熒光共振能量轉移FERT演示課件

1、1陳陳 同同 生生華南師范大學信息光電子科技學院華南師范大學信息光電子科技學院熒光共振能量轉移熒光共振能量轉移fluorescence resonance energy transfer (fret)2分子能級與熒光s0s1t1hn0hn1hn22. 熒光（熒光（fluorescence)：當處于基態(tài)的分子吸收光能后進入激發(fā)態(tài)，并且立即返回基態(tài)并以光的形式釋放能量，這種光稱為熒光。 4. 激發(fā)(excitation, ex)和發(fā)射(emission, em)光譜（spectra):1. 能級（能級（ energy level）：）：原子的可能狀態(tài)是不連續(xù)的，因此各狀態(tài)對應能量也是不連續(xù)的。包含

2、電子能級、振動能級和轉動。3. 磷光（磷光（phosphorescence）:分子從激發(fā)三線態(tài)返回基態(tài)以光的形式釋放能量。3cfpex. 440nmex. 470nmem. 470nmyfpem. 535nm熒光共振能量轉移(fret)現(xiàn)象3. fret現(xiàn)象的特征現(xiàn)象的特征: 選擇性激發(fā)供體,卻能檢測到受體發(fā)射的熒光1. 供體供體(donor, d)donor2. 受體受體(acceptor, a)acceptor4fret 原理(principle)5fret的條件66060rrre發(fā)生發(fā)生fretfret需要三個條件：需要三個條件：1 1、供體分子的發(fā)射光譜和受體分子的吸收、供體分子的發(fā)射

3、光譜和受體分子的吸收光譜必須有顯著的重迭，一般大于光譜必須有顯著的重迭，一般大于 3030；2 2、供體分子和受體分子間的距離必須在、供體分子和受體分子間的距離必須在 1 10 nm 1 10 nm 之間之間. d. d和和a a間的間的fret fret 效率：效率： 3 3、供體分子的發(fā)射態(tài)偶極矩與受體分、供體分子的發(fā)射態(tài)偶極矩與受體分子的吸收態(tài)偶極矩、以及它們的向量子的吸收態(tài)偶極矩、以及它們的向量必須滿足一定的條件必須滿足一定的條件r0: e=50%時供體和受體分子間的距離.對于特定的供體受體對是常數(shù);r: 供體和受體分子間的距離.e: fret效率. 對于r特別靈敏.舉例: 假設 r0

4、=5nm, 1） r=10nm, e=1.5%2） r=5nm, e=50%3） r=6nm, e=25% 450 500 550 600l (nm)d ema ex61)蛋白分子的共定位;2)蛋白分子聚合體;3)轉錄機制;4)轉換途徑;5)分子運動;6)蛋白折疊等生物學問題.fret的應用的應用通過 fret 技術可以獲得有關兩個蛋白分子之間相互作用的空間信息。常用于解決如下問題:7laserlaserdafret技術應用一:檢測兩個發(fā)光分子間的重合與共定位8熒光標記利用fret技術檢測不發(fā)光分子間相互作用的策略9fret技術應用二: 檢測分子間的相互作用laser10laserfret技術

5、應用三: 檢測分子的折疊與構象變化11fret技術應用舉例：細胞內鈣離子濃度的實時測量miyawaki a, et al., nature 1997, 388:882-887(b)12 bfp-gfp bfp-yfp cfp-yfp cfp-dsred gfp-dsred在fret實驗中經常使用的供體-受體熒光分子對2. 綠色熒光蛋白類(green fluorescent proteins, gfps)1.染料類(dye)fitc-rhodamine alexa488-cy3 cy3-cy513參考閱讀文獻參考閱讀文獻jonathan d. violin,et al., a genetical

6、ly encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase c. j cell biology, 2003,161:899909elizabeth a j et l., fret imaging. nature biotechnology, 2003,21:13887-1395rajesh b s. fluorescence resonance energy transfer (fret) microscopy imaging of live cell protein localiz

7、ations. j cell biology, 2003, 160: 629633jin zhang, et al.,. genetically encoded reporters of protein kinase a activity reveal impact of substrate tethering. pnas ,2001, 98: 1499715002michael g. erickson, et al., dsred as a potential fret partner with cfp and gfp. biophysical journal , 2003,85:599611 alexander sorkin, et al., interaction of egf receptor and grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (fret) microscopy. current biology 2000, 10:13951398 14思思 考考 題題2.你認