第二章高效液相色譜法

1、High Performance Liquid Chromatography HPLC第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 高效液相色譜法：高效液相色譜法：以氣相色譜為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實(shí)驗(yàn)和技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種液相色譜法。主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測(cè)手段1經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段 柱內(nèi)徑13cm，固定相粒徑100m 且不均勻 常壓輸送流動(dòng)相 ： 20h 無法在線檢測(cè)2HPLC：分離和分析 柱內(nèi)徑26mm，固定相粒徑10m（球形，勻漿裝柱） 高壓輸送流動(dòng)相：1 -10mL/min 柱效高（H，n） 分析時(shí)間大大縮短 ：20AA ，1h 可以在線檢測(cè)相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測(cè) 主要

2、差別：分析對(duì)象的差別和流動(dòng)相的差別1分析對(duì)象分析對(duì)象 GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品， 高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品不可檢測(cè) 占有機(jī)物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的樣品， 不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制 分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測(cè) 用途廣泛，占有機(jī)物的80%續(xù)前2流動(dòng)相差別流動(dòng)相差別vGC：流動(dòng)相為惰性氣體組分與流動(dòng)相無親合作用力，只與固定相作用 vHPLC：流動(dòng)相為液體流動(dòng)相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、 改善分離度增加了因素，對(duì)分離起很大作用流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣流動(dòng)相極性和pH值的選擇也對(duì)分離起到重要作

3、用 選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相 可以增大分離選擇性3操作條件差別操作條件差別 GC：加溫操作 HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。〩PLC裝置裝置高效液相色譜儀高效液相色譜儀lhttp:/ 高效液相色譜儀原理與操作 60%乙氰經(jīng)乙氰經(jīng)20min 等梯度洗脫達(dá)等梯度洗脫達(dá)100%乙氰，保持乙氰，保持10min, 流速流速 1.2mL/min, 柱溫柱溫:10, UV：254nm Minutes0.02.55.07.510.012.515.017.520.022.525.027.530.0Volts0.00000.00050.00100.00150.0020Volts0.0

4、0000.00050.00100.00150.00201234567891011121314Subtract 1Opt15-2subPk #色譜圖色譜圖四、四、HPLC的特點(diǎn)和應(yīng)用的特點(diǎn)和應(yīng)用 “三高” “一快” “一廣” 高效液相色譜的優(yōu)缺點(diǎn)高效液相色譜的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)的分辨率和靈敏度高，分析速度快，重復(fù)性好，定量精度高，應(yīng)用范圍廣適用于分析高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差的化合物缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴，要用各種填料柱，容量小，分析生物大分子和無機(jī)離子困難，流動(dòng)相消耗大且有毒性的居多1. 目前的發(fā)展趨勢(shì)是向生物化學(xué)和藥物分析及制備型傾斜 ；一、塔板理論二、速率理論 三、HPLC法中分

5、離條件的選擇圖示back續(xù)前3）傳質(zhì)阻抗項(xiàng)及其影響 ）（忽略固定相傳質(zhì)阻抗smmssmmCCCCCC忽略固定相傳質(zhì)阻抗態(tài)流動(dòng)相的傳質(zhì)阻抗注：只考慮流動(dòng)相和靜uCuCAHHPLCsmm：msmmDdpCC2mDdpC2TDm柱效，nHCdp柱效，nHDm，柱阻，但易產(chǎn)生氣泡mmDTCDT圖示1. 固定相與裝柱方法的選擇： 選粒徑小的、分布均勻的球形固定相（dp10m） 首選化學(xué)鍵合相，勻漿法裝柱2. 流動(dòng)相及其流速的選擇： 選粘度小、低流速的流動(dòng)相甲醇，1ml/min 3. 柱溫的選擇： 選室溫250C左右一、液固吸附色譜法（LSC） 二、液液分配色譜法（LLC）三、化學(xué)鍵合相色譜法（BPC）

6、1分離機(jī)制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性 中心能力的差異 競(jìng)爭(zhēng)吸附： Xm + nSa = Xa + nSm X溶質(zhì)分子 S-溶劑分子 （ m-流動(dòng)相 a-吸附表面）K = XaSmn / XmSan K-吸附平衡常數(shù)，即分配系數(shù) 分離前提：K不等或k不等)1 (0mRVSKttmVSKk續(xù)前2固定相：與LC比，固定相粒徑不同（17% 分配色譜 硅膠失活載體 吸附的水固定液1分離機(jī)制：利用組分在兩相中溶解度的差異2固定相：載體+固定液（物理或機(jī)械涂漬法） 缺點(diǎn)：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實(shí)用 固定液極性NLLC（正向） 固定液非極性RLLC （反向）3正相色譜固定液極性 流動(dòng)相極性（NL

7、LC） 極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱 適于分離極性組分 反相色譜固定液極性 固定相極性 底劑 + 有機(jī)調(diào)節(jié)劑（極性調(diào)節(jié)劑，洗脫劑） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF（四氫呋喃）續(xù)前4流動(dòng)相極性與k的關(guān)系： 流動(dòng)相極性，洗脫能力，k，組分tR5出柱順序：極性大的組分先出柱 極性小的組分后出柱6適用：非極性中等極性組分（HPLC80%問題）1分離機(jī)制：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、 誘導(dǎo)力、或氫鍵作用力2固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相3流動(dòng)相：極性?。ㄍ琇SC） 底劑 + 有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇續(xù)前4流動(dòng)相極性與k的關(guān)系： 流動(dòng)相極性，洗脫能力，組分tR

8、，k5出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分，極性小的組分先出柱 極性大的組分后出柱6適用：氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍?。?分離物質(zhì)也相似氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差別大，堿性 分析極性大物質(zhì)、糖類等反相離子對(duì)色譜法 反相色譜中，在極性流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑，使被測(cè)組分離子與其中的反離子形成中性離子對(duì)，增加k和tR，以改善分離。1）離子對(duì)試劑：烷基磺酸鈉 分離陽(yáng)離子（分析堿）四丁基季胺鹽 分離陰離子（分析酸）2）影響k的因素a與流動(dòng)相的極性有關(guān)（同反相色譜）b與R的鏈長(zhǎng)有關(guān)：R長(zhǎng)，極性小，tR，k 3）適用：較強(qiáng)的有機(jī)酸、堿 利用固定相中離子交換基團(tuán)與組分離子的交換能力的不同而達(dá)到分離的液相色譜。 特別

9、適用分析陰離子固定相：陰離子交換樹脂流動(dòng)相：電解質(zhì)溶液檢測(cè)器：電導(dǎo)檢測(cè)器EluentPumpPumpColumnColumnDetectorDetectorPumpingPumpingSeparationSeparationDetectionDetectionRecording(ChromatogramRecording(Chromatogram）F-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-Sample injection valveSuppressorDetection cellInjection0246810121416Retention time(min)Retention t

10、ime(min)08 8m SF-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-8 84 4小結(jié)、液相色譜分類和機(jī)理小結(jié)、液相色譜分類和機(jī)理l1、液液色譜 l正相色譜: 固定相為極性、流動(dòng)相為非極性或弱極性的液相色譜。 l 流出順序:非極性向極性過渡。l反相色譜: 固定相為非極性、流動(dòng)相為極性的液相色譜。l 流出順序:極性向非極性過渡。l正相離子對(duì)色譜: 固定相為極性、流動(dòng)相為非極性或弱極性的并含有適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)反離子,這種反離子能與組分形成離子對(duì)的液相色譜。l 流出順序: 按離子對(duì)極性大小流出,極性小的先流出。l反相離子對(duì)色譜: 固定相為非極性、流動(dòng)相為極性的并含有適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)反離子,這種反離

11、子能與組分形成離子對(duì)的液相色譜。l 流出順序: 按離子對(duì)極性大小流出,極性大的先流出。 小結(jié)小結(jié)l2、液固色譜l 固體固定相表面的吸附活性中心對(duì)組分的吸附能力不同而達(dá)到分離的色譜。 l 特點(diǎn):l 1）.對(duì)同系物的選擇性小,不利于同系物的分離,而有利于按族的分離。l 2）.吸附中心的吸附力與分子的幾何形狀有關(guān),有利于異構(gòu)體的分離。l 3）.由于吸附中心主要是表面的硅醇結(jié)構(gòu),吸附能力大小決定于羥基對(duì)組分分子吸附與解吸能力的強(qiáng)弱,因此對(duì)流動(dòng)相含水量要嚴(yán)格控制,方能得到良好的重復(fù)性。小結(jié)小結(jié)l3、離子交換色譜l 利用固定相中離子交換基團(tuán)與組分離子的交換能力的不同而達(dá)到分離的液相色譜。 l R+ r-

12、+ X- = R+X- + r-l R+ r- 陰離子交換樹脂 X- 組分離子 r- 平衡離子l4、凝膠色譜(排阻色譜,空間排代色譜)l 利用固定相凝膠內(nèi)孔穴大小與組分分子大小而進(jìn)行分離的一種技術(shù),分子體積大,不能滲透到孔穴內(nèi)部去,較快流出色譜柱,相反較慢流出色譜柱。 吸附色譜吸附能，氫鍵異構(gòu)體分離、族分離，制備 分配色譜疏水分配作用各種有機(jī)化合物的分離、分析與制備凝膠色譜溶質(zhì)分子大小高分子分離，分子量及其分布的測(cè)定離子交換色譜庫(kù)侖力無機(jī)離子、有機(jī)離子分析手性色譜立體效應(yīng)手性異構(gòu)體分離，藥物純化 類 型主要分離機(jī)理 主要分析對(duì)象或應(yīng)用領(lǐng)域親和色譜生化特異親和力蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析

13、小結(jié)、液相色譜分類和機(jī)理小結(jié)、液相色譜分類和機(jī)理1 22114kknRuCAH流動(dòng)相采用粘度小、低流速的勻的固定相：采用粒度小、填充均n12121212RRRRVVttkkKK溫影響?。┵|(zhì)和固定相性質(zhì)（受柱：調(diào)整流動(dòng)相種類、性0ttVVKVCVCWWkRmsmmssms?。┑呐浔龋ㄊ苤鶞赜绊戄^：調(diào)整流動(dòng)相和固定相k續(xù)前2對(duì)流動(dòng)相的要求：1）與固定液不反應(yīng)2）對(duì)樣品有良好溶解度 k=110 k=25 最理想的3）與檢測(cè)器匹配： UV（常用，測(cè)定波長(zhǎng)應(yīng)大于溶劑的截止波長(zhǎng)） 熒光，電化學(xué)4）使用粘度小、純度高的流動(dòng)相（甲醇，乙腈） 使用前過濾、脫氣續(xù)前 3洗脫方式 1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫） 以

14、固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個(gè)泵） 類似GC的等溫度洗脫2）梯度洗脫： 在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動(dòng)相的種類和比例 即不斷改變其極性（兩個(gè)泵） 適于分析極性差別較大的復(fù)雜組分 類似GC的程序升溫（沸程較長(zhǎng)樣品）圖示1輸液系統(tǒng)： 恒壓泵：流量精度不穩(wěn) 恒流泵：常用2進(jìn)樣裝置 1）隔膜進(jìn)樣（高分子有機(jī)硅膠墊進(jìn)樣室） GC系統(tǒng)壓力較小，可以 HPLC系統(tǒng)壓力太大，必須停泵進(jìn)樣（早期） 2）閥進(jìn)樣：不必停泵，六通閥續(xù)前3色譜柱：直徑46mm,柱長(zhǎng)1030cm 柱效評(píng)價(jià)：色譜系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) R，n，fs（拖尾因子） 柱再生：維護(hù)、保養(yǎng)、柱子的沖洗4檢測(cè)器 1）紫外檢測(cè)器：適于吸收紫外光的物質(zhì) 2）熒光

15、檢測(cè)器：只能分析自身發(fā)光的物質(zhì) 靈敏度高 3）示差折光檢測(cè)器：利用折光率的差別 靈敏度低，溫度要求嚴(yán)格 4）電化學(xué)檢測(cè)器 5）化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器檢測(cè)器高壓輸液泵高壓輸液泵 高壓輸液泵高壓輸液泵 輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu) 1高壓輸液泵 高壓輸液泵是液相色譜儀的關(guān)鍵部件，其作用是將流動(dòng)相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。 輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。高壓輸液泵在線脫氣裝置一、輸液系統(tǒng)一、輸液系統(tǒng)1 1 高壓輸液泵高壓輸液泵l柱塞往復(fù)泵 目前多用柱塞往復(fù)泵。續(xù)前l(fā)分析型的柱塞往復(fù)

16、泵的容積一般只有0.1lml，容易清洗和更換流動(dòng)相。柱塞往復(fù)泵屬于恒流泵，流量不受柱阻影響。泵壓一般最高為40Mpa (400kg/cm2)。l輸液的脈動(dòng)性較大是這類泵的主要缺點(diǎn)。目前多采用雙泵補(bǔ)償法克服脈動(dòng)性。l按泵聯(lián)接方式分為并聯(lián)式與串聯(lián)式，后者較多，因?yàn)樗晒?jié)約一對(duì)單向閥。 Waters公司等的串聯(lián)輸液泵，兩個(gè)泵頭分別用兩個(gè)由微機(jī)控制的馬達(dá)驅(qū)動(dòng)活塞運(yùn)動(dòng)，可達(dá)到無脈動(dòng)溶劑輸出。續(xù)前 兩個(gè)柱塞往復(fù)泵串聯(lián)：泵1的缸體容量比泵2大一倍，兩者的柱塞運(yùn)動(dòng)方向相反。當(dāng)泵1吸液時(shí)，泵2排液；當(dāng)泵1排液時(shí)，泵2吸取泵1輸液的12量，另12量輸出。如此，泵1彌補(bǔ)了在泵2吸液時(shí)的壓力下降，減小了輸液脈沖。 在

17、線脫氣裝置用于脫去流動(dòng)相中的溶解氣體，流動(dòng)相先經(jīng)過脫氣裝置再輸送到色譜柱。 除在線脫氣裝置外，目前也采用超聲脫氣、真空脫氣等方式。 脫氣不好時(shí)有氣泡，導(dǎo)致流動(dòng)相流速不穩(wěn)定，造成基線飄移，噪音增加。2 2 在線脫氣裝置在線脫氣裝置梯度洗脫的實(shí)質(zhì)梯度洗脫的實(shí)質(zhì)是通過不斷地變化流動(dòng)相的強(qiáng)度，來調(diào)整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以最佳平均k值通過色譜柱。所起的作用相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫，不同的是，在梯度洗脫中溶質(zhì)k值的變化是通過溶質(zhì)的極性、pH值和離子強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)的，而不是借改變溫度（溫度程序）來達(dá)到ABABCC 3 3 梯度洗脫裝置梯度洗脫裝置梯度洗脫裝置梯度洗脫裝置 按多元流動(dòng)相的加壓與混

18、合順序，可分為高壓與低壓梯度兩種洗脫裝置。高壓二元梯度洗脫是由兩個(gè)輸液泵分別各吸一種溶劑，加壓后再混合，混合比由二個(gè)泵的速度決定。低壓梯度洗脫是用比例閥將多種溶劑按比例混合后，再加壓輸至色譜柱。低壓梯度便宜，且易實(shí)施多元梯度洗脫，但重復(fù)性不如高壓梯度洗脫裝置。 現(xiàn)代高效液相色譜儀，都由微機(jī)控制，洗脫曲線可以指定任意形狀(階梯形、直線、曲線)。梯度洗脫的缺點(diǎn)是重復(fù)性不如恒組成洗脫。通常采用六通閥進(jìn)樣：色譜柱色譜柱色譜柱色譜柱泵泵泵泵12進(jìn)進(jìn)樣樣二、進(jìn)樣系統(tǒng)二、進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。柱管多用不銹鋼制成，管內(nèi)壁要求具有很高的光潔度。固定相采用勻漿法高壓(50100MPa)裝柱。 分析型常量柱:內(nèi)徑(I.D.)24.6