動物生物反應(yīng)器

1、動物乳腺生物反應(yīng)器的現(xiàn)狀和趨勢學(xué)院：化工學(xué)院班級：生物2012姓名：韓沛志學(xué)號：120123302042動物乳腺生物反應(yīng)器的現(xiàn)狀和趨勢韓沛志（遼寧科技大學(xué)化工學(xué)院生物工程，遼寧鞍山 114051）【摘要】動物乳腺生物反應(yīng)器技術(shù)是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用，于上世紀(jì)80年代提出，其目的是利用動物乳腺產(chǎn)生目的蛋白。利用該技術(shù)生產(chǎn)的蛋白具有低成本，高活性，易提取純化的優(yōu)點。雖然該技術(shù)尚處于發(fā)展時期，但具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大地商業(yè)潛力，是許多公司大力發(fā)展的對象。文章綜述了轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器的原理、制備技術(shù)及應(yīng)用、優(yōu)點、國內(nèi)外研究進(jìn)展及存在問題，并對其發(fā)展方向進(jìn)行了展望。【關(guān)鍵詞】 轉(zhuǎn)基因動物，乳腺，生物

2、反應(yīng)器乳腺生物反應(yīng)器是基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺，將外源基因?qū)藙游锘蚪M中并定位表達(dá)于動物乳腺，利用動物乳腺能夠天然、高效合成并分泌蛋白質(zhì)的能力，在動物的乳汁中生產(chǎn)一些具有重要價值的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動物的總稱。1987年美國科學(xué)家Gordon等人首次在小鼠的乳汁中表達(dá)出人的蛋白tPA(組織型纖維蛋白溶酶原激活因子)，展示了用動物乳腺生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的可能性。此后十多年的科學(xué)實踐證明，動物乳腺有廣泛表達(dá)外源基因的能力，可以生產(chǎn)各種蛋白質(zhì)和多肽，從小分子肽到大分子蛋白質(zhì)，從分泌型蛋白到內(nèi)膜蛋白、多聚蛋白、二價抗體等。顯示動物乳腺是一種很好的生物反應(yīng)器，在生產(chǎn)高附加值蛋白質(zhì)方面有廣泛用途?，F(xiàn)己成為生物技術(shù)研

3、究的熱點。并向商業(yè)化階段轉(zhuǎn)變，顯示了廣闊的應(yīng)用前景。并且利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)飲用奶，以期望獲得既能滿足蛋白質(zhì)需要，又能增加抵抗力的品質(zhì)全面的奶，為人類服務(wù)【1】。1、乳腺反應(yīng)器的原理乳腺生物反應(yīng)器(Gland Bioreactor)技術(shù)是指利用乳腺特異表達(dá)的乳蛋白基因的調(diào)控序列構(gòu)建表達(dá)載體，制作轉(zhuǎn)基因動物， 指導(dǎo)外源基因在動物乳腺中特異性、高效率地表達(dá)， 以期從轉(zhuǎn)基因動物乳汁中源源不斷地獲得外源活性蛋白。乳腺生物反應(yīng)器的原理是應(yīng)用重組DNA 技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將目的基因轉(zhuǎn)移到尚處于原核階段的動物胚胎中經(jīng)胚胎移植得到轉(zhuǎn)基因乳腺表達(dá)的個體。外源基因在乳腺特異性表達(dá)需要乳蛋白基因的一個啟

4、動子和調(diào)控區(qū)【2】 即需要一個引導(dǎo)泌乳期乳蛋白基因表達(dá)的序列，這樣才能將外源基因置于乳腺特異性調(diào)節(jié)序列控制之下，使其在乳腺中表達(dá)再通過回收奶獲得具有生物活性的目的蛋白。它是一個專門化的分泌腺體，可以生產(chǎn)出具完全生物活性的藥用重組蛋白質(zhì)，其純化簡單，生產(chǎn)投資及成本相對較少，而且對環(huán)境不具污染性，也被稱為“分子農(nóng)場”。2、動物乳腺生物反應(yīng)器的主要研究內(nèi)容2.1 乳腺特異表達(dá)載體的構(gòu)建乳腺特異表達(dá)載體就是能夠在動物的乳腺部位特異表達(dá)攜帶外源目的基因的DNA片段。目前已克隆并用作構(gòu)建載體的乳蛋白基因主要有-乳球蛋白（BLG）基因、s1-酪蛋白基因、酪蛋白基因、乳清酸蛋白（WAP）以及乳清蛋白基因。乳腺

5、特異表達(dá)載體的首先要具備乳腺特異的啟動子，目前所熟知的乳腺特異啟動子有Beta-乳球蛋白基因的啟動子，S1 /Beta 酪蛋白啟動子( S1 /Beta Casein，CA) ，乳清酸蛋白基因啟動子，其中研究最多和效果較佳的是綿羊的BLG、牛的S1CA、山羊的Beta-CA、小鼠的WAP 等基因的啟動子如果得用目的基因的DNA序列而不是cDNA,表達(dá)效果可能會更好。不翻譯的外顯子和內(nèi)含子的摻入可能有利于轉(zhuǎn)基因的表達(dá)【3】。2. 2 乳腺生物反應(yīng)器的基因介導(dǎo)方法【4】1)微注射法微注射法是指直接將裸露的線形DNA直接注射到胚胎原核中，使得目的DNA整合到宿主基因組上。這種方法基因整合效率低，在家

6、畜中尤其如此，家兔和豬為5%15%，山羊2%，綿羊1%5%，而牛不超過05%，而且成本高;基因只能加入，不能剔除或原位修飾;整合是隨機(jī)的，由于插人位點的關(guān)系，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)不確定;隨機(jī)整合可能破壞重要的內(nèi)源性DNA序列或激活細(xì)胞的致癌基因;產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物常常是嵌合體，即并非所有細(xì)胞都整合有外源基因;以及不能在胚胎早期確定性別等。2)精子載體法該方法實驗的重復(fù)性很差，且DNA整合進(jìn)基因組后，基因重排現(xiàn)象嚴(yán)重。然而，最近有研究顯示，通過體外受精或人工授精的方法，目的DNA與抗精子表面蛋白的抗體結(jié)合，能有效進(jìn)入受精卵中，這個方法目前已經(jīng)成功地生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因小鼠與豬，外源基因以這種途徑進(jìn)入動物體內(nèi)整合效

7、率高，沒有基因重排現(xiàn)象，能表達(dá)且能傳遞給子代這種方法似乎又給精子作為載體的轉(zhuǎn)基因方法帶來的曙光。3)逆轉(zhuǎn)錄病毒法將外源基因替換病毒基因組的gag，pol和env等基因，通過順式元件的調(diào)控序列和感染成分重組病毒載體，然后注射到第二次減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞，體外受精和篩選后，將胚胎移人假孕母體的子宮內(nèi)，繼續(xù)發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。該方法整合穩(wěn)定，拷貝數(shù)和插入位點相對固定，轉(zhuǎn)基因效率高。然而轉(zhuǎn)錄病毒載體容量有限，只能轉(zhuǎn)移小于10kb片段的DNA，而且基因是隨機(jī)插入的，由于多處整合而產(chǎn)生嵌合體;雖然設(shè)計時缺失復(fù)制功能序列，但復(fù)制大量載體所需的輔助病毒基因組也可能與目的基因一起整合到同一細(xì)胞核中，有可能產(chǎn)生輔

8、助病毒株，從而產(chǎn)生生物安全性問題。23轉(zhuǎn)基因動物模型的建立【5】表達(dá)產(chǎn)物是否有生物活性、對動物生長發(fā)育是否有副作用及其表達(dá)水平能否達(dá)到商業(yè)化生產(chǎn)的需求等，是衡量乳腺生物反應(yīng)器是否成功的重要標(biāo)準(zhǔn)，因此需要動物模型來檢測效果。制作轉(zhuǎn)基因動物模型時要考慮研究周期、可操作性、成功率、成本及風(fēng)險等諸多因素，跟其他動物相比，小鼠是最理想的動物模型，它成本低、研究周期短、可操作性強(qiáng)，因此大部分研究者將小鼠作為動物實驗?zāi)Ｐ汀?987年，Gordon等構(gòu)建了由小鼠WAP基因啟動區(qū)驅(qū)動的人組織纖溶酶原激活劑(t-PA)重組表達(dá)載體，首建乳腺生物反應(yīng)器小鼠模型。3、動物乳腺生物反應(yīng)器的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展國際上，動物乳腺

9、生物反應(yīng)器中某些產(chǎn)品的研發(fā)比較順利，從1987年gordon等人在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中表達(dá)出人的tpa，之后的20年里，已有數(shù)百種產(chǎn)品在小鼠乳腺中獲得了高效表達(dá)，數(shù)種重要醫(yī)用產(chǎn)品已在大動物乳汁中被生產(chǎn)出來。如上世紀(jì)90年代美英等國從轉(zhuǎn)基因山羊獲得的抗凝血酶【6】，從轉(zhuǎn)基因綿羊得到的al一抗胰蛋白酶、人凝血因子 ，從轉(zhuǎn)基因牛獲得的乳白蛋白、乳鐵蛋白，還有來自轉(zhuǎn)基因兔的 一葡萄糖苷酶等。目前，全球有十幾家公司在開展動物乳腺生物反應(yīng)器的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。比如英國的PPL公司、荷蘭的Pharming以及美國最大的生物技術(shù)公司GenzymeTransgenics Corporation是三個比較出色的公司。它們在

10、很多藥物開發(fā)，市場和產(chǎn)業(yè)化方面投入了大量資金，到目前，至少已有2種藥物完成了臨床試驗，5種進(jìn)入臨床三期試驗，37種進(jìn)入了二期臨床研究階段?，F(xiàn)在，有十幾個國家也在進(jìn)行相應(yīng)的工作，像美國、英國、荷蘭、加拿大、法國等。在我國，施履吉院士【7】早在2O世紀(jì)80年代初就提出乳腺生物反應(yīng)器構(gòu)想，并獲得了表達(dá)乙肝病毒表面抗原的轉(zhuǎn)基因兔；20世紀(jì)90年代，國家“863”高技術(shù)計劃將乳腺生物反應(yīng)器的研究列入重點科研項目；1995年，我國首次在小鼠乳腺中成功地表達(dá)了人的基因；1996年，上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所與復(fù)旦大學(xué)合作，成功培育出5只轉(zhuǎn)基因羊，并在乳汁中提取出了具有生物活性的人凝血因子IX；“九五”期間，我國首次

11、培育出了高水平表達(dá)的轉(zhuǎn)基因綿羊；2001年，又成功獲得了5只攜帶雞法氏囊疫苗基因的羊，其表達(dá)水平基本達(dá)到了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)； 2005年，國家“863”計劃組利用轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù)，分別獲得了轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白、轉(zhuǎn)人溶菌酶、轉(zhuǎn)乳清白蛋白、轉(zhuǎn)人巖藻糖轉(zhuǎn)移酶等轉(zhuǎn)入基因蛋白；其中“人乳鐵蛋白”和“人 一乳清白蛋白”是在國際上首次利用轉(zhuǎn)基因克隆牛而獲得?，F(xiàn)在，我國已有4種基因工程藥物或疫苗在上海、長春、深圳等地生產(chǎn)并投放市場，另有十余種已進(jìn)人中試階段。4、乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用4.1 生產(chǎn)基因工程藥物由于乳腺固有的優(yōu)越性使之成為生產(chǎn)藥用蛋白的工廠。據(jù)美國紅十字學(xué)會和美國遺傳學(xué)會預(yù)測，到2010年所有基因工程藥

12、中，利用乳腺生物反應(yīng)器和營養(yǎng)保健蛋白。這些蛋白可為免疫系統(tǒng)功能不全的人和接受放、化療的病人的輔助治療提供優(yōu)良制品。目前通過轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的主要生物制品有人乳鐵蛋白、人組織型纖溶酶原激活因子(http)、新生血管抑制因子、人血白蛋白等。4.2 改變?nèi)橹煞?。提高營養(yǎng)價值利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)飲用乳品的目的是期望獲得既能滿足蛋白需要又能增加抵抗力的品質(zhì)全面的奶，為人類服務(wù)。如導(dǎo)人乳鐵蛋白基因以提高乳鐵蛋白含量，導(dǎo)人溶酶基因以降低乳中細(xì)菌的含量，導(dǎo)人乳糖酶基因降低乳中乳糖含量。5、動物乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點乳腺組織表達(dá)的重組蛋白與天然表達(dá)蛋白在結(jié)構(gòu)、功能上極其相似甚至是相同。動

13、物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)具有生物活性的多肽藥物和具有特殊營養(yǎng)意義的蛋白質(zhì),已成為一個新興的轉(zhuǎn)基因制藥業(yè),它的優(yōu)越性有如下幾點。5.1表達(dá)產(chǎn)物能充分修飾且具有穩(wěn)定的生物活性利用DNA重組技術(shù)的微生物發(fā)酵工程來生產(chǎn)的藥用蛋白,由于細(xì)菌等微生物不能進(jìn)行蛋白質(zhì)合成后的加工,因而生物活性低,需要對其進(jìn)行復(fù)雜的加工才能獲得有活性的目的蛋白；并且具有免疫原性,而利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥用蛋白卻免除這些問題。5.2產(chǎn)品成本低,可以大規(guī)模生產(chǎn)據(jù)計算，與生物發(fā)酵技術(shù)相比，動物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)成本只有其百分之一。作為生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)基因動物可無限擴(kuò)繁,且飼養(yǎng)成本低,可進(jìn)行大規(guī)模的藥物生產(chǎn)。而動物細(xì)胞生物反應(yīng)器,雖然能生產(chǎn)具

14、有完全生物活性的產(chǎn)品,但以商業(yè)生產(chǎn)為目的的大規(guī)模的動物細(xì)胞培養(yǎng),成本會極高且培養(yǎng)條件要求苛刻。5.3產(chǎn)品質(zhì)量高,易提純。由動物生物反應(yīng)器生產(chǎn)的藥品為純的生物制品,避免了化學(xué)試劑及生物毒素的污染。目前,某些藥用蛋白生產(chǎn)已達(dá)每千克乳汁含幾十克,生物活性與天然蛋白幾乎完全一樣。乳汁中幾乎不含有蛋白酶，如果在目的蛋白的N端或者C端加上His標(biāo)簽（不影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能），利用親和層析樹脂柱能夠很方便將目的蛋白純化出來【5】。5.4易于擴(kuò)群，進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)作為乳腺生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)基因動物可通過繁殖或克隆技術(shù)擴(kuò)大群體規(guī)模以獲得最大的經(jīng)濟(jì)價值【9】。6、乳腺生物反應(yīng)器存在的問題 盡管轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器

15、技術(shù)已經(jīng)取得了一定成果，展現(xiàn)的廣闊的發(fā)展?jié)摿颓熬埃獜V泛應(yīng)用于生產(chǎn)實際還有諸多理論和技術(shù)上的問題需要解決。6.1 外源基因在動物體內(nèi)的整合位點問題由于人們尚未完全掌握乳蛋白基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律，目的基因的整合位點及整合詳細(xì)機(jī)理，因此對于導(dǎo)人基因在動物體內(nèi)的整合位點不能適宜選擇，常出現(xiàn)遺傳性狀不穩(wěn)定，甚至缺失等問題。6.2 轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化問題表達(dá)的產(chǎn)物往往是理論含量高而純化含量低，盡管比發(fā)酵工程的目的蛋白純化要簡單，要除去所有可能引起人類變態(tài)反應(yīng)的蛋白和乳中的細(xì)菌、病毒等微生物，這些問題仍會給目的蛋白的純化帶來一定困難。6.3 目的蛋白的翻譯后修飾問題轉(zhuǎn)基因動物能夠?qū)ν庠吹鞍走M(jìn)行翻譯

16、修飾，而動物機(jī)體的保護(hù)系統(tǒng)對一切外源性物質(zhì)產(chǎn)生排斥作用，如可能出現(xiàn)的蛋白水解過程，入一羧基化不充分，糖基化形式與人類不同等等【10】。6.4 轉(zhuǎn)基因的技術(shù)與方法問題目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的實驗室方法有許多，常用的是顯微注射法，且此法已比較成熟，但在反芻獸上成功率較低，只有4 左右，而其他好多方法還在探索階段。6.5 乳腺表達(dá)藥用蛋白安全性問題轉(zhuǎn)基因動物乳腺表達(dá)的藥用蛋白，基因藥用蛋白的純度、其轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及口服藥引起的耐受性問題；殘留蛋白是否對人體正常功能產(chǎn)生不良影響等，這些問題在現(xiàn)有科學(xué)技術(shù)水平下無法下結(jié)論。7、展望盡管利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)目的蛋白遇到許多困難，研究還處在初級階段，但技術(shù)路線是可行的

17、。如果ESC技術(shù)、核移植技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合，同源重組能獲得目標(biāo)基因的準(zhǔn)確插入，共同整合技術(shù)以及轉(zhuǎn)基因胚胎的有效篩選等方面有所突破，那么動物乳腺生物反應(yīng)器的商業(yè)化前景更加廣闊。參考文獻(xiàn)1 動物乳腺生物反應(yīng)器的研究內(nèi)容及研究現(xiàn)狀， 肖耀明、朱蘭、殷方芝、卞益、陶軍、石秀穎 上海畜牧獸醫(yī)通訊年第期 20-22頁.2 薛京倫，盧大儒乳腺生物反應(yīng)器的研究現(xiàn)狀J生物技術(shù)通報，1998(3)：17203 動物乳腺生物反應(yīng)器研究進(jìn)展，楊慧婷，王洪梅，侯明海，高運(yùn)，仲躋峰，何洪彬 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2011，39( 11) : 6412 6414頁.4 轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用，左珂菁， 苗向陽， 謝青梅， 梁梓森，現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展2010第10期 560-565頁5 動物乳腺生物反應(yīng)器的研究內(nèi)容及研究現(xiàn)狀，肖耀