豬流性腹瀉腹瀉病毒的假病毒相關(guān)研究

1、.前言豬流行性腹瀉假病毒的研究摘 要 豬流行性腹瀉病毒（PEDV）屬于冠狀病毒屬，冠狀病毒科，能夠?qū)е伦胸i嚴(yán)重腹瀉，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失。S蛋白作為PEDV最主要的膜蛋白，已有報(bào)道證實(shí)S蛋白含有病毒感染細(xì)胞的抗原表位區(qū)，但關(guān)于S蛋白介導(dǎo)PEDV進(jìn)入細(xì)胞還有待于進(jìn)一步研究，故本主要通過(guò)構(gòu)建PEDV S1的偽型病毒研究富含抗原表位區(qū)的S1蛋白在PEDV進(jìn)入細(xì)胞中的作用。 本研究中，首先，為有效的檢測(cè)PEDV，利用Vero E6繁殖的PEDV做為抗原，制備PEDV全病毒多克隆抗體。利用ELISA和間接免疫熒光對(duì)抗體的效價(jià)和特異性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示該多克隆抗體與PEDV有很好的特異性反應(yīng)。其次，

2、為研究PEDV的感染特性，摒棄非同源細(xì)胞系，對(duì)PEDV在豬小腸上皮細(xì)胞（IEC）上進(jìn)行適應(yīng)培養(yǎng)，通過(guò)在IEC細(xì)胞中盲傳10代，對(duì)第10代病毒液進(jìn)行檢測(cè)。反轉(zhuǎn)錄PCR、間接免疫熒光和電鏡檢查均證實(shí)PEDV能夠感染IEC細(xì)胞系，并穩(wěn)定傳代，故最終確定IEC是PEDV的易感細(xì)胞系。再次，為研究PEDV S1蛋白功能，構(gòu)建S1蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，建立穩(wěn)定表達(dá)S1蛋白的BHK-21細(xì)胞系，命名為BHK-S1。反轉(zhuǎn)錄PCR和間接免疫熒光鑒定，成功構(gòu)建了BHK-S1穩(wěn)定細(xì)胞系。利用BHK-S1穩(wěn)定細(xì)胞系和重組的VSV系統(tǒng)，成功制備PEDV的偽型病毒VSVG*S1。反轉(zhuǎn)錄PCR和激光共聚焦檢測(cè)結(jié)果顯示，重組病

3、毒構(gòu)建成功。最后，為研究S1蛋白在VSVG*S1感染IEC細(xì)胞中的作用，對(duì)感染VSVG*S1的IEC細(xì)胞中的S1蛋白進(jìn)行動(dòng)態(tài)定位。激光共聚焦結(jié)果顯示，S1蛋白在病毒感染IEC細(xì)胞系的吸附和進(jìn)入過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究為進(jìn)一步檢測(cè)PEDV提供了有效實(shí)用的實(shí)驗(yàn)材料，為研究PEDV的感染特性和探索S1蛋白在PEDV感染細(xì)胞時(shí)的作用提供了參考。關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；易感細(xì)胞系；穩(wěn)定表達(dá)系；假病毒；感染特性1 豬流行性腹瀉病毒1.1 PEDV的根源豬流行性腹瀉病毒（PEDV）從屬于冠狀病毒科，冠狀病毒屬，是單鏈，有包膜的RNA病毒，與其他冠狀病毒類似，其病毒粒子形態(tài)呈多形性，大多數(shù)類似球形，大小平

4、均為130 nm，外有囊膜，纖突呈花瓣?duì)睿w突大小介于18-23 nm，呈放射分布，病毒粒子的中央稱為電子不透明區(qū)。然而，人們對(duì)于病毒內(nèi)部的了解甚少。在歐洲，青年種豬，育肥豬和架子豬主要被豬流行性腹瀉病毒感染。而在我國(guó)，豬流行性腹瀉病毒感染多個(gè)年齡的豬群1。冬季，由于豬流行性腹瀉病毒引起的病毒性腹瀉，母豬以及哺乳仔豬感染該病毒幾率較低于育肥豬和保育豬群2。該腹瀉病毒引起的腹瀉病的臨床癥狀大都表現(xiàn)為感染豬食欲廢絕或者減退，精神不振，眼窩下陷，明顯的全身脫水，水樣腹瀉，伴有嘔吐，其糞便稀少，顏色呈灰黃色或者黃色，腹瀉時(shí)間3-4天后，病豬將會(huì)由于脫水過(guò)重而死亡。豬流行性腹瀉與豬傳染性胃腸炎(TGE)

5、 的臨床癥狀較為相似。二者相比，前者傳播較慢，但持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，腹瀉的程度與后者相比也較輕3。于1971年，豬流行性腹瀉首次在英國(guó)發(fā)現(xiàn)4。由Debouck等成功分離得到豬流行性腹瀉病毒則在1978年，將之定名CV777。隨后關(guān)于該病毒在多個(gè)國(guó)家被相繼報(bào)道6，尤其在美國(guó)、韓國(guó)和朝鮮等。因?yàn)樵摬《緦⒔鼈鞅闅W洲，有學(xué)者將該病叫做“流行性病毒性腹瀉(EVD)”，于1976年，首次報(bào)道了與豬傳染性胃腸炎相似的，可以危害哺乳仔豬的急性腹瀉。人們?yōu)榱伺懦阎哪c道致病性病原以及豬傳染性胃腸炎病毒，故將該病亦稱為“EVDII型”，為了和早期發(fā)現(xiàn)的”EVD型I”分開。直至20世紀(jì)的80年代初，各國(guó)學(xué)者證實(shí)此兩種引

6、起病毒性腹瀉的病原都是同一種冠狀病毒，此后，一致命名為“豬流行性腹瀉(PED)”5。1.2 PED流行病學(xué) 自1978年在比利時(shí)首次分離得到PEDV后，從20世紀(jì)的80年代到90年代，該病在歐洲大面積爆發(fā)，包括荷蘭、英國(guó)以及瑞士等。然而，在亞洲的爆發(fā)更為嚴(yán)重，中國(guó)、泰國(guó)、韓國(guó)以及日本尤為明顯。隨后，于2012年，該病在美國(guó)多個(gè)州盛行，包括科羅拉多州、愛荷華州和明尼蘇達(dá)州等。大部分的爆發(fā)集中在10日齡的仔豬，日前，PED仍在世界范圍內(nèi)呈大面積流行，給各地養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)不同程度的損失。1.3 PEDV基因結(jié)構(gòu)PEDV結(jié)構(gòu)為有包膜，單股正鏈的線性RNA病毒，與其他冠狀病毒成員相似?；蚪M全長(zhǎng)269503

7、2950 nt，5端含有一個(gè)帽子結(jié)構(gòu)（cap），3端含有一個(gè)Poly（A）尾巴，且其3端和3端分別包含一個(gè)非翻譯區(qū)（5UTR和3UTR）。目前已發(fā)現(xiàn)的7個(gè)開放閱讀框從5端到3端的順序依次為：ORFla（1100013000 nt）、ORFlb（80009000 nt）、S基因（41004250 nt）、ORF3基因（650720 nt）、M基因（660730 nt）、E基因（220245 nt）、N基因（12601450 nt），其中共編碼四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，分別為纖突蛋白（S基因）、小膜蛋白（E基因）、膜糖蛋白（M基因）、核衣殼蛋白（N基因），和三個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，分別為復(fù)制酶多聚蛋白1a/1b和OR

8、F3蛋白。復(fù)制酶多聚蛋白基因由兩大開放閱讀框構(gòu)成（ORF1a和ORF1b），占5端，覆蓋近全長(zhǎng)的三分之二，位于編碼四種主要結(jié)構(gòu)蛋白的基因上游。1.4 PEDV主要結(jié)構(gòu)蛋白功能PEDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白有四種，分別是纖突蛋白（S蛋白）、膜糖蛋白（M蛋白）、核衣殼蛋白（N蛋白）、小膜蛋白（E蛋白）。S蛋白是一種存在于病毒粒子表面、組成病毒囊膜的重要結(jié)構(gòu)蛋白，分子質(zhì)量150220kDa，由1383個(gè)氨基酸構(gòu)成，包含多個(gè)糖基化位點(diǎn)，屬于I型糖蛋白7、18。冠狀病毒的S蛋白大都具有相近的功能和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，根據(jù)其保守序列的相似性， PEDV的S蛋白被分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：S1區(qū)（1789 aa）和S2（7901383

9、 aa）14。有研究者將S1區(qū)人為的劃分成兩個(gè)區(qū)域：第一個(gè)區(qū)域?yàn)镹端的250個(gè)氨基酸殘基；其余部分為第二個(gè)區(qū)域，其中有90個(gè)殘基，因與其他冠狀病毒相比具有較大的差異性，被認(rèn)為極有可能成為PEDV的特異性抗原決定簇7、10-12。S蛋白能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞表面受體與病毒粒子的結(jié)合，從而在病毒入侵中發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時(shí)在刺激宿主免疫介導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體過(guò)程中扮演重要角色12-15。在2005年，有研究者將S蛋白的中和表位以無(wú)煙堿煙草植物為載體進(jìn)行表達(dá)，并用表達(dá)產(chǎn)物免疫仔豬，結(jié)果證實(shí)獲得的高效表達(dá)的蛋白具有較好的免疫原性。2006 年孫東波9等利用 fd 絲狀噬菌體展示技術(shù)研究分析了 PEDV S 蛋白抗原表位的

10、免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)，結(jié)果得出三個(gè)抗原表位區(qū)： S1P1（248280 aa）、S1P2（442499 aa）和 S1P3（697742 aa），該研究結(jié)果為PED診斷方法的建立以及開發(fā)新疫苗提供了新的思路和理論依據(jù)。M蛋白大量存在PEDV囊膜中，是裝配病毒粒子時(shí)所必須的重要結(jié)構(gòu)蛋白，是由226個(gè)氨基酸組成的多肽，分子質(zhì)量約為2031 kDa。M蛋白為跨膜蛋白，由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：位于膜內(nèi)的大的C末端、位于膜外的短小糖基化N末端及螺旋區(qū)。M蛋白也在免疫介導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生-干擾素及中和病毒粒子的抗體16-18。當(dāng)補(bǔ)體存在時(shí)，抗M蛋白囊膜外抗原表位的單克隆抗體具有良好的抑制病毒感染的能力

11、19。N蛋白與病毒RNA相互纏繞，是病毒核衣殼的重要成分。由441個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為58 kDa左右。在豬感染PEDV 的早期，就有大量的抗N蛋白抗體產(chǎn)生，同時(shí)編碼N蛋白的序列高度保守，使得N蛋白擁有良好的免疫原性，因此N蛋白是用作PEDV早期精確診斷的理想靶蛋白。E蛋白是最小的結(jié)構(gòu)蛋白，位于病毒囊膜上。由76個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子質(zhì)量?jī)H約8 kDa。目前針對(duì)E蛋白的研究表明，E蛋白對(duì)于包膜形成、病毒的形狀形成、出芽過(guò)程、病毒復(fù)制、以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有決定性作用20。1.5 PEDV非結(jié)構(gòu)蛋白功能復(fù)制酶多聚蛋白1a/1b是分別由開放閱讀框ORF1a和開放閱讀框ORF1b編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白，大小約

12、753.06 kDa（復(fù)制酶多聚蛋白1a 約452.82 kDa，復(fù)制酶多聚蛋白1b約300.24 kDa）。目前已證實(shí)，在PEDV入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程中，復(fù)制酶多聚蛋白1a/1b在入侵早期能夠發(fā)揮重要作用21。開放閱讀框ORF3編碼的ORF3蛋白是一種與膜糖蛋白（M蛋白）相近的非結(jié)構(gòu)蛋白，位于病毒包膜的小膜蛋白（E蛋白）與纖突蛋白（S蛋白）間隙中，分子質(zhì)量約25.5 kDa，尾部含有六個(gè)His。ORF3蛋白是PEDV的輔助蛋白，被認(rèn)為能夠?qū)Σ《镜亩玖Ξa(chǎn)生較大的影響，可被用作分子標(biāo)記來(lái)判斷病毒毒力衰減以及對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的適應(yīng)性22-23。ORF3基因具有多態(tài)性，存在至少3個(gè)可變區(qū)，還包括核苷酸的一段

13、短缺失（27 bp），所以O(shè)RF3蛋白的生物學(xué)意義仍有待于進(jìn)一步的研究。1.6 PEDV細(xì)胞表面受體研究進(jìn)展哺乳動(dòng)物的氨肽酶N（aminopeptidase N，APN，CD13）是一種型細(xì)胞表面金屬蛋白酶，其外部結(jié)構(gòu)域糖基化程度較高，而且活性部位有一個(gè)鋅離子24。目前，APN被認(rèn)為是幾種群冠狀病毒的細(xì)胞表面受體，包括豬傳染性胃腸炎病毒、人類冠狀病毒229E和貓冠狀病毒25-27，而關(guān)于豬氨肽酶N（porcine aminopeptidase N，pAPN）是否參與PEDV感染過(guò)程的研究較少。Oh JS等28在2003年證實(shí)，兔源抗pAPN多克隆抗體能夠抑制PEDV與pAPN蛋白的結(jié)合，并且，

14、用可溶性pAPN蛋白預(yù)處理的Vero E6細(xì)胞培養(yǎng)病毒可以增強(qiáng)病毒的感染力。pAPN是一種大小約150 kDa的糖基化蛋白，大量存在于小腸黏膜上28-29。Li BX等30于2007年證明，表達(dá)pAPN的MDCK細(xì)胞（一種犬腎細(xì)胞系）更容易被PEDV感染，同時(shí)感染可以被抗pAPN多克隆抗體所抑制。Nam E等31人培養(yǎng)了能夠穩(wěn)定表達(dá)pAPN的ST細(xì)胞，并在之后的PEDV細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)中證明，pAPN的過(guò)表達(dá)有助于病毒在ST細(xì)胞中的復(fù)制。盡管PEDV能夠在不表達(dá)pAPN的猴源細(xì)胞系Vero E6細(xì)胞上連續(xù)傳代，但數(shù)據(jù)明確顯示pAPN與PEDV感染之間有關(guān)聯(lián)32。1.7 PEDV繁殖與裝配PEDV作

15、為冠狀病毒的一種，是最大的RNA病毒，其繁殖裝配過(guò)程機(jī)制較為復(fù)雜，包含有多種病毒及細(xì)胞蛋白的參與。PEDV基因組的第一個(gè)開放閱讀框編碼一個(gè)較大的多聚蛋白，即復(fù)制酶多聚蛋白1a/1b，后期被加工成一系列直接或間接與病毒復(fù)制相關(guān)的病毒蛋白，包括RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）、RNA解旋酶、蛋白酶、金屬結(jié)合蛋白和一些功能未知的蛋白。基因?qū)W水平的研究認(rèn)為這其中的大部分蛋白都參與了RNA病毒的復(fù)制。除了病毒蛋白之外，很多細(xì)胞蛋白也被認(rèn)定與PEDV復(fù)制順式作用元件相互作用，如異質(zhì)核糖核蛋白（hnRNP）A1、PTB、PABP和線粒體順烏頭酸酶等。與其他RNA病毒相似，PEDV能夠?qū)⒓?xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄翻譯

16、體系的細(xì)胞蛋白改變，從而被病毒復(fù)制所利用。盡管目前關(guān)于PEDV的RNA復(fù)制機(jī)制尚有爭(zhēng)議，但學(xué)者們普遍認(rèn)同：其RNA復(fù)制是由病毒RNA上的順式作用元件指導(dǎo)，配合其編碼的反式作用因子共同完成。事實(shí)上，連續(xù)的蛋白質(zhì)合成依賴于RNA的合成，因?yàn)榈鞍缀铣傻囊种埔蜃幽軌蛟诓《緩?fù)制周期的任一階段來(lái)抑制病毒RNA的合成33-34。參與復(fù)制的這些蛋白產(chǎn)物的具體精確的性質(zhì)和功能刪除有待于進(jìn)一步發(fā)掘。PEDV的復(fù)制不僅有病毒蛋白的參與，還包含了很多細(xì)胞蛋白，這些細(xì)胞蛋白在PEDV的作用下不再行使其在宿主細(xì)胞中的正常功能，轉(zhuǎn)而在病毒復(fù)制周期中扮演重要角色。在感染細(xì)胞提取物中沒有能夠與病毒RNA發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的病毒蛋白，

17、這說(shuō)明病毒蛋白與病毒RNA之間的相互作用只是通過(guò)細(xì)胞蛋白間接發(fā)揮作用。2 假病毒2.1 假病毒的發(fā)展假病毒研究起始于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的應(yīng)用，是伴隨著重組病毒表達(dá)技術(shù)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)的提高而發(fā)展起來(lái)的35。從最初的重組痘病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)經(jīng)歷重組塞姆利基森林病毒( SFV) 系統(tǒng)到酵母表達(dá)系統(tǒng)，以及最新的哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)系統(tǒng)。用哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建假病毒已逐漸取代傳統(tǒng)方法成為主要通用方法。目前，研究者多采用多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行假病毒生產(chǎn)，多質(zhì)粒通過(guò)特定轉(zhuǎn)染方法進(jìn)入細(xì)胞，在胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制表達(dá)組裝成含報(bào)告基因的假病毒，通過(guò)收獲純化等方法獲得假病毒。2.2假病毒

18、的特點(diǎn) 假病毒耐核酸酶作用，穩(wěn)定性好，易保存和運(yùn)輸。由于外源RNA包裹在假病毒的外殼蛋白內(nèi)，所以可以抵抗外界核酸酶的作用，不易被降解。因此，假病毒穩(wěn)定性良好，在室溫條件下可以保存至少30d，4可以保存更長(zhǎng)時(shí)間，從而解決了RNA 質(zhì)控品在使用、保存和運(yùn)輸中穩(wěn)定性的問(wèn)題。 在 RNA 標(biāo)本檢測(cè)過(guò)程中，假病毒真正做到從樣品處理到擴(kuò)增的全程質(zhì)量監(jiān)測(cè)在核酸檢測(cè)過(guò)程中，為保持與實(shí)際檢測(cè)樣品間擴(kuò)增效率的一致性，作為標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)盡量選擇與實(shí)際檢測(cè)樣品結(jié)構(gòu)近似的樣品。例如，以基因組DNA為起始材料時(shí)就要選擇基因組DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行RNA 解析時(shí)最好選擇目的基因的RNA 作為標(biāo)準(zhǔn)品。傳統(tǒng)的RNA病毒檢測(cè)的質(zhì)控品和

19、標(biāo)準(zhǔn)品有三種：裸露的RNA 或者原病毒顆粒、體外轉(zhuǎn)錄RNA以及質(zhì)粒DNA，但是這些質(zhì)控品都有各自的弊端。裸露的RNA容易被廣泛存在的核糖核酸酶降解，提取困難且具有生物傳染性。相對(duì)于傳統(tǒng) RNA 病毒質(zhì)控品，假病毒的蛋白-RNA 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)與天然病毒相似，即都是外殼蛋白包裹核酸，因此可以把假病毒視為病毒材料對(duì)待，必須經(jīng)過(guò)RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄后才可用于PCR 擴(kuò)增，從而對(duì)RNA 病毒的檢測(cè)進(jìn)行全程監(jiān)控，保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。與自然源性病毒相比,假病毒整合了其他病毒的囊膜蛋白,而且核酸分子上編碼囊膜蛋白的基因被修飾掉,所以這種病毒喪失了病毒的自我復(fù)制能力,只能進(jìn)行“一個(gè)細(xì)胞周期” 的侵染,從而得到

20、的病毒樣顆粒無(wú)傳染性，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員造成傷害，也不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。同時(shí)，假病毒通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)、表達(dá)即可獲取，極為方便37。因此，在研究致病性高而不易培養(yǎng)、或者不易體外培養(yǎng)的病毒時(shí),制備假病毒是一種安全可靠的方法。2.3假病毒分類以原核表達(dá)為基礎(chǔ)的假病毒其技術(shù)原理：包裝病毒與外源RNA病毒分別通過(guò)RT-PCR技術(shù)獲得目的基因后T載體克隆鑒定，然后通過(guò)酶切連接構(gòu)建既含有外源RNA 相應(yīng)基因序列又含有包裝病毒包膜蛋白相應(yīng)基因序列的重組子。原核表達(dá) 產(chǎn)物進(jìn)行破碎處理、核酸酶消化、純化，獲得無(wú)基因組污染的病毒樣顆粒，即假病毒。目前，原核表達(dá)假病毒載體所采用的包膜蛋白主要有如下2種，MS2 噬菌體包膜蛋白

21、和煙草花葉病毒（tobacco mo- saic virus, TMV）包膜蛋白。MS2 噬菌體是單鏈正性RNA病毒，為26nm 長(zhǎng)的20面體，共有3569個(gè)核苷酸，包含有3個(gè)基因，編碼成 熟酶蛋白、包膜蛋白、復(fù)制酶蛋白和裂解蛋白4種蛋白質(zhì)分子。噬菌體由180個(gè)包膜蛋白單體、一分子成熟酶蛋白和一分子基因組RNA 組成。在MS2 噬菌體包膜蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)包膜蛋白與噬菌體復(fù)制酶5' 端由19 個(gè)堿基 (19 mer) 組成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNA序列有特異性相互作用，這種作用可引發(fā)噬菌體外殼的組裝，同時(shí)又將噬 菌體基因組RNA包裝到包膜內(nèi)。研究人員發(fā)現(xiàn)在包裝位點(diǎn)后引入非噬菌體基因序列也可以引發(fā)包

22、裝。因此，如果將外源病毒 RNA的cDNA 克隆于MS2 噬菌體包膜蛋白基因序列下游，并在其下游插入終止子，轉(zhuǎn)錄后得到帶有噬菌體操縱子RNA序列的外源病毒RNA轉(zhuǎn)錄本，誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中噬菌體包膜蛋白得以表達(dá)并組裝成蛋白外殼，并將攜帶有外源病毒RNA 序列的噬菌體基因組包裹到包膜內(nèi)，構(gòu)成噬菌體病毒樣顆粒。煙草花葉病毒（tobacco mo- saic virus, TMV）包膜蛋白TMV 是單組分的帶有帽子結(jié)構(gòu)的負(fù)鏈 RNA 病毒，大約為6.4kb，能產(chǎn)生3 種亞基因組mRNA，分別編碼4種蛋白：128/183K的復(fù)制酶 ，30K的運(yùn)動(dòng)蛋白和17.5kD的外殼蛋白，還有目前為止尚未 檢測(cè)到的54k

23、D蛋白。TMV 5' 端有非翻譯區(qū) (untrans1a- tiona1 region，UTR)，可以保護(hù)TMV 基因組的RNA免受5'-3' 的外切核酸酶的降解，使之更加穩(wěn)定，提高它的半衰期。運(yùn)動(dòng)蛋白在整個(gè)TMV 的表達(dá)蛋白中比例很小，但是，在運(yùn)動(dòng)蛋白內(nèi)部有一段序列稱之為Oa，長(zhǎng)度為75 個(gè)核苷酸，有保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)，是TMV包裝起始位點(diǎn)。它在體外能啟動(dòng)包裝具有該位點(diǎn)的非TMV 的RNA，形成假病毒顆粒37。將外源病毒RNA序列的cDNA與TMV的包膜基因序列cDNA一起克隆連接到表達(dá)載體中，誘導(dǎo)表達(dá)包膜蛋白并組裝成病毒樣顆粒。在誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中，外源RNA基因隨同TMV

24、本身基因組一起組裝到病毒顆粒內(nèi)。 以真核表達(dá)為基礎(chǔ)的假病毒。用帶有一種病毒外膜蛋白基因的質(zhì)粒與帶有另一種病毒骨架基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞中,外膜蛋白基因在包裝細(xì)胞表面表達(dá)出外膜蛋白,另一種病毒的骨架基因在包裝細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄翻譯組裝成病毒顆粒,病 毒顆粒出芽時(shí)會(huì)被細(xì)胞表面表達(dá)的外膜蛋白所包裝,即形成假病毒。由于所采用糖蛋白的來(lái)源不同，目前常見的真核表達(dá)的假病毒載體主要有4種：水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-GP）假型化病毒載體；桿狀病毒GP64 假型化病毒載體；淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒糖蛋白(LCMV-GP)假型 化病毒載體； 病毒糖蛋白假型化病毒載體。2.4 假病毒的應(yīng)用 假病毒具有廣泛的宿主范

25、圍、更高的轉(zhuǎn)染效率、比其原病毒更容易濃縮成高滴度，不易被血清補(bǔ)體滅活、非細(xì)胞周期依賴性、高效轉(zhuǎn)染靜止細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn),假病毒模式已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于包括人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency Virus , HIV )在內(nèi)的多種研究中。隨著人們對(duì)病毒感染復(fù)制過(guò)程研究的深入,人為地加入報(bào)告基因(如熒光素酶 , Lac Z 等)改造假 病毒 ,并成功地應(yīng)用假病毒系統(tǒng)建立了中和抗體的 檢測(cè)方法。報(bào)告基因與目的基因融合后對(duì)目的基因的結(jié)構(gòu)功能沒有影響,為檢測(cè)報(bào)告基因所引入的免疫生物發(fā)光技術(shù)(Bioluminescent immunoassay , BL I- A)不僅具有靈敏度高、特異性好、

26、非放射性、應(yīng)用范圍廣、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),而且大量表達(dá)對(duì)細(xì)胞活體沒有任何毒性,這為其在醫(yī)學(xué)上廣泛的應(yīng)用開辟了道路。假病毒在病毒與宿主細(xì)胞相互關(guān)系的研究,對(duì)于有囊膜的病毒,病毒入侵宿主細(xì)胞,其侵入過(guò)程是由其囊膜蛋白決定的,因?yàn)槟夷へ?fù)責(zé)識(shí)別 靶細(xì)胞表面的受體并啟動(dòng)吸附和穿入的過(guò)程。其侵入細(xì)胞的過(guò)程首先通過(guò)與細(xì)胞表面的特異受體 相互作用,觸發(fā)細(xì)胞膜的融合或細(xì)胞膜的內(nèi)吞作用 ,促使病毒入侵細(xì)胞。此外, 當(dāng)兩種病毒同時(shí)感染一種細(xì)胞時(shí)所發(fā)生的表型混合現(xiàn)象提示一種病毒的囊 膜能夠包裹到另外一種不同病毒的顆粒表面。基于以上兩點(diǎn)，在研究病毒侵入細(xì)胞的過(guò)程及其組織嗜性和受體等方面應(yīng)用了此新的技術(shù)-假病毒技術(shù)。利用假病

27、毒不僅能研究病毒的細(xì)胞嗜性和進(jìn)入過(guò)程 ,還可以確定病毒的易感細(xì)胞。假病毒已經(jīng)成為研究病毒與宿主細(xì)胞之間相互關(guān)系的一種新型實(shí)驗(yàn)工具.假病毒在基因治療領(lǐng)域的研究,研究表明假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是一種新型的基因轉(zhuǎn)移載體,為解決目前基因治療中的關(guān)鍵問(wèn)題-載體系統(tǒng),提供了新的途徑。以型人類免疫 缺陷病毒為基礎(chǔ)構(gòu)建的假病毒載體具有感染分裂及非分裂細(xì)胞 、使目的基因產(chǎn)物表達(dá)穩(wěn)定 、表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)、載體自身免疫小、容納外源性目的基因大等優(yōu)點(diǎn),尤其是假病毒載體能有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答,抑制腫瘤生長(zhǎng), 誘導(dǎo)抑制免疫耐受等優(yōu)點(diǎn) ,是很有發(fā)展?jié)摿Φ捏w內(nèi)基因治療新載體。同時(shí),還能夠在水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV -G )作用下,特異

28、性的識(shí)別一種在所有細(xì)胞上都存在的磷脂 ,大大地提高了其宿主范圍和感染細(xì)胞的效率。因此,其在基因治療中的重要性越來(lái)越受到人們重視38。 假病毒在DNA-病毒載體疫苗領(lǐng)域的研究,假病毒疫苗能引起與減毒疫苗類似的較強(qiáng)的保護(hù)性免疫反應(yīng),同時(shí)避免了減毒疫苗回復(fù)突變成野生株的危險(xiǎn)。且假病毒疫苗可以克服傳統(tǒng)疫苗滅活不完全 、免疫原不純及過(guò)敏問(wèn)題,模仿自然病毒感染時(shí)的抗原表達(dá),表達(dá)高效、單一的蛋白抗原 ,具有特異和 高效的免疫作用,被認(rèn)為最有前途的方案之一。目前,假病毒疫苗作為一種頗有前景的新方法而備受矚目,其假病毒疫苗導(dǎo)入人體后,疫苗抗原可在靶細(xì)胞內(nèi)以天然的方式被合成加工提成給免疫系統(tǒng),從而激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生對(duì)疫

29、苗基因產(chǎn)物特異性的CTL及抗體反應(yīng) 。3 研究目的和意義自1978年在比利時(shí)首次分離得到PEDV后，從20世紀(jì)的80年代到90年代，該病在歐洲大面積爆發(fā)，包括荷蘭、英國(guó)以及瑞士等。自2012年至今，PEDV在全球發(fā)生了大范圍的流行，殃及亞洲包括中國(guó)、韓國(guó)和日本多個(gè)國(guó)家，甚至在美國(guó)多個(gè)州造成了大面積流行，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，對(duì)PEDV感染機(jī)制、體外培養(yǎng)以及防治方面頗為重視。到目前為止，對(duì)PEDV的體外培養(yǎng)局限于Vero E6細(xì)胞系，即非豬源細(xì)胞系，這為PEDV的進(jìn)一步研究設(shè)置了很大的障礙，同時(shí)對(duì)S1蛋白的功能性研究局限于抗原表位的確定，而沒有進(jìn)一步研究PEDV感染細(xì)胞的機(jī)制。因此，本文針

30、對(duì)PEDV的易感細(xì)胞系進(jìn)行了進(jìn)一步的探索，通過(guò)嘗試在豬小腸上皮細(xì)胞系繁殖PEDV，來(lái)研究PEDV感染細(xì)胞的機(jī)制，最終確定S1蛋白在介導(dǎo)病毒吸附于細(xì)胞表面，進(jìn)入細(xì)胞起到的關(guān)鍵作用。本文首先制備針對(duì)PEDV的全病毒多克隆抗體，以用于檢測(cè)PEDV；其次在豬小腸上皮細(xì)胞適應(yīng)和繁殖PEDV，以豬源細(xì)胞進(jìn)一步研究PEDV感染細(xì)胞的機(jī)制；最后嘗試構(gòu)建PEDV的偽型病毒，用于研究S1蛋白在被感染的豬小腸上皮細(xì)胞時(shí)，在病毒的吸附和進(jìn)入過(guò)程的關(guān)鍵作用，為深入探索PEDV感染靶細(xì)胞機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)1 甘振磊, 湯德元, 李春燕, 王彬, 張曉杰, 王鳳, 劉志杰. 豬流行性腹瀉流行特點(diǎn)及流行現(xiàn)狀的研究J.

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