈣離子生成的草酸鈣，還能促使蛋白質(zhì)沉淀，加磷酸既能降低鈣離 子也能降低鎂離子。對(duì)于蛋白質(zhì)的沉淀可以加入絮凝劑，調(diào)節(jié)pH值或加熱。過濾：采用鼓式真空過濾器，過濾前加去乳化劑并降溫。6.2提取中性淀粉酶常用的提取方法有：鹽析法、乙醇淀粉吸附法和噴霧干燥法，這 里用鹽析法。具體方法：發(fā)酵液經(jīng)熱處理，冷卻到40C，加入硅藻土為助濾劑過濾。濾餅加2.5倍水洗滌，洗液同發(fā)酵液合并后，在 45C真空濃縮數(shù)倍后，加 (NH4)2SO4至40%飽和度。鹽析沉淀物加硅藻土后過濾，濾餅于40T烘干磨粉即 成粗酶制品。由酶液到粉狀制酶劑的收率為