免疫細胞分離

1、 第一節(jié)第一節(jié) 免疫細胞的分類與分離免疫細胞的分類與分離一、免疫細胞的種類與特征二、免疫細胞的分離技術三、細胞的凍存與復蘇免疫細胞的特征免疫細胞的特征1、免疫細胞的形態(tài)學特征 理化性狀 生物學特性2、免疫細胞的膜分子特征 CD分子 免疫細胞的起源與分化免疫細胞的起源與分化 紅細胞 血小板 肥大細胞 中性粒細胞 巨噬細胞 樹突狀細胞 漿細胞 T細胞 NK細胞免疫細胞的分離技術免疫細胞的分離技術1、密度梯度離心法2、黏附分離法3、熒光激活分離法4、磁性分離法5、其他分離法密度梯度離心法密度梯度離心法離心前離心后稀釋抗凝血淋巴細胞分離液血漿單個核細胞粒細胞紅細胞沉降速度 =2r2（QQ0）9 x g

2、Q =顆粒比重 Q0 =溶質比重 r =顆粒半徑 = 形狀因子 = 顆粒摩擦系數(shù)/同體積球型顆粒摩擦系數(shù) = 粘稠度 g = 相對離心力 人類血液有形成分的平均密度與直徑人類血液有形成分的平均密度與直徑 密度 直徑（）血小板 1.041.06 淋巴細胞 1.061.08 810粒細胞 1.081.09 13紅細胞 1.091.10 7.5黏附分離法黏附分離法尼龍毛法貼壁法親和板法吸附柱法熒光激活分離法（熒光激活分離法（FACS）熒光檢測器濾光片透鏡接物鏡激光束偏轉板噴嘴細胞收集管流體護套樣品流式細胞儀流式細胞儀磁性分離法磁性分離法磁鐵吸引法磁式細胞分類術法MACS (陽性選擇法）陽性選擇法）N

3、SMACS (陰性選擇法）陰性選擇法）NS其他分離法其他分離法花環(huán)沉降法細胞活化克隆法MHC分子四聚體法抗原肽抗原肽-MHC分子四聚體技術分子四聚體技術T細胞的凍存與復蘇細胞的凍存與復蘇細胞凍存的原理與方法細胞復蘇的原理與方法細胞凍存罐細胞凍存罐 第二節(jié)第二節(jié) 免疫細胞膜分子的檢測免疫細胞膜分子的檢測一、免疫細胞膜分子檢測的原理與類型二、免疫細胞膜分子的檢測方法免疫細胞膜分子檢測的原理與類型免疫細胞膜分子檢測的原理與類型1、以抗體識別抗原2、以配體識別受體免疫細胞膜分子的主要檢測方法免疫細胞膜分子的主要檢測方法1、免疫標記檢測方法 熒光抗體法 酶免疫檢測法 免疫金銀染色法2、補體依賴的細胞毒試

4、驗（CDC）3、花環(huán)形成試驗SmIg的熒光抗體檢測法的熒光抗體檢測法SmIg的酶免疫檢測法的酶免疫檢測法補體依賴的細胞毒試驗補體依賴的細胞毒試驗（CDC）染料補體E-花環(huán)花環(huán)T細胞B細胞花環(huán)形成細胞綿羊紅細胞EA-花環(huán)花環(huán)EAC-花環(huán)花環(huán) 第三節(jié)第三節(jié) 免疫細胞功能測定免疫細胞功能測定一、轉化、增殖試驗二、細胞毒試驗三、抗體形成試驗四、細胞吞噬與殺傷試驗1、淋巴細胞轉化試驗2、混合淋巴細胞培養(yǎng)轉化、增殖試驗轉化、增殖試驗放射性測定3H-TdR絲裂原（抗原）刺激淋淋巴巴細細胞胞轉轉化化試試驗驗原原理理示示意意1、T細胞介導的細胞毒試驗2、NK活性測定3、ADCC作用測定細胞毒檢測試驗細胞毒檢測試

5、驗放射性測定細細胞胞毒毒試試驗驗原原理理示示意意靶細胞效應細胞分離上清1、直接溶血空斑試驗2、間接溶血空斑試驗3、SPA-SRBC溶血空斑試驗抗體形成試驗抗體形成試驗直接溶血空斑試驗直接溶血空斑試驗間接溶血空斑試驗間接溶血空斑試驗SPA-SRBC溶血空斑試驗溶血空斑試驗1、細胞吞噬功能試驗2、細胞殺菌功能試驗細胞吞噬與殺傷功能試驗細胞吞噬與殺傷功能試驗吞噬百分率 =吞有顆粒的吞噬細胞數(shù)計數(shù)的吞噬細胞數(shù)吞噬指數(shù) =吞噬細胞吞噬的總顆粒數(shù)計數(shù)的吞噬細胞數(shù)NBT還原試驗還原試驗原理：N-N-C + H+N=N-R-N-NH2C N=NH四氮唑基（淡黃色）甲月簪基（紫黑色）NBT還原試驗還原試驗方法：

6、1、抗凝血 + 硝基藍四氮唑（NBT），37。C孵育25min。2、推片染色、鏡檢。正常值：NBT陽性細胞 7.5-15% 第四節(jié)第四節(jié) 免疫細胞凋亡測定免疫細胞凋亡測定一、細胞凋亡的概念與原理二、細胞凋亡的檢測方法 細胞凋亡的概念與原理細胞凋亡的概念與原理1、細胞凋亡的概念2、細胞凋亡的原理3、細胞凋亡的特點 細胞凋亡細胞凋亡（apoptosisapoptosis） 細胞在內源性基因調控下發(fā)生的主動死亡過程，也稱程序性死亡。 細胞凋亡的過程細胞凋亡的過程凋亡信號凋亡受體信號傳導凋亡基因啟動編碼程序性死亡蛋白細胞結構解體細胞凋亡 細胞凋亡機制細胞凋亡機制 細胞凋亡的特點細胞凋亡的特點1、細胞皺

7、縮2、染色質邊集3、凋亡小體出現(xiàn) 細胞凋亡細胞凋亡 細胞凋亡的檢測方法細胞凋亡的檢測方法1、形態(tài)觀察法2、生化檢測法3、流式細胞儀檢測法形態(tài)觀察法形態(tài)觀察法普通光鏡檢測HE染色 甲基綠-派諾寧染色熒光顯微鏡檢測溴化丙錠染色透射電鏡檢測典型形態(tài)改變生化檢測法生化檢測法凝膠電泳法原位末端標記法二苯胺分光光度法凝膠電泳法凝膠電泳法原理：斷裂DNA在凝膠中呈梯形排列 （DNA ladder）方法：提取總DNA DNA凝膠電泳 觀察DNA ladder現(xiàn)象原位末端標記法（原位末端標記法（TUNEL）原理：利用標記的dUTP，在TdT作用 下結合DNA斷片的3末端羥基， 顯示斷鏈DNA，提示凋亡方法：制備組織切片 標記物結合 標記物顯色 鏡檢二苯胺分光光度法二苯胺分光光度法原理：細胞凋亡可產(chǎn)生低分子量DNA，通過超速離心可與細胞核的高分子量DNA分離，分別測定兩種DNA，即可得出凋亡百分率。方法：裂解細胞 13000g超速離心 分別提取DNA 使DNA顯色，測定凋亡百分率 =上清液OD值上清液OD值+沉淀OD值流式細胞儀法流式細胞儀法原理：PI標記凋亡細胞，通過FACS可