氯化鈷對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901增殖的體外抑制作用及其可能的機(jī)制

1、氯化鉆對(duì)人胃癌細(xì)胞sgc7901增殖的體外抑制作用及其可能的機(jī)制郭蘇文(包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院保健中心014000)【屮圖分類號(hào)j r735.2【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】a【文章編號(hào)】1672-5085 (2012 )46-0235-02【摘要】fi的 探討氯化鉆對(duì)人胃癌細(xì)胞sgc7901的體外抑制作用及其可能 機(jī)制。方法 將培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞sgc7901給予不同濃度氯化鉆處理，以嚎卩坐 藍(lán)(mtt)比色法檢測人胃癌細(xì)胞sgc7901增殖及增殖抑制情況。用western-blot 方法檢測氯化鉆對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞p-erkl/2蛋口表達(dá)水平的影響。結(jié)果 濃度低于50.0μmoll-l

2、對(duì)細(xì)胞增殖無影響(p>0.05, vs control)；而濃度高 于 100μmoll-l 氯化鉆抑制其增殖(p<0.01, vs control)；高于 100μmoll-l氯化鉆引起p-erkl/2蛋口表達(dá)水平降低。結(jié)論 一定濃度氯化 鉆對(duì)人胃癌細(xì)胞sgc7901增殖有明顯抑制作用，氯化鉆的抗腫瘤機(jī)制可能與 p-erkl/2蛋白表達(dá)水平降低有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】氯化鉆 人胃癌細(xì)胞sgc7901 抑制 p-erkl/2鉆是正常人體所必須的微量元素，它是維生素b12極其重要的組成成分。 鉆被廣泛用于誘導(dǎo)細(xì)胞化學(xué)缺氧損傷，常用化合物是氯化鉆1-2o有研

3、究表明， 氯化鉆處理hela和a549細(xì)胞24小時(shí)，可引起這兩種細(xì)胞不同程度的凋亡。 化療是治療腫瘤的常用手段，本研究在體外實(shí)驗(yàn)屮觀察氯化鉆對(duì)人胃癌細(xì)胞 sgc7901的作用，研究氯化鉆是否對(duì)人胃癌細(xì)胞sgc7901的增殖具有抑制作用， 為氯化鉆進(jìn)一步發(fā)展成一種新型的抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料1.1.1細(xì)胞株人胃癌細(xì)胞sgc7901,購于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。在37°c、飽和濕度及5%co2條件下，用培養(yǎng)瓶在含10%胎牛血清、 l×105u•l-l青鏈霉素的rpmi1640培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)。1.1.2主要試劑rpm

4、i1640培養(yǎng)基（gibico公司），胎牛血清（杭州四季青生物材料有限 公司），胰蛋白酶（上海華美生物工程公司），臺(tái)盼蘭（上海華美生物工程公司）。 二甲基亞颯（amersco）, mtt （amersco）,十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺等化學(xué)試 劑購自sigma公司。bca蛋白分析試劑盒購自pierce公司?？筧ctin兔多克隆 抗體、抗p-erkl/2兔多克隆抗體、辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔igg均購自santa cruze 公司。ecl反應(yīng)試劑盒購自pierce公司。其他試劑為分析純。1.1.3主要儀器二氧化碳培養(yǎng)箱（thermoforma of the u.s.a）,倒置相差顯微鏡（xdb-1b,

5、 國產(chǎn)），超凈工作臺(tái)（sw-cj-2f,上海博迅），自動(dòng)雙重純水蒸徭器（sz98,上海 本波儀器有限公司），手提式壓力蒸汽消毒器（yxq02型，山東），電熱恒溫鼓風(fēng) 干燥箱（gzxdh.500bs,上海），電子天平（fa1004,上海恒平科學(xué)儀器公司）, 全自動(dòng)酶標(biāo)儀（elx-800 of the u.s.a1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：人胃癌細(xì)胞sgc7901在37°c、飽和濕度及5%co2條 件下，用培養(yǎng)瓶在含10%胎牛血清，l×105u•l-l青鏈霉素的rpmi1640 培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)。1.2.2細(xì)胞增殖試驗(yàn)：采用噬卩坐藍(lán)（mtt）比色法

6、測定人胃癌細(xì)胞 sgc7901的增殖情況。將單層人胃癌細(xì)胞sgc7901消化，傾去消化液后用含10 % 胎牛血清的rpmi1640配制成5×104個(gè)細(xì)胞/ ml的懸液，在96孔細(xì)胞培養(yǎng) 板中每孔接種0.2mlo在5%co2、飽和濕度條件下、37°c培養(yǎng)24h后吸棄培養(yǎng) 液，分別加入含終濃度為 10.0、50.0、100.0、200.0、400.0> 800.0μmoll：l 氯 化鉆的rpmi1640培養(yǎng)液，各濃度組均重復(fù)6孔。在上述培養(yǎng)條件下分別培養(yǎng) 24小時(shí)后，加入mtt試劑，測定490nm的吸光率（mtt測定值）。實(shí)驗(yàn)中同吋 設(shè)置不含氯化

7、鉆的對(duì)照組，其重復(fù)孔數(shù)、溫度和濕度條件、時(shí)間等均與試驗(yàn)組相 同。1.2.3免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(western blot)將人胃癌細(xì)胞sgc7901懸液 接種于六孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至貼壁面積達(dá)80%-90%吋棄去培養(yǎng)液，換上無血清培 養(yǎng)基培養(yǎng)12小吋，按實(shí)驗(yàn)分組分別加入不同濃度的氯化鉆，分別為10μmol•l-l> 50.0μmol•ll、100.0μmol•ll、200.0μmol•l-l> 400.0μmol•ll、800.0&

8、amp;mu;mol•ll,對(duì)照 組不加藥物。作用24h后，用ripa+ pmsf細(xì)胞裂解液在冰上裂解細(xì)胞，低溫離 心15分鐘提取蛋白，bca法蛋白定量。加上樣緩沖液，100°c變性5分鐘。每 孔50μg蛋白上樣，10% sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜 上，用5%脫脂奶粉封閉1小吋，加一抗稀釋液(1： 1000稀釋)4°c過夜，ttbs洗 膜，結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1： 5000稀釋)，ttbs洗膜，用ecl化學(xué)發(fā)光 試劑在x光膠片上暴光、顯影、定影。以actin為內(nèi)參照，應(yīng)用凝膠成像分析系 統(tǒng)進(jìn)行條帶掃描分析結(jié)果，

9、結(jié)果以蛋白條帶的面積積分值與actin的面積積分值 比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用spss11.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,p<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1氯化鉆對(duì)人胃癌sgc7901細(xì)胞生長的抑制作用低于50.0μmolll氯化鉆濃度組對(duì)人胃癌細(xì)胞sgc7901增殖無影響(p>0.05, vs control)；而高于 100μmoll-1 濃度組抑制其增殖(p<0.01, vscontrol)(見表 1)。表1

10、人胃癌細(xì)胞sgc7901在不同濃度的氯化鉆作用24小時(shí)后測定的mtt值(x±s) n=63討論氯化鉆為紅色單斜晶體，被廣泛用于誘導(dǎo)細(xì)胞化學(xué)缺氧損傷。氯化 鉆的細(xì)胞損傷效應(yīng)可能與所誘發(fā)的活性氧族、絲裂原激活的蛋白激酶的磷酸化和 p53產(chǎn)生有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察到氯化鉆在低濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出輕微的細(xì)胞毒性， 隨著其濃度的增加，體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞sgc7901的存活率明顯下降，提示 一定濃度氯化鉆有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。erk1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是近年來研究的熱點(diǎn)，它是介導(dǎo)細(xì)胞外刺激到細(xì) 胞內(nèi)反應(yīng)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，在細(xì)胞增殖過程中起重要調(diào)節(jié)作用6。研究表 明，作為重要的細(xì)胞周期相關(guān)

11、蛋白激酶途徑，erk1/2信號(hào)途徑受到抑制是多種 細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要原因，這主要是因?yàn)閑rk1/2激酶與bcl-2家族蛋白有著密切 的關(guān)系，erk1/2的激活不但可以上調(diào)bcl2等抗凋亡蛋白的表達(dá)，而且可以誘導(dǎo) 其活化7, 8o實(shí)驗(yàn)觀察了氯化鉆對(duì)人胃癌細(xì)胞sgc7901p-erkl/2表達(dá)的影響。 研究發(fā)現(xiàn)在一定的作用時(shí)間范圍內(nèi)，低濃度氯化鉆組對(duì)p-erk1/2蛋白表達(dá)無影 響，而高濃度氯化鉆可下調(diào)人胃癌細(xì)胞sgc7901中perkl/2蛋白的表達(dá)，這一 變化趨勢與mtt的結(jié)果基本一致。提示氯化鉆可能通過抑制p-erkl/2蛋白的表 達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，這一結(jié)果為氯化鉆防治胃癌的

12、臨床應(yīng)用奠 定理論基礎(chǔ)。由于細(xì)胞凋亡是一個(gè)極其復(fù)雜、涉及多步驟、多因子參與的過程， 故氯化鉆誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的詳細(xì)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)1 daimin, cui peilin, yuminghua, et al. melatonin modulates the expression of vegf and h if-1 alpha induced by coci2 in cultured cancer cells j. pineal res, 2008, 44(2): 121-126.2 hervouet e, peci na p, dem ont j, et al. i nhibit

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