黑曲霉產(chǎn)乳糖酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1、黑曲霉產(chǎn)乳糖酶酶學(xué)性質(zhì)研究 班 級(jí)：生物工程01班學(xué) 號(hào)：姓 名： 指導(dǎo)老師： 二零一六年六月摘要乳糖酶（Lactase）的系統(tǒng)名為-D-半乳糖昔半乳糖水解酶，或簡(jiǎn)稱子半乳糖昔酶。利用乳糖酶水解乳糖的能力，生產(chǎn)低乳糖制品（如乳糖水解乳、低乳糖奶粉等），可以有效解決“乳糖不耐癥”問題。用乳糖酶水解牛乳或乳制品中的乳糖，生產(chǎn)低乳糖制品可以有效消除人體對(duì)乳糖的不耐受癥狀，對(duì)于發(fā)展我國(guó)乳品工業(yè)，提高人們的健康水平具有十分重要的意義，這也是目前乳糖酶在食品工業(yè)的最大用途之一。關(guān)鍵詞：黑曲霉； 乳糖酶 ； 酶學(xué)性質(zhì)目錄引言41.1乳糖酶簡(jiǎn)介41.2在乳品工業(yè)中的應(yīng)用241.3乳糖酶的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及進(jìn)展5

2、2試驗(yàn)材料62.1試驗(yàn)菌株62.2主要儀器設(shè)備62.3實(shí)驗(yàn)試劑63.黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)73.1試驗(yàn)試劑73.2試驗(yàn)方法74.乳糖酶酶活力和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定74.1實(shí)驗(yàn)原理74.2試驗(yàn)試劑84.3試驗(yàn)方法84.1.1粗酶液制備85.PH值對(duì)乳糖酶活性影響及最適PH值確定105.1.系列緩沖溶液的配制105.2.試驗(yàn)方法116.溫度對(duì)乳糖酶活性的影響及最適溫度確定116.1實(shí)驗(yàn)方法116.2結(jié)果分析127.蛋白質(zhì)的層析、洗脫127.1.實(shí)驗(yàn)原理127.2.試驗(yàn)方法127.3測(cè)定吸光值148.乳糖酶分子量測(cè)定-SDS-PAGE電泳法148.1.凝膠配制148.2實(shí)驗(yàn)方法148.3 結(jié)果分析149展望15

3、引言1.1乳糖酶簡(jiǎn)介牛奶是最接近完善的營(yíng)養(yǎng)食品，它包含了人類生長(zhǎng)和維持健康的一切營(yíng)養(yǎng)成分，具有豐富的蛋白質(zhì)氨基酸和維生素，是天然鈣質(zhì)的極好來源。乳糖是奶類中特有的糖類，也是重要的營(yíng)養(yǎng)成分之一，該物經(jīng)小腸粘膜上皮細(xì)胞絨毛遠(yuǎn)端刷狀緣上的乳糖酶水解成為半乳糖和葡萄糖后，才能被小腸吸收利用。乳糖酶學(xué)名半乳糖苷半乳糖水解酶，又名半乳糖苷酶，是一種白色粉末，無味道，無嗅，溶解后是一種淺棕色液體，乳糖酶通過特定條件水解半乳糖苷鍵 將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，易被腸道吸收。大量研究表明哺乳動(dòng)物的乳糖酶活性隨年齡的增長(zhǎng)，具有典型的生理性降低，成人乳糖酶下降的不可逆受基因控制1乳糖不耐癥在世界范圍內(nèi)是一種多發(fā)疾病

4、，易發(fā)人群有以下幾種情況：（1）成年人主要是由于遺傳原因，體內(nèi)乳糖酶從出生一年后開始衰減。（2）是先天性疾病。嬰兒在剛出生時(shí)腸道內(nèi)就缺乏乳糖酶活性，這將導(dǎo)致嚴(yán)重的腸胃系統(tǒng)失調(diào)。（3）由于早產(chǎn)而造成嬰兒腸道低乳糖酶活性。（4）蛋白質(zhì)熱值吸收障礙嚴(yán)重的兒童，其乳糖酶活性在一個(gè)時(shí)期內(nèi)會(huì)暫時(shí)消失。乳糖不耐癥發(fā)生的人種間差別：據(jù)悉，70%的成年黑人、10-15%的成年白人、95%的亞洲人受乳糖不耐癥困擾。 1.2在乳品工業(yè)中的應(yīng)用2 在20世紀(jì)初乳糖酶在乳品工業(yè)中的潛力已為人所知，但直至20世紀(jì)60年代，當(dāng)從微生 物中制取乳糖酶進(jìn)入商品化生產(chǎn)后大規(guī)模應(yīng)用乳糖酶制造低乳糖的乳制品才得以實(shí)現(xiàn)。 1.制作低乳

5、糖水解奶：乳糖酶可使低甜度和低溶解度的乳糖轉(zhuǎn)變?yōu)檩^甜的溶解度較大的單糖 （葡萄糖和半乳糖）增加鮮奶的甜度，改善品質(zhì)，口感。既解決了乳糖不耐受癥，又提高了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。 2.在發(fā)酵乳品中的應(yīng)用：可加速發(fā)酵效率和反應(yīng)速度，使不被一般酵母利用的乳糖因水解成葡萄糖而得以利用，增加風(fēng)味和甜度。 3.在乳清產(chǎn)品中的應(yīng)用：乳清糖漿可以代替卵蛋白和蔗糖，既減少了糖的用量，又使脫鹽乳清粉在食品中的應(yīng)用量增大，還可促進(jìn)發(fā)酵生色。 4.在甜煉乳中的應(yīng)用：乳糖酶水解了乳糖，在濃縮時(shí)可避免乳糖的結(jié)晶現(xiàn)象，使產(chǎn)品細(xì)膩，改善品質(zhì)、可持久保存。 5.在奶粉中的應(yīng)用：大大提高奶粉的風(fēng)味和口感、沖調(diào)性好、適用人群廣、用途多。 在奶酪

6、中的應(yīng)用：可提高成熟過程，提高奶酪的品質(zhì)，不僅縮短乳酪凝固時(shí)間#而且乳酪凝固堅(jiān)實(shí) 減少乳酪澄清造成的損失。 6.在低聚糖的生產(chǎn)中的應(yīng)用：乳糖酶通過轉(zhuǎn)糖苷作用生成低聚糖，低聚糖可減少腸道有害毒素的產(chǎn)生，防止便秘和腹瀉，有整腸效果、抗癌、降血壓、增強(qiáng)肝功能及促進(jìn)鈣吸收等作用。 1.3乳糖酶的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及進(jìn)展自上世紀(jì)60年代以來，科學(xué)家們相繼發(fā)現(xiàn)人體中普遍缺乏乳糖酶.牛乳曾被推崇為天然完全食品，但缺乏乳糖酶的人是不能消化吸收乳糖的，造成乳糖不耐受現(xiàn)象。這一發(fā)現(xiàn)受到全世界許多酶學(xué)家、微生物學(xué)家、醫(yī)學(xué)家以及食品科學(xué)家的重視.此后有關(guān)乳糖酶的研究進(jìn)入了一個(gè)嶄新的時(shí)代。在美國(guó)、日本和意大利等國(guó)己工業(yè)化生

7、產(chǎn)固定化的乳糖酶，功能性乳制品一低乳糖制品，并應(yīng)用于政府實(shí)施的“學(xué)生奶計(jì)劃”之中3國(guó)內(nèi)對(duì)-D一半乳糖昔酶的研究起步較晚，于20世紀(jì)80年代以后才開始對(duì)乳糖酶進(jìn)行研究。到目前為止，已經(jīng)報(bào)道了一些乳糖酶產(chǎn)生菌株，并對(duì)酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)，誘變育種及產(chǎn)酶優(yōu)化，酶的固定化及工業(yè)應(yīng)用等方面進(jìn)行了一定的研究46和其他生物學(xué)領(lǐng)域一樣，近年來關(guān)于乳糖酶分子生物學(xué)方面的研究也很多，基因工程技術(shù)的發(fā)展特別是真核表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展為乳糖酶的生產(chǎn)展示出廣闊的前景，并且目前國(guó)內(nèi)外均有工程菌問世7目前，國(guó)外己進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)乳糖酶階段，如荷蘭Gist-brocades公司生產(chǎn)的商品名為Maxilact的酵母乳糖酶己被用于工業(yè)

8、化生產(chǎn)低乳糖乳。而國(guó)內(nèi)，由于菌種酶活力較低，使得乳糖酶的生產(chǎn)至今仍局限于小型實(shí)驗(yàn)規(guī)模。因此，選育高產(chǎn)菌株，提高乳糖酶的產(chǎn)量已成為棘手的問題82試驗(yàn)材料2.1試驗(yàn)菌株 黑曲霉DL116：生物工程系酶工程實(shí)驗(yàn)室提供。2.2主要儀器設(shè)備1.電子天平：品牌：奧豪斯， 型號(hào)：AR423CN， 準(zhǔn)確度等級(jí)：， 廠家：奧豪斯儀器（上海）有限公司， 產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：Q/SGYM 1009， 序列號(hào)：B436985256；可見分光光度計(jì)：品牌：菁華， 型號(hào)：JH-11-11 A-11-11-096， 廠家：上海菁華科技儀器有限公司， 儀器編號(hào)：A1111096；2.三孔電熱恒溫水槽：品牌：Blue pard， 型號(hào)

9、：DK-8D， 廠家：上海一恒科學(xué)儀器有限公司 上海一恒科技有限公司， 儀器編號(hào)：141022455；3.電泳儀：品牌：君意， 型號(hào)：JY600C， 廠家：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司， 序列號(hào)：YD7F21310082；4.移液槍（0.510ul，10100uL，1001000ul），滅菌槍頭，吸量管（1ml，5ml），洗耳球，試管若干，試管架，膠頭滴管，燒杯，玻璃棒，試管刷，容量瓶（100ml，250ml，500ml），量筒，洗瓶，錐形瓶，圓口燒瓶（100ml，250ml，500ml，1000ml），藥匙，離心管，柱層析管，橡膠管，鐵架臺(tái)，電熱爐，簽字筆，紙，標(biāo)簽等2.3實(shí)驗(yàn)試劑待測(cè)定酶液

10、（酶學(xué)研究室提供）鄰硝基苯酚-D-半乳糖苷（ONPG）溶液：1.2%水溶液，Na2CO3溶液：5%水溶液，ONP溶液，標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液：配制成0.1mg/ml的溶液，考馬斯亮藍(lán)G-250，95%酒精，85%濃磷酸，蒸餾水，甘氨酸，濃鹽酸，冰醋酸，醋酸鈉，This，氫氧化鈉，凝膠，洗脫液，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，10%SDS（W/V），10%過硫酸銨（W/V），甘油，0.1%溴酚藍(lán)，重蒸水，2-巰基乙醇，TEMED等3.黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)3.1試驗(yàn)試劑1斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯40克，葡萄糖4克，瓊脂34克，自來水200ml，自然pH 制法：馬鈴薯去皮后，切成小塊，加水煮爛（煮沸2

11、030分鐘，能用玻璃棒搓破即可），用四層紗布過濾，再加糖和瓊脂加熱融化后再補(bǔ)足水分1000ml，121下滅菌20分鐘，備用。 2、液體發(fā)酵培養(yǎng)基：果膠2.5%，豆粕粉6%，玉米漿9%，（NH4）SO4 0.1% K2HPO4 1%，Tween-80 0.3%； 3、滅菌生理鹽水：0.85gNaCl至100ml蒸餾水的三角瓶中，加上棉塞，外包一層牛皮紙，121下滅菌20分鐘，備用。 4、黑曲霉菌株：產(chǎn)乳糖酶菌株黑曲霉DL116由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品院酶學(xué)研究室提供。5、滅菌槍頭，備用。3.2試驗(yàn)方法 1、 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)：用接種環(huán)取乳糖酶菌株黑曲霉DL116接種與試管斜面培養(yǎng)基中，恒溫箱培養(yǎng)箱中28下

12、保存，培養(yǎng)45天，備用。 2、 發(fā)酵培養(yǎng)：將菌種轉(zhuǎn)接斜面活化，待孢子成熟后制備孢子懸液，接種發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，接種104個(gè)/ml。發(fā)酵條件為30，140r/min，裝液量30ml/250ml。發(fā)酵培養(yǎng)7天備用。4.乳糖酶酶活力和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定4.1實(shí)驗(yàn)原理 <1>.乳糖酶活力測(cè)定方法：乳糖酶活力的測(cè)定方法：0.6%鄰硝基苯酚-D-半乳糖苷(ONPG)溶液0.7 ml，55水浴預(yù)熱5 min，加入適當(dāng)稀釋的待測(cè)酶液0.1 mL，繼續(xù)保溫10 min取出，加入0.8 mL 5% Na2CO3溶液顯色，定容至8 mL，420 nm處比色。以加熱滅活的待測(cè)液同樣處理作為空白。用已知

13、濃度的ONP溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)ONP的濃度C對(duì)應(yīng)的OD值，利用最小二乘法建立回歸方程：在上述條件下，每分鐘水解ONPG產(chǎn)生1mol鄰硝基苯酚(ONP)的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。<2>.Bradford檢測(cè)法的原理：這是一種迅速、可靠的通過染色法測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)含量的方法?？捡R斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同的顏色形式。在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色的溶液；當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)定。該化合物在465595nm處有最大的光吸收值，化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度的高低呈正比關(guān)系。因此，可以通過檢測(cè)595nm處的光吸收值的大小來計(jì)算蛋白質(zhì)含量。4

14、.2試驗(yàn)試劑1、基苯酚-D-半乳糖苷（ONPG）溶液：1.2%水溶液。2、酸鈉溶液：5%水溶液。 3、ONP溶液：1mg/ml 4、血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.1mg/ml5、染料溶液：稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 0.1g溶于95%酒精50ml中，再加85%的濃磷酸100ml，用水稀釋至1000ml，混勻備用。4.3試驗(yàn)方法4.1.1粗酶液制備4層紗布過濾發(fā)酵液，除去黑曲霉菌絲體。用PH=4.0的0.05mol/L的HAc/NaAc緩沖液洗滌菌絲體，洗滌液經(jīng)4層紗布過濾后與過濾除菌的酶液合并。合并液經(jīng)雙層濾紙抽濾去除孢子即得粗酶液。 粗提液的制備;取搖瓶培養(yǎng)菌液，2000r/min離心10min，去

15、除沉淀，再經(jīng)8000r/min離心30min，收集的上清液即為粗酶液。 <1>.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：管號(hào)012345標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（ml）00.20.40.60.81.0蒸餾水（ml）1.00.80.60.40.20.0染料溶液（ml）5.05.05.05.05.05.0蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）00.0030.0070.0100.0130.017A595nm00.1800.3240.3450.5580.556按表分別向各試管內(nèi)加入各種試劑，充分混勻，5min后在595nm波長(zhǎng)處以0號(hào)管調(diào)0測(cè)定各管試管吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)、蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 樣品測(cè)定：取1ml樣品溶液

16、（發(fā)酵液、可適當(dāng)稀釋），加入燃料溶液5ml，混勻，5min后在595nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其蛋白質(zhì)濃度。<2>.ONP標(biāo)準(zhǔn)曲線：ONP濃度mg/mL0.020.040.060.080.1吸光度0.2100.4240.7551.0431.218樣品測(cè)定的吸光值：樣品吸光值1.3011.3041.3051.3081.307ONP濃度mg/mL0.10430.10450.10460.10490.1048樣品酶液量（ml）酶活力（U/ml）蛋白質(zhì)含量（mg/ml）比活力（U/mg）總活力（U）發(fā)酵液0.160.210.01623716.676.021結(jié)果分析：5.PH值對(duì)乳

17、糖酶活性影響及最適PH值確定 5.1.系列緩沖溶液的配制 0.4mol/L pH2.03.0甘氨酸-鹽酸系列緩沖液：X毫升1.6mol/L的甘氨酸+Y毫升1.6mol/L鹽酸，再加水稀釋至200毫升。(配比見下表)pHXYpHXY2.05044.03.05011.4 0.4 mol/L pH3.55.5的醋酸-醋酸鈉系列緩沖液：pH0.4MNaAC0.4MHACpH0.4MNaAC0.4MHAC4.01.808.205.07.003.00 0.4 mol/L pH6.08.5的Tris-HCl緩沖液：4×0.605g This溶于水，濃Hcl調(diào)pH，定溶50ml。 0.4 mol/L

18、 pH9.010.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液：X毫升1.6mol/L的甘氨酸+Y毫升1.6mol/L氫氧化鈉，再加水稀釋至200毫升(配比見下表)pHXYpHXY9.0508.810.05032.0 5.2.試驗(yàn)方法將底物用相應(yīng)不同的PH緩沖溶液配制（可用0.4mol/L的緩沖溶液與1.2%的ONPG水溶液等體積混合配制而成，替代實(shí)驗(yàn)2.2中0.6%鄰硝基苯酚-D-半乳糖苷(ONPG)溶液，總體積0.7ml），在不同PH（如下表）、55下測(cè)定酶活性，測(cè)定方法相同。 pH2.03.04.05.06.07.08.09.0吸光值0.4271.6561.5391.4530.1160.0520.0510

19、.043酶活（U/ml） 20.59 76.0970.8166.936.543.653.603.24結(jié)果分析：<1>PH值對(duì)酶活性有較大影響，過低或過高的PH都可以抑制乳糖酶的活性<2>本實(shí)驗(yàn)條件下，乳糖酶的最適PH為36.溫度對(duì)乳糖酶活性的影響及最適溫度確定6.1實(shí)驗(yàn)方法酶反應(yīng)最適溫度及熱穩(wěn)定性：最適溫度的測(cè)定在PH5、緩沖體系及不同溫度（20-80）下進(jìn)行酶促反應(yīng)。測(cè)定方法同2.2中相同，改變反應(yīng)溫度，如下表：溫度2030405060708090酶活（U/ml）溫度2030405060708090吸光值0.3460.6211.0661.6201.7961.9740.

20、3120.159酶活（U/ml）16.9329.3549.4574.4782.4290.4615.398.486.2結(jié)果分析<1>溫度對(duì)酶活性有較大影響，過低或過高的溫度都可以抑制乳糖酶的活性<2>本實(shí)驗(yàn)條件下，乳糖酶的最適溫度為707.蛋白質(zhì)的層析、洗脫7.1.實(shí)驗(yàn)原理凝膠是具有一定孔徑的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，主要用于分離分子大小不同的生物大分子以及測(cè)定其相對(duì)分子量。相對(duì)分子質(zhì)量小的物質(zhì)可通過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入凝膠顆粒的內(nèi)部，洗脫時(shí)由于走的路線長(zhǎng)，下來的慢，而相對(duì)質(zhì)量大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，出來快。從而達(dá)到分離的目的。 由于蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量較硫酸銨大得多，故可用凝膠層析方

21、法除去硫酸銨。7.2.試驗(yàn)方法樣品制備：取5ml蛋白質(zhì)溶液于離心管中，加3g硫酸銨粉末，邊加邊攪拌使之溶解，靜置15分鐘后，將其進(jìn)行離心12000r/min，15分鐘后，棄去上清液，加入適量tris-Hcl（1mol/l）緩沖溶液溶解沉淀物，即為樣品。裝柱：將層析柱垂直固定于鐵架臺(tái)上，將以處理好的葡聚糖凝膠G-25注入層析柱內(nèi)，最好一次連續(xù)裝柱，防止出現(xiàn)氣泡和斷層現(xiàn)象。平衡：將洗脫液與層析柱入口相連，用洗脫液平衡凝膠，液面保持高于凝膠床體。加樣與洗脫：將柱中多余的液體放出，使液面剛好蓋過凝膠，將樣品小心沿柱內(nèi)壁加入柱中，要小心不能觸到凝膠表面。然后將層析柱上端封口，接上入口管，加入洗脫液，開始

22、洗脫。（加樣量一般為床柱體積的1%10%，收集與測(cè)定：用部分收集器收集洗脫液，每3分鐘移動(dòng)一管。用G-250和醋酸鉛檢測(cè)，G-250遇到蛋白質(zhì)變?yōu)榍嗌?，硫酸銨與醋酸鉛反應(yīng)有白色沉淀產(chǎn)生。結(jié)果分析：以蒸餾水+考馬斯亮藍(lán)作空白對(duì)照，以此測(cè)定吸光值調(diào)零。組數(shù)12345678910吸光值00.0360.5371.1251.1481.0000.7900.5890.5090.46011121314151617181920210.3800.3120.3030.2890.2400.1650.1720.0790.0410.1530.12222232425262728293031320.0920.0610.070

23、0.0660.0310.0570.0530.0510.0430.075-0.03利用凝膠柱層析法可將不同分子量的蛋白質(zhì)洗脫分離開來，將測(cè)定的吸光值數(shù)據(jù)繪制成圖表，在此曲線圖中，一種波峰代表一種蛋白質(zhì)，根據(jù)圖表確定本實(shí)驗(yàn)中洗脫的蛋白質(zhì)溶液中只含有一種蛋白質(zhì)。7.3測(cè)定吸光值收集洗脫出的乳糖酶（樣品）約30管，每管中取1ml樣品加入4ml考馬斯亮藍(lán)，分別測(cè)定其吸光值A(chǔ)。 8.乳糖酶分子量測(cè)定-SDS-PAGE電泳法 8.1.凝膠配制如下表分離膠30%Acr5ml1M pH8.8This-Hcl緩沖液5.6mlH2O4.35ml10%SDS0.15ml10%過硫酸銨0.15mlTEMED20µL濃縮膠30%Acr0.835ml1M Ph6.8This-Hcl緩沖液0.625mlH2O3.52ml10%SDS0.05ml10%過硫酸銨0.07mlTEMED10µL8.2實(shí)驗(yàn)方法電泳槽安裝密封灌膠加電極緩沖液點(diǎn)樣電泳剝膠染色脫色成像8.3 結(jié)果分析本實(shí)驗(yàn)中根據(jù)SDS-PAGE電泳法測(cè)定乳糖酶分子量大約為135KD。9展望此次實(shí)驗(yàn)研究了黑曲霉產(chǎn)乳糖酶的發(fā)酵生產(chǎn)條件及其酶學(xué)性質(zhì)研究，但是由于自身水平、實(shí)驗(yàn)時(shí)間及實(shí)驗(yàn)條件等因素的限制，本課題在研究過程中還存在一