第六章化學(xué)檢測

1、第六章 化學(xué)檢測n根據(jù)物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)而對物質(zhì)進(jìn)行定量、定性測定。n應(yīng)用最早、最廣泛的檢測技術(shù)n簡便、快速、操作容易一 糖類的化學(xué)檢測n糖類包括多糖、雙糖、單糖n單糖和某些雙糖具有游離羰基還原糖n多糖和蔗糖等無還原性非還原糖n糖類化學(xué)檢測主要是利用游離羰基的還原性質(zhì)，與試劑（氧化劑）進(jìn)行氧化還原反應(yīng)而進(jìn)行測定的。n非還原糖必須轉(zhuǎn)化為還原糖再進(jìn)行測定n最常用的試劑：斐林（fehling）試劑n基本組成：a：cuso4溶液 b: naoh和酒石酸鉀鈉溶液 使用時(shí)a、b等體積混合(生成酒石酸鉀鈉銅）n酒石酸鉀鈉銅是氧化劑，可與還原糖的游離羰基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，而進(jìn)行糖的測定。定糖常用方法n1 蘭愛農(nóng)（

2、lane-eynon）法n次甲基藍(lán)（亞甲基藍(lán)、四甲基藍(lán)）法、置換法、直接滴定法n反應(yīng)終點(diǎn)用次甲基藍(lán)指示劑顯示（還原糖滴定斐林試劑，由于次甲基藍(lán)氧化能力比二價(jià)銅弱，待二價(jià)銅全部還原后，過量1d還原糖使次甲基藍(lán)還原，藍(lán)色消失）n多糖或其他非還原糖需轉(zhuǎn)化為還原糖后再滴定 如淀粉，可用酸解或酶解操作要點(diǎn)n（1 ）斐林試劑的標(biāo)定n（a）標(biāo)定預(yù)備試驗(yàn) a、b各5ml10ml水（250ml三角瓶中）搖勻，加熱至沸騰，2d1次甲基藍(lán)溶液，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液滴定至藍(lán)色消失，耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液（0.1或0.2）v1ml。n（b）標(biāo)定na、b各5ml10ml水（250ml三角瓶中）搖勻，從滴定管中預(yù)先加入（v1-1)ml標(biāo)

3、準(zhǔn)葡萄糖液，搖勻后加熱加熱至沸騰，2d1次甲基藍(lán)溶液，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液滴定至藍(lán)色消失（滴定在1min內(nèi)完成），記錄消耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液的總毫升數(shù)v0n(2) 定糖n（a）定糖預(yù)備試驗(yàn)na、b各5ml10ml樣品糖液（250ml三角瓶中）搖勻，加熱至沸騰，2d1次甲基藍(lán)溶液，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液滴定至藍(lán)色消失，耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液（0.1或0.2）v2ml。n（b）定糖na、b各5ml10ml樣品糖液（250ml三角瓶中）搖勻，補(bǔ)加（v0-v2）ml水，并從滴定管中預(yù)先加入（v2-1)ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液，搖勻后加熱加熱至沸騰，2d1次甲基藍(lán)溶液，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液滴定至藍(lán)色消失（滴定在1min內(nèi)完成），記錄消耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄

4、糖液的總毫升數(shù)vn(3) 計(jì)算n還原糖含量（以葡萄糖計(jì)） （v0-v) c (1/10 )nn注意：n（a）ab分開儲存，防止cu+變化，臨用混合n（b）單標(biāo)移液管吸液準(zhǔn)確，外壁也需擦干凈n（c）體積需控制在一定范圍內(nèi)，對ph有影響n（d）煮沸時(shí)間要一致n（e）注意指示劑加入時(shí)間和加入量一致n（f）滴定速度一致（后滴定0.51ml，1min內(nèi)完成）n（g）產(chǎn)物cu2o不穩(wěn)定，次甲基藍(lán)變色也不穩(wěn)定，暴露于空氣或沸騰顏色變化，滴定過程不能搖動，不可中途中止加熱 n斐林試劑快速法：斐林試劑快速法：n在斐林試劑中加入亞鐵氰化鉀（黃血鹽）反應(yīng)終點(diǎn)為藍(lán)色消失，淡黃色出現(xiàn)。反應(yīng)終點(diǎn)比蘭愛農(nóng)法更為明顯。2 碘

5、量法ni2 naio(氧化劑），其氧化能力較弱，僅適用于醛糖的測定，與酮糖不起反應(yīng)n操作要點(diǎn)：n（1）標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉溶液配制，0.05 mol/l，沸騰后冷卻水配制，存放在棕色瓶中，一周后用標(biāo)準(zhǔn)重鉻酸鉀標(biāo)定。n（2）標(biāo)準(zhǔn)碘液配制，0.1mol/ln（3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸鈉滴定試劑中全部碘n碘量瓶中，10ml0.1mol/l碘液15ml0.1 mol/lnaoh5ml空白液，搖勻后暗反應(yīng)15min1ml1mol/l硫酸溶液，用0.05mol/l硫代硫酸鈉滴定至淺黃色，加0.2ml0.5淀粉液作指示劑，滴定至藍(lán)色消失，記錄v0n(4)樣品滴定：以5ml樣品液代替空白液， v1n(5)

6、計(jì)算：n醛糖含量 （v0 v1）c m nn注意：暗反應(yīng)后需酸化再滴定，滴定時(shí)開始輕搖（碘揮發(fā)），后再搖（淀粉吸附碘）n配合次甲基藍(lán)法測定某些糖含量（如果糖）配合次甲基藍(lán)法測定某些糖含量（如果糖）3 銅試劑法n將還原糖與二價(jià)銅離子反應(yīng)生成的cu2o用碘氧化，再用硫代硫酸鈉滴定反應(yīng)液中剩余的碘而測定樣品還原糖的含量。n（1）銅試劑的配制 主要提供二價(jià)銅離子及碘n（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作n（a)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液的配制 0.1%或0.05（根據(jù)所用銅離子試劑定）n（b)三角瓶編號 1 2 3 4 5 6 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（ml ) 0 1 2 3 4 5 蒸餾水（ml ) 5 4 3 2 1 0 銅試劑（ml

7、) 5 5 5 5 5 5 沸水浴10min，冷卻至室溫n（c)各加入0.5mol/l硫酸5ml，振蕩，待紅色cu2o完全溶解后，用硫代硫酸鈉滴定至終點(diǎn)，記錄耗用量vn(d) 繪標(biāo)準(zhǔn)曲線n葡萄糖含量（mg）為縱坐標(biāo)，（v0-v)為橫坐標(biāo)二 蛋白質(zhì)和氨基酸的化學(xué)檢測n蛋白質(zhì)含氮量幾乎恒定，平均16n測出n含量6.25，即為蛋白質(zhì)量n 含氮量 每gn相當(dāng)p肉、蛋、豆 16 6.25n面粉 17.6 5.70n奶品 15.7 6.38n花生 18.2 5.50n鮭精蛋白 31.5 3.17蛋白質(zhì)常用檢測方法1 定氮法（經(jīng)典的，仲裁的）常用凱氏定氮法或微量凱氏定氮法（1）原理消化、蒸餾、吸收、滴定計(jì)算

8、（2）操作要點(diǎn) (a) 消化：凱氏定氮瓶，樣品k2so4-cuso4、濃h2so4, 通風(fēng)廚內(nèi)進(jìn)行，消化液全部移入100ml容量瓶定容。n(b)蒸餾：防止漏氣n(c)吸收：5ml2h3bo3甲基紅溴甲酚綠幾滴或一定量標(biāo)準(zhǔn)酸溶液（如25ml 0.05mol/l h2so4)n(d)滴定計(jì)算： h3bo3吸收：0.01mol/lhcl滴定至綠色 淡紫紅色 樣品中的總氮量（mg)=（a-b)c14n 標(biāo)準(zhǔn)硫酸接收：0.1mol/l標(biāo)準(zhǔn)naoh滴定，甲基紅黃色終點(diǎn) 樣品中總氮量=（c1v1-c2v2) 14nn粗蛋白含量樣品的總氮量粗蛋白含量樣品的總氮量6.252 雙縮脲試劑法測定蛋白質(zhì)n縮脲cuso

9、4、naoh 紫紅色化合物na c縮脲n蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上脲鍵，有雙縮脲反應(yīng)n蛋白質(zhì)（多肽） cuso4 （ naoh） 銅鈉雙縮脲絡(luò)合物na cp，與蛋白質(zhì)的分子量和氨基酸組成無關(guān)ntris緩沖液干擾p的測定，測定范圍110 mg/mln操作：n（1）雙縮脲試劑的配制 cuso4、酒石酸鉀鈉、naoh、0.1%kin (2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸餾水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0雙縮脲試劑 (ml) 4 4 4 4 4 4室溫反應(yīng)30min測a540n (3)樣品測定 1ml4ml雙縮脲試劑 ，30min，測a

10、5403 福林酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量n雙縮脲法的發(fā)展，靈敏100倍，需時(shí)較長，對雙縮脲反應(yīng)有干擾的物質(zhì)對其影響更大，酚類和檸檬酸也有干擾。n堿性銅試劑雙縮脲反應(yīng)n稀釋的苯酚試劑與酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸反應(yīng)呈藍(lán)色n兩種呈色反應(yīng)可疊加n操作：n（1）福林酚試劑的配制n甲液：堿性銅試劑（a、naoh、naco3, b、cuso4和酒石酸鉀鈉)n乙液：稀釋的苯酚試劑n（2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液配制n結(jié)晶牛血清蛋白溶于0.9nacl或用酪蛋白（凱氏定氮法測定含量）n（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作n（4）樣品測定n1ml樣品（含p15500 g）5ml甲液，室溫10min，乙液0.5ml，混勻，室溫30min，測a50

11、0750蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)檢測n概念：免疫化學(xué)檢測、抗體、抗原、凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)n檢測方法：n（1）凝集反應(yīng)n效價(jià)測定，細(xì)菌、病毒分類n（2）沉淀反應(yīng)n沉淀反應(yīng)、界面（環(huán)狀）試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散、免疫電泳、免疫親和層析、免疫熒光檢測等氨基酸含量測定方法n1 茚三酮顯色法n微酸性條件下，氨基酸茚三酮反應(yīng)生成紫色化合物，亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）茚三酮反應(yīng)生成黃色化合物n取1ml樣品溶液（含氨基酸0.150ug)加1ml緩沖液（ph5.06.7），再加1ml茚三酮顯色液，100 水浴15min，自來水冷卻后，加入3ml60乙醇溶液，測定od570，脯氨酸或羥脯氨酸測od4402 甲醛滴定法測定氨基酸n

12、氨基酸是兩性電解質(zhì)，不能用一般酸堿指示劑通過氫氧化鈉來測定。n加進(jìn)甲醛生成羥甲基衍生物，可以用堿滴定。n注意：需用過量中性甲醛。三 核酸的化學(xué)檢測n根據(jù)核酸所含的磷及戊糖的化學(xué)性質(zhì)，可用定磷法、二苯胺法和地衣酚法等進(jìn)行檢測。n1 定磷法測定核酸含量n（1）核酸的消化n（2）磷的測定 定磷試劑，45 水浴25min，冷卻至室溫測od650 無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)液作標(biāo)準(zhǔn)曲線n（3）核酸含量的計(jì)算一般dna含磷9.5,rna含磷9.2，rna量（總磷量無機(jī)磷量）10.9dna量 （總磷量無機(jī)磷量）10.52 二苯胺法測定dna含量ndna中的2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，在595nm處有最大吸收峰。在40400 g范圍內(nèi)，od595與dna濃度成正比。少量乙醛可提高反應(yīng)靈敏度。n（1）二苯胺試劑的配制n（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作n（3）樣品dna含量測定3 地衣酚法測定rna含量n核糖核酸在濃鹽酸和三氯化鐵的存在下，與3，5二羥甲苯（地衣酚）反應(yīng)，生成綠色物質(zhì)。一定濃度范圍內(nèi)，od670與rna濃度成正比。所有戊糖均可進(jìn)行此反應(yīng)，注意干擾（如dna）。n操作： 地衣酚試劑配制；標(biāo)準(zhǔn)曲線制作；樣品rna測定