植物功能基因組學(xué)研究技術(shù)

1、植物功能基因組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展摘要：隨著植物基因組學(xué)的發(fā)展，植物研究的熱點(diǎn)轉(zhuǎn)向了功能基因組學(xué)。如何確 定大量的基因序列的功能，并進(jìn)而了解基因與基因之間通過其代謝產(chǎn)物而形成 的控制生物體代謝和發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是功能基因組學(xué)研究的核心問題。在植物 功能基因組學(xué)研究屮，多摒棄原來傳統(tǒng)的技術(shù)而采用新發(fā)展的方法，既省力又 節(jié)源的研究基因的功能。關(guān)鍵詞：功能基因組學(xué)；表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)；代謝組學(xué)；rna干擾二十一世紀(jì)以來，基因組學(xué)在各種模式生物基因組測序的完成的基礎(chǔ)上發(fā)展 迅速。基因組學(xué)己經(jīng)產(chǎn)生很多個(gè)分支，比如結(jié)構(gòu)基因組學(xué)，功能基因組學(xué)，比較 基因組學(xué)等。其中，結(jié)構(gòu)基因組學(xué)是基因組學(xué)發(fā)展的初級(jí)階段，以建立牛物

2、的高 分辨率遺傳圖和物理圖為主。功能基因組學(xué)則代表基因組學(xué)發(fā)展的新階段，是利 用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)所提供的信息，發(fā)展和應(yīng)用新的研究方法，從單一基因或蛋白質(zhì) 的研究轉(zhuǎn)向多基因和多蛋白質(zhì)的綜合研究的一門學(xué)科，乂被稱為“后基因組學(xué)”。 植物功能基因組學(xué)是植物后基因時(shí)代研究的核心內(nèi)容，它強(qiáng)調(diào)發(fā)展和應(yīng)用整體的 實(shí)驗(yàn)方法分析基因組序列信息、闡明基因功能，其特點(diǎn)是采用高通量的實(shí)驗(yàn)方法 結(jié)合大規(guī)模的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)計(jì)算方法進(jìn)行研究。在植物功能基因組學(xué)的研究中，擬南 芥和水稻是兩種最常用的模式牛物，近年來小麥的功能基因組學(xué)研究也在進(jìn)行， 主要集中于基因組中轉(zhuǎn)錄表達(dá)的部分。1植物功能基因組學(xué)中的分子標(biāo)記如何快速高效的從基因組中

3、獲取生物信息，是一個(gè)急迫并且有挑戰(zhàn)性的課 題。然而，表達(dá)序列標(biāo)簽(express sequence tags, est)的出現(xiàn)成為結(jié)構(gòu)基因 組學(xué)和功能基因組學(xué)連接重要依據(jù)。est是從cdna序列中獲得的有特異性特征, 能特指某個(gè)基因，它的發(fā)展成為功能基因組學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)，genbank中積累的大 量est序列不僅為新基因的發(fā)現(xiàn)提供幫助，而且為開發(fā)基于pcr的各種分子標(biāo)記 提供資源，如est-ssr, caps, snp, srap和trap等。截止2000年數(shù)據(jù)庫dbest 中的主要信息統(tǒng)計(jì)如表1所示。表1公共數(shù)據(jù)庫dbest中植物方面的est主要信息（截止2000年）estjglycine m

4、axlycopersicon esadentuni zea maysoryza satwa arabidopsu thaliana pinus taedagosaypium hirsulum sorghum bicohr lycoper&icon penneuu lycopersicon hirsuium brassica napus lotus japonicus sorghum halepense brassica camdestris237215799002213969廳09825 5 4 4 134933021685522878078766951439642111brassic

5、a raoa subsp. pekinensiscitrullils tanatusmalus domesticacapsicum annuumsolanian tuberosumavena salivapisum salivumcitrus ainensishorcuum vulgareallium cepanicotiana tabacumpinus raduuacucumis sativusbela vulgaris1. 1 est-ssr （simple sequence repeat,簡單序列重復(fù)）標(biāo)記ssr標(biāo)記又稱為微衛(wèi)星標(biāo)記，是1-6個(gè)核昔酸序列的簡單重復(fù)，廣泛存在于 真核生物中

6、。隨著功能基因組學(xué)的發(fā)展，公共數(shù)據(jù)庫中大量的est序列為ssr 的開發(fā)提供了巨大的支持。首先，避免了傳統(tǒng)ssr標(biāo)記開發(fā)所需要的構(gòu)建基因組 文庫的繁瑣步驟，并且從est屮挖掘出的ssr只是附屬物，節(jié)省了大量的人力物 力。其次，est-ssr標(biāo)記具有天然與功能基因表達(dá)相關(guān)的重要作用，且這種聯(lián)系 具有普遍性，因此利用這種標(biāo)記做遺傳圖更快捷更準(zhǔn)確。酶切擴(kuò)增多態(tài)1. 2 caps (cleaved amplified polymorphism sequences,性序列）標(biāo)記酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列又稱為pcr-relp,它是根據(jù)est或是已經(jīng)發(fā)表的基因 序列等設(shè)計(jì)特異性引物，將特異pcr與限制性酶切性相結(jié)合

7、而檢測多態(tài)性的一種 技術(shù)。與傳統(tǒng)rflp技術(shù)一樣，caps技術(shù)檢測的多樣性也是酶切片段大小的差界, 結(jié)果較為穩(wěn)定可靠，且表現(xiàn)共顯性。與以雜交為基礎(chǔ)的rflp相比，它具有如下 優(yōu)點(diǎn)：（1）引物與限制酶組合非常多，增加了揭示多態(tài)性的機(jī)會(huì)，而且操作簡便, 可用瓊脂糖凝膠電泳分析；（2）在真核生物中，caps標(biāo)記呈共顯性，可以區(qū)分 純合基因型和雜合基因型；（3）所需用的dna量少；（4）結(jié)果穩(wěn)定可靠，且操作 快捷自動(dòng)化程度高。1. 3 snp （single nucleotide polymorphism,單核昔酸多態(tài)性）標(biāo)記 單核昔酸多態(tài)性是指染色體基因組水平上某個(gè)特定位置單堿基的置換或插入缺失引起

8、的da序列多態(tài)性。其中置換是最常見的類型。snp被認(rèn)為是繼rflp 和ssr之后出現(xiàn)的第三代分子標(biāo)記。它的發(fā)現(xiàn)途徑有兩種：一是對(duì)同源dna片段 測序或直接利用現(xiàn)有的基因與est序列，通過序列比對(duì)，獲取多態(tài)性的位點(diǎn)。通 過特界pcr擴(kuò)增和酶切相結(jié)合的方法進(jìn)行檢測；二是由于snp通常變現(xiàn)為二等位 多態(tài)性，也可以直接應(yīng)用高通量快速的dna微陣列、dna芯片技術(shù)等高新技術(shù)來 發(fā)現(xiàn)與檢測生物基因組或基因之間的差異。1.4 srap(sequence-related amplified polymorphism,相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）標(biāo)記相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性是一種新型的基于pcr的標(biāo)記系統(tǒng)，乂稱為基于序列擴(kuò)

9、增多態(tài)性（sequence-based amplified polymorphism, sbap）。引物設(shè)計(jì)是 srap 分析的核心。它共有兩套引物為正向引物和反向引物。正向引物中使用ccgg序 列，其目的是使之特異結(jié)合orf中的外顯子，反向引物中使用aatt序列，以特 異性結(jié)合富含at區(qū)，這樣就使得有可能擴(kuò)增岀基于內(nèi)含子與外顯子的srap多態(tài) 性標(biāo)記。1. 5 trap(target region amplified polymorphism,靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性）標(biāo)記靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性也是一種新型的基于pcr的分子標(biāo)記。trap標(biāo)記技術(shù) 是基于srap發(fā)展而來的，但與srap、rapd和rf

10、lp等標(biāo)記技術(shù)無需任何序列信 息即可直接pcr擴(kuò)增不同，它是基于已知的cdna或est序列信息的。trap是使 用長度為16-20核營酸的固定引物和任意引物，固定引物以公共數(shù)據(jù)庫中的靶 est序列設(shè)計(jì)而來，任意引物與srap所用一樣，為一段富含at或gc為核心， 可與內(nèi)含子或外顯子區(qū)配對(duì)的隨機(jī)序列。2正向和反向遺傳學(xué)方法在功能基因組學(xué)中的應(yīng)用2. 1建立突變體庫的研究方法基因功能分析的傳統(tǒng)并且有效的方法之一就是利用突變體。傳統(tǒng)的物理化學(xué) 誘變來產(chǎn)生突變體的方法效果差且浪費(fèi)資源，現(xiàn)在有另一種方法就是利用插入突 變，即利用轉(zhuǎn)座子（主要是玉米的ac/ds, en/spm或mu傳座子）或根癌農(nóng)桿菌的

11、t-d7a隨機(jī)插入染色體，以獲得失去功能的突變體。由于插入序列是已知的，我 們可以用各種克隆或pcr技術(shù)鑒定基因。目前已經(jīng)在例如擬南芥、牽牛花、金魚 草、番茄、水稻中獲得了一些插入突變體。2. 2反向遺傳學(xué)方法應(yīng)用雖然說研究基因功能最直接的方法是在獲得失去功能的基因突變體后研究 該突變體的表型，但是，在植物中利用同源重組方法很有難度，不利進(jìn)行。所以 我們必須另避蹊徑。在得到插入突變體后，可以用寡核營酸引物做pcr來檢測插 入突變,在群體中大規(guī)模篩選突變體株系。通過dxa-rxa雜種可能產(chǎn)生點(diǎn)突變， 通過把終止密碼子引入重復(fù)基因的保守區(qū)域，可能產(chǎn)生多基因家族的若干個(gè)無義 突變。嵌合寡核昔酸技術(shù)可

12、能是定點(diǎn)突變的有效方法之一，嵌合寡核昔酸的一條 鏈含有與目標(biāo)基因互補(bǔ)的5個(gè)內(nèi)部核首酸（僅為了使突變的堿基不配對(duì)），引入 單堿基突變的基礎(chǔ)是dna修復(fù)酶識(shí)別不配對(duì)的堿基與否。3植物代謝組學(xué)是功能基因組研究的重要內(nèi)容我們知道代謝組的成分中代謝產(chǎn)物是基因表達(dá)的終產(chǎn)物，代謝組是一個(gè)細(xì)胞 或組織的生物化學(xué)表現(xiàn)型，代謝產(chǎn)物的水平是由代謝途徑中所涉及的所有酶的活 性以及作用于這些酶的效應(yīng)物所決定的。所以從理論上來說，代謝組學(xué)分析所提 供的信息更直接的揭示基因和表現(xiàn)型之間的關(guān)系，達(dá)到檢測和推斷基因功能的目 的。對(duì)于轉(zhuǎn)基因生物和敲除突變體來說，代謝組分析意義重大。因?yàn)檗D(zhuǎn)基因生物 和突變體往往沒有明顯的表型變化，

13、比如擬南芥中就含有90%的沉默突變。人們 很難通過表現(xiàn)型的變化來確定有關(guān)基因的功能。然而，轉(zhuǎn)基因生物和敲除突變體 中某些代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和組成卻會(huì)發(fā)生改變，通過代謝產(chǎn)物水平的變化分析，就 可以把它們和野生型區(qū)分開來。所以除了從mrna和蛋白質(zhì)水平外，從代謝組學(xué) 分析中也能研究功能基因組學(xué)。陰進(jìn)樣一automatic loading樣品預(yù)處理extractionpretieaimetu化濮囪分離separation帥i及鑒定detection & identiikaion敢據(jù)分新與可枝仏豐樓與仿真ana!ysislvisuali2aiion.modeling and simulaiionp

14、a色甫soild phase mi-gas chitimaiogra-spectroscopycroexiractionphy«»ammassspcciro-solid pahse ex-liquid chromaiometrv<tractiongraphy親純ii毛貓電iifluclear magne-affiniychronu-capillary electro-lie resonancetogmphyphotsis電化學(xué) mistry生輸軌學(xué) bioinfomuiics 化學(xué)駆學(xué) chemical mformatics 化學(xué)肚學(xué) stoichiometry 計(jì)鼻

15、生解 computalional biology圖1大規(guī)模代謝組學(xué)分析的流程4 rna干擾和植物功能基因組學(xué)人們發(fā)現(xiàn)在生物體內(nèi)普遍存在一種保守的基因轉(zhuǎn)錄后沉默機(jī)制 (post-transcriptional gene silencing, ptgs)。這種 ptgs 可以由外源或內(nèi) 源的雙鏈rna降解為21-25個(gè)堿基的干擾性rna(即small stranded rna, sirna), 從而引發(fā)生物體細(xì)胞內(nèi)同源nirna的特異性降解，這種機(jī)制叫做ra干擾。利用 這種干擾機(jī)制發(fā)展起來的技術(shù)則成為rnai技術(shù)。流程圖如下。risrma iiiiiniiiuiiiiiiiijiiiiiiiimi

16、imiiiiaip 一、ft 11町3槻墜的小千擾性rna與3白形威:費(fèi)合mil 體(tirnp)adpwjriscilli h丫切 r1jrf?列min iiiii1imiiihhiiiii11 卄ii圖2 rna干擾的機(jī)制流程圖rna干擾現(xiàn)象現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于抑制真核生物的一些基因的表達(dá)，從而為解析 基因的功能開辟了新的途徑。與反義rna表達(dá)技術(shù)和基因敲除技術(shù)相比較，rnai 技術(shù)具有明顯的優(yōu)點(diǎn)：能夠強(qiáng)有力地抑制序列特異性的目的基因的表達(dá)，抑制率 很高，操作簡便迅速，耗費(fèi)的精力和財(cái)力較小。參考文獻(xiàn)黎裕,王天宇，賈繼增.植物功能基因組學(xué)的發(fā)展現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢.生物技術(shù)通報(bào), 2000年第4期.代君

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