超詳細(xì)分解纖維素的微生物的分離學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1超詳細(xì)超詳細(xì)(xingx)分解纖維素的微生物的分離分解纖維素的微生物的分離第一頁，共30頁。一、基礎(chǔ)知識(shí)一、基礎(chǔ)知識(shí) 植物的根、莖、葉等器官都含有大量的纖維植物的根、莖、葉等器官都含有大量的纖維素。其中棉花是自然界中纖維素含量最高的天然素。其中棉花是自然界中纖維素含量最高的天然(tinrn)(tinrn)產(chǎn)物。產(chǎn)物。第1頁/共30頁第二頁，共30頁。 纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生質(zhì)，植物每年產(chǎn)生(chnshng)(chnshng)的纖維素超過的纖維素超過7070億噸，其中億噸，其中40%-60%40%-60%能被土壤中能產(chǎn)生能被土

2、壤中能產(chǎn)生(chnshng)(chnshng)纖維素酶的微生物所利用，不會(huì)纖維素酶的微生物所利用，不會(huì)大量積累。大量積累。 在草食性動(dòng)物等的消化道內(nèi)，也共生在草食性動(dòng)物等的消化道內(nèi)，也共生(gngshng)有分解纖維素的微生物，其原有分解纖維素的微生物，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，而人沒理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素的能力。有分解纖維素的能力。第2頁/共30頁第三頁，共30頁。纖維二糖纖維二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纖維素纖維素第3頁/共30頁第四頁，共30頁。取二支取二支20mL20mL的試管的試管(shgun)(shgun

3、)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)：纖維素酶分解纖維素的實(shí)：纖維素酶分解纖維素的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)(shyn)各加入各加入(jir)(jir)一張一張濾紙條濾紙條各加入各加入pH4.8pH4.8，物質(zhì)量為，物質(zhì)量為0.1mol/L0.1mol/L的醋的醋酸醋酸鈉緩沖液酸醋酸鈉緩沖液11ml11ml和和10ml10ml甲甲 乙乙在乙試管中加入在乙試管中加入1mL1mL纖維素酶纖維素酶兩支試管固定在錐形瓶中，放在兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min140r/min的搖床上振蕩的搖床上振蕩1h1h結(jié)果：乙試管的濾紙條消失結(jié)果：乙試管的濾紙條消失 討論討論：乙試管的濾紙條為什么會(huì)消失？甲試管的作用是什么：乙試管的濾紙

4、條為什么會(huì)消失？甲試管的作用是什么？第4頁/共30頁第五頁，共30頁。實(shí)驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)分析(fnx)(fnx)：P27P27的小實(shí)驗(yàn)是如何構(gòu)的小實(shí)驗(yàn)是如何構(gòu)成對(duì)照的？成對(duì)照的？第5頁/共30頁第六頁，共30頁。 剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物，而不與水解后剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生(fshng)這種反應(yīng)。這種反應(yīng)。 （二）纖維素分解（二）纖維素分解(fnji)菌的菌的篩選篩選 當(dāng)我們?cè)诤欣w維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時(shí)，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色當(dāng)我們?cè)诤欣w維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時(shí)，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色(hngs

5、)復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅-纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中就會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，這樣我們就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中就會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，這樣我們就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。第6頁/共30頁第七頁，共30頁。 剛果紅能與纖維素形成紅色剛果紅能與纖維素形成紅色(hngs)復(fù)合物，復(fù)合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。 當(dāng)我們當(dāng)我們(w men)在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時(shí)，剛果

6、紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時(shí)，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅-纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中就會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，這樣我們纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中就會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，這樣我們(w men)就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。第7頁/共30頁第八頁，共30頁。第8頁/共30頁第九頁，共30頁。 請(qǐng)你根據(jù)實(shí)驗(yàn)流程圖和提供的三個(gè)資料以及請(qǐng)你根據(jù)實(shí)驗(yàn)流程圖和提供的三個(gè)資料以及“操作操作

7、(cozu)(cozu)提示提示”，在思考有關(guān)問題的基礎(chǔ)上，在思考有關(guān)問題的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出一個(gè)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案。，設(shè)計(jì)出一個(gè)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案。土壤取樣土壤取樣選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)梯度稀釋梯度稀釋 將樣品涂布在鑒別纖將樣品涂布在鑒別纖 維素分解菌的培養(yǎng)基上維素分解菌的培養(yǎng)基上 篩選產(chǎn)生透篩選產(chǎn)生透 明圈的菌落明圈的菌落第9頁/共30頁第十頁，共30頁。 生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系，在富含纖維素的生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對(duì)提高，因此從這種環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對(duì)提高，因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。第

8、10頁/共30頁第十一頁，共30頁。第11頁/共30頁第十二頁，共30頁。 目的目的(md)(md)： 第12頁/共30頁第十三頁，共30頁。培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基成分(chng fn)分析分析培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成提供主要的營養(yǎng)物質(zhì)提供主要的營養(yǎng)物質(zhì)纖維素粉纖維素粉 5g碳源（能源）碳源（能源）NaNO3 1g氮源、無機(jī)鹽氮源、無機(jī)鹽KCl 0.5g Na2HPO47H2O 1.2gKH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g無機(jī)鹽無機(jī)鹽酵母膏酵母膏 0.5g生長(zhǎng)因子、碳源、氮源生長(zhǎng)因子、碳源、氮源水解酵素水解酵素 0.5g氮素、生長(zhǎng)因子氮素、生長(zhǎng)因子溶解后，蒸餾水定容至溶解后，蒸餾水定容

9、至1000mL水水第13頁/共30頁第十四頁，共30頁。提示提示(tsh)：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇培：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基?？捎门Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基與之對(duì)照養(yǎng)基?？捎门Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基與之對(duì)照,或者將纖維素改為或者將纖維素改為葡萄糖。葡萄糖。有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能分有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。解纖維素的微生物可以大量繁殖。第14頁/共30頁第十五頁，共30頁。第15頁/共30頁第十六頁，共30頁。第16頁/共30頁第十七頁，共30頁。比較項(xiàng)目比較項(xiàng)目分解尿素的細(xì)菌分解尿素的細(xì)菌纖

10、維素分解菌纖維素分解菌選選擇擇培培養(yǎng)養(yǎng)基基原理原理培養(yǎng)基培養(yǎng)基類型類型目的目的鑒鑒定定培培養(yǎng)養(yǎng)基基原理原理現(xiàn)象現(xiàn)象方法方法將細(xì)菌涂布在只有將細(xì)菌涂布在只有(zhyu)尿素做氮源的選擇尿素做氮源的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上將細(xì)菌接種將細(xì)菌接種(jizhng)在只有在只有纖維素粉做碳源的纖維素粉做碳源的選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)基上固體固體(gt)培養(yǎng)基培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基篩選菌株篩選菌株選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)第17頁/共30頁第十八頁，共30頁。思考：本實(shí)驗(yàn)思考：本實(shí)驗(yàn)(shyn)(shyn)的流程與課題的流程與課題2 2中的實(shí)驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)(shyn)(shyn)流程有哪些異同？流程有哪些異同？ 本實(shí)驗(yàn)流程與

11、課題本實(shí)驗(yàn)流程與課題2的流程的區(qū)別如下。課題的流程的區(qū)別如下。課題2是將土是將土樣制成的菌懸液直接樣制成的菌懸液直接(zhji)涂布在以尿素為唯一氮源的選涂布在以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接擇性培養(yǎng)基上，直接(zhji)分離得到菌落。本課題通過選分離得到菌落。本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。 第18頁/共30頁第十九頁，共30頁。101102103104105106第19頁/共30頁第二十頁，共30頁。第20頁/共30頁第二十一頁，共30頁。培養(yǎng)基

12、組成培養(yǎng)基組成提供的主要營養(yǎng)物質(zhì)提供的主要營養(yǎng)物質(zhì)CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生長(zhǎng)因子碳源、氮源、生長(zhǎng)因子KH2PO4 0.25g無機(jī)鹽無機(jī)鹽土豆汁土豆汁 100mL碳源、生長(zhǎng)因子碳源、生長(zhǎng)因子瓊脂瓊脂 15g凝固劑凝固劑上述物質(zhì)溶解后，加蒸上述物質(zhì)溶解后，加蒸餾水定容至餾水定容至1000mL氫元素、氧元素氫元素、氧元素鑒別鑒別(jinbi)纖維素分解菌的培養(yǎng)基纖維素分解菌的培養(yǎng)基(水溶性羧甲基纖維素鈉水溶性羧甲基纖維素鈉)第21頁/共30頁第二十二頁，共30頁。第22頁/共30頁第二十三頁，共30頁。第23頁/共30頁第二十四頁，共30頁。比較比較項(xiàng)目項(xiàng)目分解

13、尿素的細(xì)菌分解尿素的細(xì)菌纖維素分解菌纖維素分解菌選選擇擇培培養(yǎng)養(yǎng)原理原理培養(yǎng)基類培養(yǎng)基類型型目的目的鑒鑒定定培培養(yǎng)養(yǎng)基基原原理理現(xiàn)現(xiàn)象象方方法法酚紅指示劑酚紅指示劑 檢測(cè)檢測(cè)在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中，細(xì)菌合成的脲酶將尿素中，細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成了氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基分解成了氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性的堿性(jin xn(jin xn) )增強(qiáng)增強(qiáng)，pHpH升高。在培升高。在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如果果pHpH升高指示劑會(huì)變紅升高指示劑會(huì)變紅剛果紅可以與纖維素形成剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被纖維素酶催化分解纖

14、維素酶催化分解(fnji)后紅色后紅色復(fù)合物無法形成，培養(yǎng)基復(fù)合物無法形成，培養(yǎng)基上就會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解上就會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解(fnji)菌為中心的透明圈菌為中心的透明圈觀察菌落周圍是否有著色的觀察菌落周圍是否有著色的環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定(jindng)尿素分解菌尿素分解菌觀察菌落周圍是否出現(xiàn)觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈來篩選纖維素分解菌透明圈來篩選纖維素分解菌脲酶檢測(cè)法脲酶檢測(cè)法剛果紅染色法剛果紅染色法第24頁/共30頁第二十五頁，共30頁。方法一中方法一中NaCl溶液溶液(rngy)的作用？的作用？思考思考(sko)： 漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明漂洗作用，

15、洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法圈不夠清晰。用這方法(fngf)可以判斷酶活力的大小，實(shí)際上剛可以判斷酶活力的大小，實(shí)際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細(xì)菌可以產(chǎn)生纖果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細(xì)菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能分解這個(gè)多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結(jié)合上維素酶，能分解這個(gè)多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結(jié)合上去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合不牢的剛果紅洗去，這樣就留下大去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合不牢的剛果紅洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈當(dāng)然分解纖維素的能就強(qiáng)！大小小的透明圈，大的透明圈當(dāng)然分解纖維素的能就

16、強(qiáng)！ 第25頁/共30頁第二十六頁，共30頁。第26頁/共30頁第二十七頁，共30頁。 1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落 對(duì)照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長(zhǎng)則說明培養(yǎng)基對(duì)照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長(zhǎng)則說明培養(yǎng)基制作合格。制作合格。 如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。纖維素的微生物。 2.分離的結(jié)果是否一致分離的結(jié)果是否一致 由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易，因此最容易(rngy)分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學(xué)也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)環(huán)境不同，不同同學(xué)也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。果。第27頁/共30頁第二十八頁，共30頁。進(jìn)行定量測(cè)定。進(jìn)行定量測(cè)定。發(fā)酵發(fā)酵(f jio)(f jio)產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)纖維素酶 液體液體(yt) (yt