ELISA實驗原理及操作

1、實驗五實驗五 免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用elisaelisa一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康腶. 了解和掌握免疫酶技術(shù)的測定原理。b. 掌握酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)的操作步驟，學(xué)會利用競爭elisa的方法，定量測定抗體或抗原。c. 了解免疫酶技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的重要意義及應(yīng)用價值。二、實驗原理二、實驗原理 免疫標(biāo)記技術(shù)（免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabellingimmunolabelling technique technique）: : 是指用熒光素、放射性同位素、酶、發(fā)光劑或是指用熒光素、放射性同位素、酶、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)等作為示蹤劑，標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行電子致密物質(zhì)等作為示蹤劑，標(biāo)

2、記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。的抗原抗體反應(yīng)。 特點：特點：高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位 分類：分類：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和發(fā)光免疫測定。免疫電鏡技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和發(fā)光免疫測定。 免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)(enzyme immunoassay)(enzyme immunoassay)： 是將抗原和抗體的特異性免疫反應(yīng)與酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種免疫檢測技術(shù)。 就是利用酶標(biāo)記抗體或抗原，以檢測相應(yīng)抗原或抗體的一種免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)。 酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸

3、附試驗elisaelisa（enzyme linked immunosorbentenzyme linked immunosorbent assay assay） 是一類常用的免疫酶技術(shù)。是將已知是一類常用的免疫酶技術(shù)。是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行?？乖贵w反應(yīng)在固相表面進(jìn)行。常用的酶：常用的酶：辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶(hrp)(hrp) 堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（apap）。）。elisaelisa檢測抗原檢測抗原 ag +ag + ab ab* * ag-ab ag-ab* *elisaelisa檢測抗體檢測抗體

4、 ab +ab + ag ag* * ab-ag ab-ag* *elisaelisa檢測抗體檢測抗體ag + ab1 ag + ab1 ag-ab1 ag-ab1ag-ab1 + ab2ag-ab1 + ab2* * ag-ab1-ab2 ag-ab1-ab2* * 競爭競爭elisaelisa檢測檢測抗原抗原固定固定od值值實驗材料：實驗材料： 羊抗人血清白蛋白抗體（一抗）羊抗人血清白蛋白抗體（一抗） 已知含量的人血清白蛋白（作標(biāo)準(zhǔn)曲線）已知含量的人血清白蛋白（作標(biāo)準(zhǔn)曲線） 待檢人血清白蛋白待檢人血清白蛋白 辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗羊抗體（二抗）辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗羊抗體（二抗） 包被

5、液包被液cbscbs：ph9.6ph9.6，0.05mol/l0.05mol/l碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液 洗板液或稀釋液：洗板液或稀釋液：ph7.4ph7.4，0.01mol/l pbs0.01mol/l pbs 底物溶液：底物溶液：opd-hopd-h2 2o o2 2 終止液：終止液：2mol/l h2mol/l h2 2s0s04 4 酶標(biāo)反應(yīng)板（一條酶標(biāo)反應(yīng)板（一條/ /人）人）三、操作步驟三、操作步驟1.包被抗原包被抗原 抗原用包被液（cbs）稀釋至合適濃度，加入到酶標(biāo)酶標(biāo)板板中，100l/孔，放入濕盒中，4過夜。 次日，用洗板液洗板3次（將洗板液加入每孔，1min后傾去），以洗去未

6、包被的游離抗原?？乖乖?00ul/孔孔濕盒中，4過夜酶標(biāo)板酶標(biāo)板2.抗原與抗體的預(yù)孵育抗原與抗體的預(yù)孵育制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線： 在稀釋板中，用pbs倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)抗原，每種濃度的抗原最終為50l，分別在各抗原孔中加入250l一定濃度的抗體，放入37恒溫培養(yǎng)箱中30 min。待測抗原：待測抗原： 取50l未知濃度的抗原按照同上操作。待測抗原待測抗原50ul50ulpbspbs 50ul50ul 稀釋液稀釋液50ul50ul100ul 100ul 標(biāo)準(zhǔn)抗原標(biāo)準(zhǔn)抗原250ul抗體抗體稀釋板37，30 min3. 3. 與固相抗原的競爭結(jié)合與固相抗原的競爭結(jié)合 取稀釋板中預(yù)孵育的抗原抗體混合液1

7、00l，加入酶標(biāo)板的抗原孔中，放入37恒溫培養(yǎng)箱中60 min。洗板3次。 100ul稀釋板稀釋板酶標(biāo)板酶標(biāo)板37，60 min洗板3次4. 4. 酶標(biāo)二抗的結(jié)合酶標(biāo)二抗的結(jié)合 酶標(biāo)抗體用稀釋液稀釋至工作濃度后，加入每孔中，100ul/孔，置濕盒中放37 30min。洗板3次。5. 5. 加入底物顯色液加入底物顯色液（用前再配制，并置棕色瓶內(nèi)） 每孔加入底物顯色液，100ul/孔，濕盒中37保溫一定時間。6. 6. 終止反應(yīng)終止反應(yīng) 待出現(xiàn)明顯顏色反應(yīng)（或一定時間）后，加入終止液， 50ul/孔以終止反應(yīng)。7. 7. 結(jié)果測定結(jié)果測定 用酶標(biāo)儀在492nm波長下測定od值。 以標(biāo)準(zhǔn)抗原的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的od值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算未知抗原的濃度。四、思考題四、思考題1.