微生物來源活性多糖探究進展

1、微生物來源活性多糖探究進展【關(guān)鍵詞】；多糖；，微生物；，藥用；，生物活 性 摘要： 活性多糖是新藥研發(fā)中的一個熱點，其中研 究相對較多的是來源于微生物的多糖。近年來，關(guān)于微生物 多糖的研究有了進一步的發(fā)展，本文對藥用微生物多糖在生 物活性、作用機制和構(gòu)效關(guān)系等各方面的最新研究進展進行 了綜述。 關(guān)鍵詞： 多糖； 微生物； 藥用； 生物 活 性 advances in the research of active polysaccharides derived from microbes abstract over the past few years, many advances have b

2、een made toward research on active polysaccharides especially microbial polysaccharides, it becomes a hot spot in new drug research and development this review will focus on recent studies that illustrate the biological activities, mechanisms of action and strueturefunction relationships of microbia

3、l polysaccharides for drug use key words polysaccharide ； microorganism ； drug use ； biological activities 多糖廣泛分布于高 等植物、地衣、海藻、動物和微生物中。微生物來源的多糖 是至今研究得比較詳細的一類多糖，其廣泛的生物活性使得其已成為微生物藥物一個重要的組成部分，且在新藥研發(fā)中 越來越受到重視。本文對迄今為止所發(fā)現(xiàn)的微生物多糖的藥 用生物活性進行了綜述，并總結(jié)了近年來關(guān)于多糖構(gòu)效關(guān)系 和作用機理方面的研究成果。1免疫調(diào)節(jié)功能 免疫調(diào)節(jié)劑在疾病治療中的作用越來越受到重視。多糖免疫調(diào) 節(jié)

4、劑于40余年前被首次發(fā)現(xiàn)，近二十年來，有更多微生物 來源的多糖被確認對機體免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)有著極為重要的 意義。這些多糖的免疫調(diào)節(jié)作用涉及到免疫系統(tǒng)的各個方 面，對于其免疫調(diào)節(jié)機制的研究也體現(xiàn)在各個層次上，對這 些多糖分子決定它們與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的結(jié)構(gòu)特征 也已經(jīng)進行了更為深入的研究。以下對幾種比較典型的免疫 調(diào)節(jié)劑分別進行介紹。1.1兩性離子多糖；兩性離子多糖(zwitterionic polysaccharides, zps)是有同時含有 陽離子和陰離子結(jié)構(gòu)以實現(xiàn)其生物功能的一類多糖。多糖 a(ps a)是zps的分類原型。ps a是從革蘭陰性厭氧菌脆弱 擬桿菌中分離得到的兩種莢膜多糖

5、中的一種。zps在菌體表 面組裝成莢膜多糖復(fù)合物(cpc) o早期研究證明，cpc能調(diào)節(jié) 腹腔內(nèi)膿毒癥伴隨性膿腫的形成11 cpc的腹膜內(nèi)給藥能 誘導(dǎo)膿腫形成，而皮下和肌肉的預(yù)防性給藥則能防止宿主在 細菌感染后形成膿腫。一方面，在誘導(dǎo)膿腫形成過程中，zps 扮演了多重角色，它能誘導(dǎo)細菌在腹腔間皮表面的粘附，并 能刺激某些促免疫細胞因子和化學(xué)增活素，進而誘導(dǎo)宿主細 胞cams的表達，完成腹腔內(nèi)多形核白細胞的募集。另一方 面，zps預(yù)防膿腫形成、保護機體免于免疫反應(yīng)的作用，并 非是作為一種經(jīng)典的免疫原去介導(dǎo)特異性的免疫反應(yīng)，而是 對宿主的免疫系統(tǒng)進行調(diào)節(jié)，從而對導(dǎo)致膿腫形成的免疫反 應(yīng)實現(xiàn)全面抑制

6、。其具體機制是zps對cd4+t細胞活性和il2 生成的調(diào)節(jié)2,而il2似乎是zps調(diào)節(jié)機體免疫以預(yù)防膿 腫的中心環(huán)節(jié)3。對于其構(gòu)效關(guān)系的研究表明，zps同時 含有陰陽電荷基團的重復(fù)單元是其免疫調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵性 結(jié)構(gòu)，破壞多糖的電荷結(jié)構(gòu)能使其活性顯著降低4。1.23 (13)葡聚糖從酵母和真菌中純化得到的b (13)葡聚糖是另一類免疫調(diào)節(jié)劑。沿著b (13)葡聚糖主鏈隨機分布著 b (16)葡聚糖基支鏈。w訂liams等證明b (13)葡聚糖能顯 著增加動物體內(nèi)嗜中性粒細胞水平并增加骨髓細胞的增殖。 pgg是w訂liams研究組經(jīng)高度純化已獲專利的一種b (13) 葡聚糖。pgg給藥后，嗜中性

7、和嗜酸性粒細胞的比例增加， 從給藥小鼠體內(nèi)得到的嗜中性粒細胞，在體外對大腸埃希菌 的吞噬作用增加5；巨噬細胞的形態(tài)發(fā)生改變，巨噬細胞 同時表現(xiàn)出磷酸酶活性增加和脂多糖(lps)刺激的no生成的 特征6。研究表明，b (13)葡聚糖能調(diào)節(jié)淋巴細胞和單核 細胞中促免疫細胞因子的產(chǎn)生7。b (13)葡聚糖對nfkb 樣和nfil6樣轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)作用具有時間和濃度依賴性8。其所涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與超抗原lps不同。pgg用 于預(yù)防治療也獲得了肯定的實驗結(jié)果。能顯著降低腹腔內(nèi)膿 毒癥的致死率。williams在膿毒癥小鼠模型試驗中研究了(13)葡聚糖對轉(zhuǎn)錄激活、細胞因子表達的影響，發(fā)現(xiàn)與對 照動物相比

8、，nfkb和nfil6的核結(jié)合活性降低，tnfa和 il6的mrna水平也有所下降。轉(zhuǎn)錄因子活性和細胞因子表達 的下調(diào)和敗血癥動物的存活率升高是正相關(guān)10。b (13) 葡聚糖的免疫調(diào)節(jié)生物活性基于它們與巨噬細胞和多形核 中性粒細胞(pmns)的直接作用。muller等的工作表明，磷酸 葡聚糖，一種水溶性的(13) 3d葡聚糖，能夠與人或鼠的單 核/巨噬細胞結(jié)合。這種結(jié)合特異地導(dǎo)致了外來細菌的內(nèi)在 化和增加的胞漿空泡化11。b (13)葡聚糖的免疫調(diào)節(jié)還 涉及到補體途徑。補體受體3(cr3)也已經(jīng)被確認是某些葡聚 糖的受體12。cr3介導(dǎo)的吞噬作用和脫顆粒作用需要cr3 結(jié)構(gòu)域上一個ic3b結(jié)

9、合位點和一個葡聚糖結(jié)合位點同時與 配基的結(jié)合。用抗pgg葡聚糖受體的單克隆抗體對中性白細 胞處理，可以抑制nfkb樣因子的激活13。將酵母菌株 煮沸和酶處理得到可溶和不可溶的葡聚糖粗品。不可溶的葡 聚糖可通過磷酸化、硫酸化和氨基化等方式進行衍生化修飾 以提高其溶解性。可溶性葡聚糖在水溶液中主要以線形的三 螺旋結(jié)構(gòu)存在。研究表明，糖鏈的螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)象是其生物活 性存在的必要條件，而糖鏈中的親水性基團(多釋基)應(yīng)位于 螺旋體的表面14。微粒酵母葡聚糖的免疫調(diào)節(jié)活性還受其分子量和b (16)糖昔鍵數(shù)目的影響。同樣的情況也發(fā)生在 其他的一些b (13)d葡聚糖上，如真菌多糖pestalotan等。 另外

10、，支鏈長度也會影響多糖的活性。從真菌 phytophthoraparasitica中分離得到的活性b (13)d葡聚 糖，其具有葡聚三糖支鏈的組份，活性大大高于具有葡聚二 糖支鏈的組分16。1.3甘露聚糖從白念珠菌中分離得到了有一定免疫調(diào)節(jié)活性的甘露聚糖。巨噬細胞遞呈的甘 露糖結(jié)合凝集素(mbl)能與甘露聚糖結(jié)合，并通過一種非自 身識別機制激活宿主免疫系統(tǒng)。甘露聚糖包裹感染性抗原并 介導(dǎo)了內(nèi)吞和吞噬作用，甘露聚糖受體識別多糖里的一個重 復(fù)單位，這種識別導(dǎo)致了細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞因子產(chǎn)生和補 體的激活。研究表明，白念珠菌甘露聚糖在皮下注射給藥后 對宿主的免疫抑制作用與用藥后遲發(fā)型超敏反應(yīng)被抑制有

11、關(guān)17。il4是介導(dǎo)甘露聚糖特異性誘導(dǎo)免疫下調(diào)的關(guān)鍵性 細胞因子。另外也有研究表明，il12p40. il10和ifny對 cd+t細胞(下調(diào)效應(yīng)細胞)的產(chǎn)生也有一定作用18。1.4蛋白結(jié)合多糖從真菌蘑菇中分離得到了蛋白結(jié)合多糖 psk和pspo這些化合物在結(jié)構(gòu)上比較相近，分子量約為 lookda 19o其單糖間以a (14)和b (13)糖昔鍵連接，蛋 白部分則以天門冬氨酸和谷氨酸為主，蛋白含量約為15%o 這類多糖能夠抑制體外腫瘤細胞系的生長并具有體內(nèi)的抗 腫瘤活性。對食道癌、胃癌、肺癌、卵巢癌和子宮頸癌等有肯定的防治效果。這類多糖的免疫調(diào)節(jié)作用機制尚不清楚。 有研究表明，小鼠在psk給藥

12、處理后，psk能結(jié)合并抑制免 疫抑制細胞因子tgfb 20。psk還能夠激活嗜中性粒細胞, 這些可能是psk抗癌活性的部分原因。psk和psp是生物反 應(yīng)調(diào)節(jié)劑，能刺激t細胞的激活和誘導(dǎo)ifny和il2的生成。 也有研究發(fā)現(xiàn)psk和psp能增強小鼠體內(nèi)的超氧化物歧化酶 (s0d)的活性21。1.5透明質(zhì)酸透明質(zhì)酸(ha)可以由鏈球菌產(chǎn)生，同時也是組成哺乳動物組織胞外基質(zhì)的一種 主要的糖類成分，在皮膚、關(guān)節(jié)、眼和大多數(shù)其它的器官和 組織中都有存在。透明質(zhì)酸是一個二糖的重復(fù)。該二糖是一 種最簡單的陰離子氨基葡聚糖。透明質(zhì)酸是通過與真核細胞 cd44受體的結(jié)合來完成對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。這種配體受

13、體間的相互作用對于t細胞胞間通信和白細胞外滲的調(diào)節(jié)是 至關(guān)重要的22。低分子量ha則可被用于阻斷t淋巴細胞 cd44和真核細胞來源ha之間的相互作用。這在臨床上可被 用于防止同種異體移植的排斥反應(yīng)以保護機體器官的功能。 另外，ha能促使創(chuàng)傷愈合，并能在眼睛和關(guān)節(jié)外科中被用作 人體ha的替代品9。2抗腫瘤活性微生物 多糖的抗腫瘤活性多與其免疫調(diào)節(jié)功能密切相關(guān)。多糖能激活免 疫細胞，并誘導(dǎo)多種免疫細胞因子和細胞因子受體基因的表 達，增強機體的抗腫瘤免疫力。從擔(dān)子菌門真菌中得到的香 菇多糖、裂褶多糖、云芝多糖、茯苓多糖等抗腫瘤多糖，在 國內(nèi)外臨床上已普遍應(yīng)用，都具有上述免疫調(diào)節(jié)劑的特征結(jié) 構(gòu)。從香菇

14、子實體和深層發(fā)酵菌絲體中得到的兩種具抗腫瘤 活性的多糖分別為b (13)葡聚糖和含少量肽的a甘露糖。 云芝多糖psk則具有蛋白結(jié)合多糖結(jié)構(gòu)。裂褶多糖和茯苓多 糖也是b (13)葡聚糖，但當茯苓多糖含有b (16)葡聚糖側(cè) 鏈時沒有活性，而用高碘酸鹽氧化反應(yīng)將側(cè)鏈除去后，卻表 現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性。免疫調(diào)節(jié)多糖的抗腫瘤作用需要宿 主免疫系統(tǒng)的參與，但有些微生物多糖在體外也表現(xiàn)出對腫 瘤細胞生長的抑制作用。除了免疫調(diào)節(jié)外，近年來對多糖抗 腫瘤活性的其它作用機制也有所研究。主要有以下幾個方面23： (1)影響細胞的生化代謝：茯苓多糖對肉瘤s180細 胞的增殖有抑制作用，可導(dǎo)致s180細胞膜唾液酸(s

15、a)含量 增加，而膜磷脂、花生四烯酸和豆蔻酸的含量下降，細胞膜 的pi轉(zhuǎn)換被顯著抑制，影響了腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和相關(guān)抗原的 表達。香菇、豬苓、茯苓多糖能抑制人早幼粒細胞白血病hl60 細胞酪氨酸蛋白激酶(tpk)的活性，激活磷酸酪氨酸蛋白磷 酸酶(ptpp),可降低細胞酪氨酸蛋白的磷酸化程度；(2)影 響細胞周期：某些多糖可能作用于腫瘤細胞的細胞周期。 kamei等將云芝多糖與結(jié)腸癌細胞ags 起培養(yǎng)4d后，腫瘤 細胞的數(shù)量比對照組明顯減少，流式細胞術(shù)檢測表明，腫瘤 細胞的生長被阻滯于s期和g2/m期15。(3)抗氧化作用： 機體內(nèi)過量的超氧化自由基和脂質(zhì)過氧化物(lpo)對dna的持續(xù)損傷，會導(dǎo)致

16、細胞的癌變。動物和臨床試驗表明云芝多 糖psk能增強超氧化物歧化酶(sod)的活性，緩解腫瘤宿主 體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。kariya等在聯(lián)氨氧化反應(yīng)體系中觀察 到云芝多糖有自由基清除劑作用，并通過電子自旋共振檢 測，證明其有擬sod的作用。又有報道云芝多糖能增強正常 小鼠和正常遲發(fā)型超敏感性(dh)小鼠淋巴細胞、脾及胸腺中 sod的活力，而對腫瘤組織中sod則有明顯的抑制作用。 其它：香菇、云芝和靈芝等多糖均能抑制鼠肝細胞對致癌物 苯并捉的吸收。香菇多糖能使腫瘤部位的血管擴張和出血， 造成腫瘤組織壞死。有些微生物來源的多糖與腫瘤細胞表面 的糖類分子很相似，能抑制腫瘤細胞的粘附，從而抑制了腫 瘤細

17、胞的侵襲與轉(zhuǎn)移24。3抗病毒活性 多糖的抗病毒作用已引起醫(yī)藥界的高度重視。尤其在抗hiv方面， 硫酸酯化多糖因為其活性明確，已成為近年來的研究熱點 26。研究表明，其作用機制除了多糖的免疫激活作用外, 該類聚合物可以通過阻斷hiv病毒gpl20與宿主細胞cd4受 體的結(jié)合而發(fā)揮作用，這可以阻斷病毒對宿主細胞的吸附， 防止合細胞的形成25。某些硫酸多糖還能夠抑制hiv逆 轉(zhuǎn)錄酶活性，硫酸化側(cè)鏈與rna模板引物上的某些酶有相同 的結(jié)合位點，從而產(chǎn)生競爭性抑制作用。最近的研究又發(fā)現(xiàn), 硫酸多糖與hiv1反式激活因子tat的結(jié)合能阻止tat蛋白 進入胞內(nèi)，使hivltr的轉(zhuǎn)錄激活受到抑制，從而抑制了

18、hiv1 的復(fù)制和整合。硫酸多糖的抗病毒活性首先源于其聚陰離子 特性，因此硫酸基團是該類多糖活性的必要條件。分子中硫 酸基團的含量越高，其抗hiv的作用越強。但硫酸根過多會 產(chǎn)生抗凝血等不良反應(yīng)27。硫酸基團分布的空間構(gòu)象對 抗病毒活性也有影響，如tat蛋白與肝素的結(jié)合要求至少有 20、60和n位置的硫酸化28。糖鏈柔性的降低能升高硫 酸多糖的抗病毒活性。分子大小是多糖抗病毒活性的另一個 影響因素。硫酸葡聚糖抗hiv的活性隨著相對分子質(zhì)量的增 加而增加，相對分子質(zhì)量在1x1045x105的范圍內(nèi)能保 持最大活性。除了抗hiv外，多糖對其他類型病毒也有抑制 作用,如單純皰疹病毒(herpes s

19、implex virus, hsv1, hsv2)、 巨細胞病毒(cytomegalovirus, cmv)、流感病毒(influenza virus)、囊狀胃炎病毒(vesicular stomatitis virus, vsv) 等29。香菇多糖具有抗腫瘤作用，硫酸酯化后則具有顯 著的抗艾滋病作用，在濃度為100mg/l時能完全抑制rt活 性，10100mg/l時能抑制合體細胞的形成,10mg/l時能強 烈抑制hiv抗原的合成，并能保護被hiv感染的mt4細胞。 但硫酸酯化后的多糖卻失去了原有的抗腫瘤活性。由此推測 硫酸酯化多糖和非硫酸化多糖的免疫調(diào)節(jié)作用機制是不同 的。通過13cnmr.

20、苯胺藍熒光法及粘度法測定證明，硫酸基 團的引入造成多糖理化性質(zhì)及其空間立體構(gòu)象的變化，而這 正是多糖活性的決定因素。 4其它活性 多糖的免 疫調(diào)節(jié)功能使其在臨床上具有抗感染和抗炎活性。免疫調(diào)節(jié) 劑的使用相對于常規(guī)藥物治療具有其獨特的優(yōu)點。對宿主免 疫系統(tǒng)的先天抗感染能力的增強可能會有效地解決抗生素 耐藥的問題。吳倩等應(yīng)用重組siliri為靶點建立抑制劑篩 選模型，從鏈霉菌的代謝產(chǎn)物中得到il1的拮抗劑139a,動 物模型的研究表明它們具有抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用30。 對139a生物合成中引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆和鑒定工作 也已經(jīng)完成31。對中藥植物多糖降血糖活性的研究較為 普遍，近年來，從微生

21、物中也發(fā)現(xiàn)了一些有明顯降血糖作用 的多糖。從cordyccps sinensis中提取得到的多糖csf10 能增強葡萄糖激酶活性，加速葡萄糖的代謝；并可以降低 glut2蛋白水平從而抑制肝臟葡萄糖的輸出，最終達到降低 血糖的目的32。另外，發(fā)現(xiàn)某些微生物來源多糖（如銀耳 多糖）和一些多糖的硫酸化衍生物，具有肝素樣抗凝血作用, 其抗凝活性與多糖分子量和硫酸化程度相關(guān)；木耳多糖、銀 耳多糖等對血栓的形成有抑制作用，這可能與它們降低血栓 纖維蛋白原含量，降低血小板數(shù)目及其粘附力的能力有關(guān)； 香菇多糖可促進膽固醇代謝而降低血清膽固醇含量，從而達 到降血脂的目的；靈芝多糖能抑制人嗜中性粒細胞自發(fā)和 fa

22、s介導(dǎo)的細胞凋亡，這與抗衰老活性相關(guān)；靈芝中的一種 小分子多糖能增加蛋白和核酸的合成；而某些微生物多糖對 rnase有抑制作用，可減少rna降解，對rna治療可起到協(xié)同作用。5結(jié)語 多糖類藥物具有多效性、低毒性、來 源廣泛、天然綠色等優(yōu)點，多糖與現(xiàn)有藥物的聯(lián)合用藥可以 提高藥物的作用范圍和效力，減少用藥量，并可防止或推遲 耐藥的出現(xiàn)。但由于多糖結(jié)構(gòu)太復(fù)雜，所以不易控制其質(zhì)量 標準，結(jié)構(gòu)測定及合成難度較大；缺乏明確的作用機制研究; 而有些多糖在天然產(chǎn)物中含量很低且不易分離得到。這使它 們在臨床上的應(yīng)用受到限制。近年來，隨著結(jié)構(gòu)分析技術(shù)的 進步和作用機制研究的不斷積累和深入，人們對多糖如何作 用于

23、細胞因子網(wǎng)絡(luò)、協(xié)調(diào)生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)特征有了更多的 了解，發(fā)現(xiàn)了一些多糖的特異受體，為新活性化合物的開發(fā) 提供了基礎(chǔ)。對于多糖構(gòu)效關(guān)系的認識也更為豐富，為提高 活性而進行的結(jié)構(gòu)改造工作也有很大進展。多糖的結(jié)構(gòu)研究 是多糖研究中亟待解決的薄弱環(huán)節(jié)。在確保多糖純度的前提 下，現(xiàn)有二維核磁技術(shù)的結(jié)合（如:cosy譜、noesy譜、hohaha 譜、tocsy譜等）使我們有可能推導(dǎo)出部分多糖完整的一級結(jié) 構(gòu)33。而質(zhì)譜由于其高度的靈敏性，在多糖尤其是極少 量多糖的結(jié)構(gòu)分析中，也發(fā)揮了越來越重要的作用，fabms 和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已越來越廣泛地用于多糖的結(jié)構(gòu)分析中。多 糖的高級結(jié)構(gòu)分析也有所發(fā)展，但還無法做

24、到像核酸和蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu)測定那樣自動化、微量化和標準化。關(guān)于藥用微生物 多糖生物合成的研究也逐漸開展起來。對這些微生物菌株進 行的多糖合成基因分析發(fā)現(xiàn)有共同的操作子結(jié)構(gòu)，暗示了這 些多糖的生物合成擁有相同的分子機制。對于多糖合成基因 簇及其生物合成途徑更深入的了解，能為進一步的組合生物 學(xué)研究，以及最終獲得新結(jié)構(gòu)多糖、改變天然多糖理化性質(zhì)、 提高多糖的活性和產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)。 參考文獻 1 kasper d l, onderdonk a b, crabb j, et al.protective efficacy of immunization with capsular antigen agai

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