氟苯尼考的高效液相色譜檢測方法

1、武漢輕工大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文武漢輕工大學(xué)畢業(yè)論文 論 文 題 目：雞血漿中氟苯尼考的高效液相色譜檢測方法 Development of a HPLC for determination of florfenicol in chicken plasma 姓 名： 呂陽 學(xué) 號： 110703112 院 （系） 動物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 專 業(yè) 動物生物技術(shù) 指導(dǎo)教師 劉宇 2015年6月1日目 錄摘 要1Abstract2第一章 緒 論31氟苯尼考的研究進展31.1氟苯尼考的藥品信息31.2氟苯尼考的臨床應(yīng)用41.3氟苯尼考的檢測方法52研究目的與意義63研究內(nèi)容6第二章 試驗研究71 材料與方法71

2、.1試驗材料71.2試驗動物71.3試驗方法72 結(jié)果與計算82.1波長選取82.1工作曲線102.2回收率與精密度102.4 HPLC檢測圖譜113討論13第三章 結(jié)論與建議141 結(jié)論142創(chuàng)新點143有待進一步研究的問題14參考文獻15致 謝1619摘 要 本文建立了雞血漿中氟苯尼考含量的高效液相色譜檢測方法，方法的線性范圍為1.0200 µg/ml，線性方程為y = 520000x + 170000（r =0.9994），回收率達(dá)到86.3%98.5%，方法的定量限最低為0.1 µg/ml，日內(nèi)與日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。本法的色譜柱使用Waters 04590型

3、Symmetry-C18柱（4.6×150 mm,5m），柱溫為30，流動相使用乙腈：水=27:73（V:V），進樣量10 µL，流速1.0 ml/min，紫外檢測波長為230nm。經(jīng)驗證，本方法具有簡便快捷、定量準(zhǔn)確，線性關(guān)系良好，回收率較高等優(yōu)點，能夠為氟苯尼考的藥物代謝動力學(xué)研究提供定量依據(jù)和檢測基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞： 氟苯尼考，高效液相色譜，雞AbstractThis paper established the chicken florfenicol in plasma of high performance liquid chromatography (HPLC) met

4、hod, the linear relationship between the absorbance and concentration of tilmicosin was in the range of 1.0 to 200g/ml with a minimum detection limit of 0.1g/ml (r = 0.9997), the linear equation: y = 12674x + 16319, the recoveries ranged from 86.3% to 98.5%, the values of intra-day relative standard

5、 divination and inter-day relative standard divination were less than 5%.Waters 04590 Type Symmetry-C18 column (4.6 × 150 mm, 5m) was used in the analysis,a mixture of acetonitrile-water,at a flow rate of 1.0 ml/min was used as mobile phase, passing through the column at 30 . Ultraviolet detect

6、ion was performed at the wavelength of 230nm. Key words: High Performance Liquid Chromatography,Florfenicol, Chicken 緒 論1 氟苯尼考的研究進展1.1 氟苯尼考的藥品信息 氟苯尼考（florfenicol）1又稱作為氟甲砜霉素，因為其擁有廣泛的抗菌譜，在體內(nèi)極易吸收，分布較為廣泛，治療劑量下未發(fā)現(xiàn)毒副作用，防治效果顯著，對于敏感菌所引發(fā)的動物細(xì)菌性疾病具有極佳的治療效果，廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)中，是獸用藥物中目前正在廣泛推廣使用的一種新型的氯霉素類的廣譜抗菌藥?，F(xiàn)如今，氟苯尼考已經(jīng)在

7、水生動物、禽類、豬、反芻動物以及其他畜禽的細(xì)菌性疾病2的預(yù)防和治療中廣泛使用，目前我國已經(jīng)通過了該藥的審批。1.1.1 性狀與結(jié)構(gòu) 純凈的氟苯尼考的性狀為結(jié)晶性粉末，白色或類白色，無臭。在通常情況下，在有機溶劑中溶解度較高，溶解在水中的劑型大多為混懸液。氟苯尼考在二甲基甲酰胺中溶解度極高，溶解于甲醇，溶劑為冰醋酸時略微溶解，水或氯仿時中的溶解度極低3。濃度為0.5%的氟苯尼考水溶液的酸堿度大約在4.56.5范圍內(nèi)4。市場上出售的氟苯尼考商品名稱（國際通用）多數(shù)稱之為Florocol和Nuflo5。氟苯尼考的化學(xué)式為C12H14Cl2FNO4S ，其相對分子質(zhì)量為358.22，化學(xué)結(jié)構(gòu)式6如圖1

8、：圖1 氟苯尼考結(jié)構(gòu)式1.1.2 藥效學(xué) 氟苯尼考是屬于氯霉素類的廣譜抗菌藥，與氯霉素（CHL）和甲砜霉素（THI）具有相同的作用機理和抗菌譜，它可以與細(xì)菌有效地特異性結(jié)合，能夠通過降低相關(guān)酶的活性從而使肽鏈延伸受到抑制作用，進而干擾甚至喪失了細(xì)菌合成蛋白質(zhì)的功能7。然而，結(jié)構(gòu)的修飾與改造令氟苯尼考與CHL和THI相比，顯著增強了安全性和有效性。在結(jié)構(gòu)上，氟苯尼考用氟原子取代了CHL和THI中丙烷鏈上第3個碳原子位置上的羥基，從而對菌體蛋白的乙?；磻?yīng)產(chǎn)生阻礙和抑制作用，進而使氟苯尼考不受相關(guān)酶的影響，避免了藥物的滅活。因而，氟苯尼考不容易出現(xiàn)由質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性，并且對于大量含有耐CHL基因的

9、病原體，氟苯尼考依舊敏感。氟苯尼考對于大多數(shù)細(xì)菌都具有殺滅或抑制作用，同時對于厭氧的革蘭氏陽性菌和陰性螺旋體，以及立克次氏體，阿米巴原蟲等都具有較為顯著的抗菌作用5。1.1.3 藥動學(xué)氟苯尼考在機體內(nèi)見效快，持續(xù)時間長。根據(jù)研究者的試驗得出，肌肉注射氟苯尼考1小時以后，血液中的藥物濃度可以達(dá)到治療濃度，13 小時后便可以達(dá)到高峰期的血藥濃度。只需一次給藥，有效的血藥濃度便可以維持4872小時以上，并且不會出現(xiàn)骨髓抑制和再生障礙性貧血的危害。氟苯尼考在體內(nèi)分布廣泛，能夠透過血腦屏障來抑制和治愈動物細(xì)菌性腦膜炎，相比于其他的抗菌藥，氟苯尼考可具有極強的治療效果。在機體內(nèi)，部分器官的氟苯尼考藥物濃度

10、較高，血藥濃度可以達(dá)到治療效果，主要經(jīng)過肝臟、腎臟代謝，少量的藥物可以隨糞便由體內(nèi)排出。根據(jù)動物的種類和給藥方式的不同，氟苯尼考的藥物代謝動力學(xué)會有略微差異。1.1.4 耐藥性 由于臨床上氟苯尼考的使用方法不當(dāng)，如今已經(jīng)開始出現(xiàn)氟苯尼考的耐藥菌株，應(yīng)該即刻引起人們的廣泛關(guān)注。1996 年，Kim 等研究人員第一次發(fā)現(xiàn)并且命名了一種能夠耐氟苯尼考的基因pp-Flo，根據(jù)DNA的序列分析顯示得出，pp-Flo基因有47.4%的幾率與非酶介導(dǎo)的導(dǎo)氟苯尼考耐藥基因為同源基因。在此之后，研究者又陸續(xù)地克隆出了多種不同的氟苯尼考的耐藥基因，主要是從沙門氏菌、大腸桿菌以及葡萄球菌屬中得到，包括Flo、Flo

11、r、FexA 和Cfr等基因。總體來講，根據(jù)目前的研究結(jié)果，主要有Flo、Flor、FexA、以及Cfr 和pp-Flo9這五種可以耐氟苯尼考的基因。1.2 氟苯尼考的臨床應(yīng)用氟苯尼考如今已經(jīng)廣泛投入使用在各種水生動物（包括魚、蝦、蟹、鮑、貝等在內(nèi)）的養(yǎng)殖業(yè)中。氟苯尼考可以顯著地預(yù)防和治療各種急性、慢性的細(xì)菌性疾病，例如黃尾魚的假核性巴氏桿菌病及鏈球菌病、大西洋鮭魚癤病9、黃尾魚巴氏桿菌感染、鰻遲鈍性愛德華氏菌感染、以及鮭殺鮭弧菌性感染10等。 在豬的養(yǎng)殖業(yè)中，在預(yù)防和治療豬喘氣病、胸膜肺炎與沙門氏菌病，包括大腸桿菌性下痢、萎縮性鼻炎以及豬丹毒、豬肺疫和無乳綜合癥等在內(nèi)的疾病中，氟苯尼考具有顯

12、著的防治效果。對于豬胸膜肺炎放線桿菌，氟苯尼考的最小抑菌濃度（MIC）的范圍在0.201.56 µg/mL之間，它對于豬胸膜肺炎放線桿菌的最佳抑菌濃度是0.39 µg/mL。相比較于阿莫西林（AMX）以及恩諾沙星這兩種藥物，氟苯尼考對豬鏈球菌病的治愈率11明顯的高于二者。氟苯尼考同樣廣泛地用于預(yù)防和治療牛的細(xì)菌性疾病2 ,且防治效果是其他同類藥物所不能及。氟苯尼考可以用于防治牛呼吸系統(tǒng)疾病12 、牛腸炎13 、牛無名熱14。單獨使用氟苯尼考時，可以明顯地抑制溶血性巴氏桿菌、多殺性巴氏桿菌和嗜血桿菌三種引發(fā)牛呼吸道疾病的主要病原體，能夠顯著地治療牛的呼吸道感染疾病15。值得一

13、提的是，各成長階段的肉牛都能夠使用氟苯尼考的注射劑。目前，氟苯尼考在禽類養(yǎng)殖業(yè)的細(xì)菌性疾病防治中占有著舉足輕重的地位。根據(jù)研究者的試驗證明，按照15的比例，藥物濃度50 µg/mL來配伍甲氧芐啶（ TMP ）和氟苯尼考兩種藥物，即每毫升的藥液中含有氟苯尼考42 微克，甲氧芐啶8 微克，可以極佳的治愈雞的大腸桿菌病16。每12 小時以2040 µg/kg的劑量肌肉注射給藥或者口服給藥氟苯尼考一次，連續(xù)使用三天，能夠很好的治療雞的多殺性巴氏桿菌病，且效果較為明顯17。使用氟苯尼考可顯著地預(yù)防和治療鴨的傳染性漿膜炎，試驗表明，將氟苯尼考用于同一種群中出現(xiàn)臨床癥狀的病鴨，傳染性漿膜

14、炎的治愈率平均可以達(dá)到96.8%；將氟苯尼考用于同一種群中尚未出現(xiàn)臨床癥狀的鴨種（假定健康鴨），其傳染性漿膜炎的平均預(yù)防有效率達(dá)到了97.1%18。如果使用氟苯尼考與多西環(huán)素（DOX）的復(fù)方制劑，效果相當(dāng)于甚至高于單獨配方的氟苯尼考可溶性粉19。該復(fù)方制劑能夠有非常效地抑制雞的大腸桿菌感染且緩解病雞的臨床癥狀，并可以顯著降低雞由大腸桿菌感染引起的發(fā)病和死亡的幾率，且在一定程度上，該制劑可以減少成活雞的體重下降。1.3 氟苯尼考的檢測方法目前，用于檢測動物性食品中氟苯尼考含量的方法主要使用氣象或液相色譜與色譜質(zhì)譜聯(lián)用法，其中高效液相色譜法與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法最為廣泛。當(dāng)然，根據(jù)條件、目的、用途

15、的不同，目前也常用其他的氟苯尼考檢測方法，其中主要有電位法、分光光度法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、膠束電動毛細(xì)管色譜法等。1.3.1 氣象色譜（GC）與液相色譜法（LC）使用GC與LC法進行氟苯尼考的含量測定時，提取樣品中氟苯尼考的藥物殘留的主要提取液通常使用乙酸乙酯與甲醇、以及乙腈和丙酮等有機溶劑，其中，乙酸乙酯的提取效率最高19。常用的固相萃取柱有C18柱20、HLB柱19、MCX柱21或Florisil柱22等。在使氣象色譜法分析之前，需要進行樣品前處理反應(yīng)-硅烷化和?；源藖砩蔁岱€(wěn)定性強并且容易揮發(fā)的衍生物，通常需要使用氫火焰離子檢測器（FID）或者電子捕獲檢測器（ECD）23

16、來檢測衍生化反應(yīng)完成之后的樣品，。使用液相色譜法檢測時，色譜柱通常使用的是C18柱，檢測器通常使用二極管陣列檢測器（PDA）19、紫外檢測器（UVD）20或者熒光檢測器（FLD）21。相比于其他的分析方法，高效液相色譜法操作簡便，定量準(zhǔn)確，結(jié)果穩(wěn)定且消耗時間短，但同時該方法具有靈敏度不高，并且無法提供待測物的結(jié)構(gòu)信息的缺點。1.3.2 氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法與氣象色譜法一樣，需要進行衍生化過程，但需要避免水分的出現(xiàn)，水的存在會降低衍生化的效率，生成的產(chǎn)物不穩(wěn)定。因此，使得GC-MS法的前處理過程極為復(fù)雜。與之相比，液

17、相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法具有靈敏度高、選擇性好、定量準(zhǔn)確以及簡便快捷、抗干擾的優(yōu)點，是氟苯尼考含量較為理想的檢測方法。使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法分析不同基質(zhì)的樣品時,有時會出現(xiàn)對基質(zhì)的抑制作用。故而，使用LC-MS/MS檢測時，定量方法的需要使用內(nèi)標(biāo)法，也可以采用以基質(zhì)來匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的法方法來, 通過此方法可以提高LC-MS/MS分析方法的準(zhǔn)確度和精密度24。然而，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法的儀器并不普遍，且成本較高，無法得到普及。1.3.3 其他方法a.電位法電位法要將樣本在乙醇中溶解，再加入氫氧化鈉溶液進行加熱回流，經(jīng)稀釋以后，加入稀硝酸，然后使用銀-玻璃電極進行滴定。電位法是電化學(xué)分析領(lǐng)域

18、的主要研究方向之一，該方法定量穩(wěn)定而準(zhǔn)確，但由于其消耗時間過長，操作較為繁瑣，不適合快速的分析檢測。b.分光光度法 由于氟苯尼考在紫外光區(qū)具有吸收的特性，可以通過濃度與在特定波長處氟苯尼考的光吸收度的之間的關(guān)系，來計算和分析動物性食品中殘留的氟苯尼考的含量。使用分光光度法檢測分析操作簡便，消耗時間短，但由于干擾因素比較多，造成分光光度法的準(zhǔn)確度較低，并且專屬性較差。c.酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）酶聯(lián)免疫吸附法是一種優(yōu)秀可靠的分析檢測方法，該方法的理論基礎(chǔ)是應(yīng)用了抗原與抗體具有可逆性的特異性結(jié)合反應(yīng)，效果明顯。近幾年來，國內(nèi)市場已經(jīng)發(fā)行了試劑盒應(yīng)用于氟苯尼考的含量測定，這些試劑盒的靈敏度較高，

19、檢測濃度最低可以達(dá)到0.5ppb。酶聯(lián)免疫吸附法具有著靈敏度高、特異性強、并且操作簡便、耗時較短，定量與結(jié)果準(zhǔn)確而穩(wěn)定等特點和優(yōu)點，可以適用于氟苯尼考含量的大批量的、快速的檢測。但值得一提的是，該方法需要進行抗原與抗體的陽性確定。d.膠束電動毛細(xì)管色譜法 膠束電動毛細(xì)管色譜法是通過在緩沖溶液中加入各種表面活性劑，從而形成帶電荷的膠束。膠束電動毛細(xì)管色譜法把色譜技術(shù)與電泳技術(shù)有機結(jié)合起來，吸取了兩種方法的優(yōu)點。該方法既克服了毛細(xì)管區(qū)帶電泳法（CZE）難以分離中性離子的不足，又能彌補高效液相色譜法（HPLC）無法同時測定復(fù)雜成分中的中極性粒子和非極性粒子的缺陷，能夠在較短時間內(nèi)完成復(fù)雜組分的分離測

20、定。2 研究目的與意義 根據(jù)目前的研究，關(guān)于氟苯尼考含量的檢測方法，檢測的對象大多為水產(chǎn)動物、豬、牛等，雞血漿中氟苯尼考含量的檢測方法國內(nèi)未見報道，國外報道大多數(shù)采用的是氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS），但是這兩種方法對色譜儀器的要求與條件較為嚴(yán)格，檢測的成本較高，不利于推廣。為此，本文通過改進國外方法，建立雞血漿中氟苯尼考的高效液相色譜檢測方法，可以為開展對氟苯尼考在雞體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)研究提供定量方法，可以為使用氟苯尼考治療雞的細(xì)菌性疾病提供科學(xué)理論依據(jù)。3 研究內(nèi)容 建立雞血漿的樣品前處理方法和雞血漿中氟苯尼考的HPLC測定方法。試驗研究

21、1 材料與方法1.1 試驗材料儀器： Waters 1525高效液相色譜分析儀（配Waters 2475熒光檢測器，2497檢測器，717 自動進樣器）（美國Waters公司）； PHS-3C型精密pH計； 電子分析天平； 氮氣吹干儀(上海濟成分析儀器有限公司)； 冷凍離心機Biofuge Stratos； TGL-16C型高速離心機（德國Heraus公司）； 抽濾瓶（濾膜0.45µm）； 濾器（0.225µm）； Jcx-50G超聲波清洗機（山東濟寧超聲電子儀器廠）；藥品： 氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品, 99.76 % （Schering-Ploug h公司） 乙腈，色譜純 ； 乙酸

22、乙酯，色譜純 ； 氫氧化鈉，分析純 ； 磷酸，分析純；（北京鵬彩精細(xì)化工有限公司）；1.2 試驗動物肉雞，購自三益家禽育種有限公司分兩組進行實驗，每組三只重量：均重2kg1.3 試驗方法1.3.1 色譜條件及流動相本方法的色譜柱使用Waters 04590型Symmetry-C18柱（ 4.6×150 mm，5m），柱溫保持30，使用230nm作為檢測波長，使用乙腈與水混合作為流動相，乙腈：水=27：73（V:V），流速為1.0 mL/min，進樣量設(shè)定為10 µL。使用0.225 µm濾膜過濾。 1.3.2 給藥與樣本采集 以5mg/kg的劑量在雞的腋下肌肉注射

23、給藥，給藥后分別在0,2,4,6,12h于翼下靜脈采血2-3ml，置于經(jīng)由1%的肝素鈉潤洗的離心管中，以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min之后，吸取上層血漿液置于塑料管中，在20下冷凍保存待用。1.3.3 樣本處理 量取1 ml血漿于15 ml離心管； 加1 ml 0.1mol/L pH7.0的磷酸緩沖液, 旋渦混勻； 加4 ml乙酸乙酯,6000r/min離心15min，吸取上層置于10 ml離心管； 重復(fù)上一步，提取并合并； 50 水浴氮氣蒸發(fā)吹干； 加入流動相1ml, 旋渦混勻； 吸入1.5 ml的 Eppendorf 管, 13000r/min離心20 min； 吸取上層清液于2m

24、l棕色進樣瓶，進樣10l 進行檢測。1.3.4 檢測波長 氟苯尼考原料和制劑的紫外檢測波長已見采用223、224、225、226 、230、254和 262nm等幾種。鑒于短波長易受各種因素干擾，230nm可滿足對本品的含量測定要求。本方法選用230nm作為檢測波長，在這一波長下，輔料對氟苯尼考測定的干擾程度最小。不同波長的色譜圖見圖2、圖3、圖4、圖5、圖6和圖71.3.5 工作液的配置及工作曲線的繪制 取空白組的雞血漿5份，分別加不同體積的氟苯尼考儲備液于血漿中，使血樣濃度依次為1，2.5，25，50，100，200 g/mL，按1.3.3進行血樣處理，繪制工作曲線。1.3.6 數(shù)據(jù)測定a

25、.檢測限與定量限：取空白的雞血漿五分，按“1.3.3 血漿樣品前處理方法”處理樣品，再按1.3.1 的條件進行高效液相色譜測定，測得基線噪音值，之后求其平均值。b.準(zhǔn)確度與精密度：取空白的血漿三分，分別加不同體積的氟苯尼考儲備液于血漿中，使血樣濃度分別為50，100，200 g/mL，按照“1.3.3樣本處理”的方法進行樣品的前處理過程，計算回收率。各濃度的標(biāo)準(zhǔn)液需在同一天內(nèi)重復(fù)測定5次，日間連續(xù)測定3天，計算色譜峰面積的日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）2 結(jié)果與計算2.1 波長選取不同波長的色譜圖如下圖2 氟苯尼考色譜圖（223nm）圖3 氟苯尼考色譜圖（224nm）圖4 氟苯尼考色譜圖（2

26、25nm）圖5 氟苯尼考色譜圖（226nm）圖6 氟苯尼考色譜圖（230nm）圖7 氟苯尼考色譜圖（254nm）圖8 氟苯尼考色譜圖（262nm） 經(jīng)考察，本法選用230nm作為色譜檢測波長，在這一波長下，輔料對氟苯尼考測定的干擾程度最小。2.2 工作曲線用1.3.4方法進樣檢測，并用建立坐標(biāo)系，進行線性回歸，橫坐標(biāo)為待測物氟苯尼考的濃度，縱坐標(biāo)為待測物氟苯尼考的峰面積。計算得出，直線的回歸方程為y = 520000x + 170000，相關(guān)系數(shù)r = 0.9994。此方法的定量限為0.1 µg/mL。根據(jù)這一結(jié)果可以得出，在1200 µg/mL的范圍內(nèi)氟苯尼考的濃度與峰面

27、積的線性關(guān)系良好。氟苯尼考的工作曲線見圖9。圖9 氟苯尼考工作液峰面積與濃度的關(guān)系2.3 回收率與精密度按照處方的物料配比，精確稱取氟苯尼考對照品，加入處方比例的輔料，并混合均勻。取混合測試樣，配80,100,120 g/mL 3種濃度水平的溶液，按供試品測定方法測定氟苯尼考濃度，重復(fù)測定3次，與氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品溶液比較，按外標(biāo)法計算方法回收率，結(jié)果表明：氟苯尼考在雞的血漿中的回收率為86.3%98.5 %。結(jié)果見表1。 表1 血漿中氟苯尼考的回收率（n = 5）添加濃度（µg/mL）平均實測濃度（µg/mL）平均回收率（%）8085.786.310095.398.51201

28、04.987.5按1.3.6“精密度測定”項進行樣品分析，測得了日內(nèi)與日間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果見表2。表2 血漿中氟苯尼考的日內(nèi)、日間RSD2.4 HPLC檢測圖譜通過對流動相的組分與比例，以及柱溫、檢測波長等方面來進行色譜條件的優(yōu)化，確定了測定樣的色譜條件。氟苯尼考0,2,4,6,12h采集的樣本溶液的檢測圖譜見圖3-7。根據(jù)結(jié)果顯示，氟苯尼考在約為5.6-6 min的時間內(nèi)保留，藥物色譜峰的峰形良好，沒有明顯的干擾峰出現(xiàn)。圖10 0h血樣的檢測圖譜圖11 2h血樣的檢測圖譜圖12 4h血樣的檢測圖譜圖13 6h血樣的檢測圖譜圖14 12h血樣的檢測圖譜3 討論本試驗采用離心、過濾

29、、氮吹的方法進行雞血漿的樣品前處理，操作簡單快捷，且回收率較高。采用高效液相色譜法來測定雞血漿中氟苯尼考的含量，根據(jù)測定結(jié)果表明，方法的準(zhǔn)確度高、精密度好。 本方法簡便快捷，重現(xiàn)性良好、靈敏度較高、樣品的回收率高，樣品測定過程使用的時間較短。雞血漿中氟苯尼考的高效液相色譜檢測法的最低檢測限為0.1 µg/mL，非常適合用于氟苯尼考在雞體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)研究。結(jié)論與建議1 實驗結(jié)論本試驗建立了用高效液相色譜法測定氟苯尼考的方法，使用高效液相色譜儀，儀器較為普及，血樣處理的操作簡便易行，干擾因素較少，回收率較高，具有良好的實用性。本方法的線性范圍為1.0200 µg/mL（r

30、 = 0.9997），線性方程：y = 12674x+ 16319，最低定量限0.1 µg/mL，方法的回收率為86.3 98.5%，日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，可以為氟苯尼考在雞體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)研究提供檢測基礎(chǔ)。2 創(chuàng)新點本試驗建立了適用于雞血漿中氟苯尼考的高效液相色譜法測定方法，方法簡便且操作性強，為其在獸醫(yī)臨床上的藥代動力學(xué)及其他應(yīng)用研究打下堅實的基礎(chǔ)。3有待進一步研究的問題根據(jù)建立的雞血漿中的氟苯尼考的檢測方法，進行實際樣品中氟苯尼考的檢測以及在雞體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)研究。參考文獻1 FDA. FO I information N ADA R . 141-063.2

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