小鼠CD40Ig基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

1、小鼠CD40Ig基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定【摘要】 目的:構(gòu)建含小鼠CD40Ig基因的真核表達(dá)載體，為誘導(dǎo)供體特異性移植物的免疫耐受的基因治療作準(zhǔn)備。方法:以小鼠脾臟總RNA為模板，以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2a Fc段cDNA；另以pEGFP-N1質(zhì)粒為模板獲得綠色熒光蛋白（GFP）基因。將所得基因片段插入真核表達(dá)載體pDC516中得到重組質(zhì)粒pDC516-CD40-IgG-GFP，測(cè)序鑒定正確后，用脂質(zhì)體2000將其轉(zhuǎn)染人胚腎上皮細(xì)胞（HEK293細(xì)胞），熒光顯微鏡下觀察融合蛋白的表達(dá)。結(jié)果:成功構(gòu)建了小鼠CD40Ig基因真核表達(dá)質(zhì)粒pDC516-CD40-I

2、gG-GFP，并在HEK293細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。結(jié)論:小鼠CD40Ig基因真核表達(dá)質(zhì)粒pDC516-CD40-IgG-GFP構(gòu)建成功，為誘導(dǎo)供體特異性移植物免疫耐受的研究奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 CD40Ig 質(zhì)粒 真核表達(dá)載體 Abstract: Objective: To construct a eukaryotic expression vector encoding murine CD40Ig gene and make preparation for the gene therapy of induction of donor-specific immunologic toleranc

3、e. Methods: The cDNA of the extracellular domain of murine CD40 gene and IgG2a Fc gene were amplified by RT-PCR from the total RNA isolated from the mouse spleen, and the green fluorescent protein(GFP) gene was amplified by PCR with the plasmid pEGFP-N1 as the template. Then the genes were inserted

4、into the eukaryotic expression vector pDC516, the resultant recombinant plasmid was confirmed by seqencing. Then the recombinant plasmid was transfected into human embryonic kidney cell 293(HEK293) using Lipofectamine 2000,the expressed fusion protein was observed by fluorescence microscopy. Results

5、: The eukaryotic expression plasmid pDC516-CD40-IgG-GFP was successfully constructed, and it could be correctly expressed in HEK293 cells. Conclusion: The successfully construction of the eukaryotic expression plasmid pDC516-CD40-IgG-GFP has laid the foundation for the study of induction of donor-sp

6、ecific immunologic tolerance.2 / 19 Key words: CD40Ig; plasmid; eukaryotic expression vector 器官移植是當(dāng)今治療終末期臟器衰竭的有效方法，但免疫排斥是器官移植后長(zhǎng)期生存的一大難題。T細(xì)胞是介導(dǎo)排異反應(yīng)的主要細(xì)胞，CD40/CD40L通路在T細(xì)胞的激活過程中發(fā)揮著重要作用，因此阻斷CD40/CD40L間的相互作用，可以誘導(dǎo)宿主對(duì)移植物的低排斥反應(yīng)性。由此我們克隆了小鼠CD40分子胞外區(qū)和IgG2a分子Fc段的cDNA，并以pEGFP-N1質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，獲得GFP基因，經(jīng)酶切連接插入真核表達(dá)載體pD

7、C516，制備出重組質(zhì)粒pDC516-CD40-IgG-GFP，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后見GFP表達(dá)，證實(shí)質(zhì)粒pDC516-CD40-IgG-GFP構(gòu)建成功，從而為下一步構(gòu)建含CD40Ig基因的腺病毒載體作好了準(zhǔn)備，為研究阻斷CD40/CD40L通路誘導(dǎo)宿主對(duì)移植物的低排斥反應(yīng)性奠定了基礎(chǔ)。 1 材料和方法 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Balb-c小鼠，6周齡, 雌性, 購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。 1.2 質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞株和主要試劑 質(zhì)粒pEGFP-N1、pGEM-T載體質(zhì)粒、E coli.DH5a（天根公司）。低代次HEK293細(xì)胞株（本元正陽(yáng)）。AdMaxTM Kit E試劑盒（Microbix Bi

8、osystems，Inc.）。Taq酶、T4 DNA連接酶（Takara公司）。限制性核酸內(nèi)切酶Xma、Bgl II、Hind III（Biolabs）。Trizol 試劑、Lipofectamine 2000（Invitrogen）。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR Master Mix（MBI）。質(zhì)粒提取、膠純化試劑盒（QIAGEN）。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（Gibco）。引物合成由上海生工公司完成，基因測(cè)序由北京諾塞基因研究中心有限公司完成。 1.3 構(gòu)建小鼠CD40Ig基因真核表達(dá)質(zhì)粒 1.3.1 小鼠脾臟總RNA的提?。簩⑿∈笠灶i椎脫臼法處死，取出脾臟，加入液氮研磨后，用Trizol

9、試劑提取總RNA，方法按產(chǎn)品說明進(jìn)行。 1.3.2 CD40、IgG2a Fc、GFP基因的制備：以小鼠脾臟總RNA為模板，oligo-dT為引物，RT-PCR合成cDNA，再以此cDNA為模板，用CD40和mIgG Fc特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，另以pEGFP-N1質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物及PCR反應(yīng)條件見表1，分別獲得CD40、mIgG2a Fc和GFP基因。 1.3.3 質(zhì)粒pGEM-IgG的構(gòu)建：將IgG Fc的PCR產(chǎn)物與pGEM-T質(zhì)粒進(jìn)行TA連接反應(yīng)，即10l PCR產(chǎn)物加2l的pGEM-T載體加10 U的T4連接酶，16 過夜。取2l的連接產(chǎn)物以氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，

10、用藍(lán)白斑方法挑選含氨芐青霉素抗性的白斑克隆，在3 ml LB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100 g/ml）中37 、80 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒pGEM-IgG并測(cè)序。 1.3.4 質(zhì)粒p516-IgG的構(gòu)建：用Bgl II分別消化pGEM-IgG和pDC516，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠純化。將IgG片段和pDC516線性載體按7:1的摩爾濃度比例加T4連接酶16 過夜進(jìn)行連接反應(yīng)。取5l連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5，用pDC516-f和mIgG-r引物組合進(jìn)行菌落PCR篩選正向插入的重組子（見表2），將PCR陽(yáng)性的重組子進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并測(cè)序。 1.3.5 質(zhì)粒p51

11、6-CD40-IgG融合基因的構(gòu)建：用Xma I分別消化CD40的PCR產(chǎn)物和p516-IgG，將CD40片段和pDC516-IgG 線性載體進(jìn)行連接（方法同上）。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5后，用pDC516-f和CD40-r引物組合進(jìn)行菌落PCR篩選（見表2），將陽(yáng)性結(jié)果的重組子進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并測(cè)序。 1.3.6 PDC516-CD40-IgG-GFP質(zhì)粒的構(gòu)建：用Hind 分別消化GFP的PCR產(chǎn)物和pDC516-CD40-IgG，將GFP片段和pDC516-CD-IgG 線性載體進(jìn)行連接反應(yīng)（方法同上），用GFP-f和pDC516-r引物組合進(jìn)行菌落PCR篩選正向插入的重組子（見表2），

12、提取質(zhì)粒并測(cè)序。 1.3.7 PDC516-CD40-IgG-GFP質(zhì)粒的大量制備：按QIAGEN EndoFree Plasmid Purification試劑盒說明進(jìn)行制備，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)（見圖2），紫外分光光度儀測(cè)OD值，過濾除菌后-20 保存?zhèn)溆谩?1.3.8 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞：在6孔板中將2.0×105個(gè)細(xì)胞接種于2 ml含血清不含抗生素的DMEM中，在5% CO2、37 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)鋪滿平板的60%70%。用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，在無菌EP管中準(zhǔn)備A、B兩種溶液。A液：將4.0g DNA溶

13、于250l無血清DMEM中，輕輕混勻；B液：將10l Lipofectamine 2 000溶于250l無血清培養(yǎng)液中，輕輕混勻，室溫孵育5 min。將A液和B液混合并混勻，室溫孵育20 min，以形成脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物。換去6孔板中舊的培養(yǎng)液，重新加入2 ml含血清不含抗生素的DMEM，逐滴加入500l脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物。在5% CO2、37 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液。 2 結(jié)果 2.1 獲得小鼠CD40胞外區(qū)、IgG2a Fc段及GFP基因 引物CD40-f和CD40-r經(jīng)PCR擴(kuò)增的小鼠CD40胞外區(qū)基因片段為572 bp；引物mIgG-f和mIgG-r經(jīng)PCR擴(kuò)增的小鼠IgG2a

14、 Fc段為700 bp；引物GFP-f和GFP-r經(jīng)PCR擴(kuò)增的GFP基因片段為765 bp。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。 2.2 pDC516-CD40-IgG-GFP真核表達(dá)質(zhì)粒的成功構(gòu)建 2.2.1 pDC516-IgG的構(gòu)建：pGEM-T載體為3 000 bp的質(zhì)粒，構(gòu)建的pGEM-IgG質(zhì)粒為3 700 bp。pGEM-T質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上游110 bp處含有T7 Primer序列，用T7+mIgG-r引物組合可擴(kuò)增出約810 bp的片段，用T7 primer測(cè)序證實(shí)IgG序列的正確性。將IgG片段和pDC516線性載體進(jìn)行連接反應(yīng)，用pDC516-f測(cè)序證實(shí)IgG插入序列的正確性（見

15、圖3）。 2.2.2 pDC516-CD40-IgG的構(gòu)建：將CD40片段和pDC516-IgG線性載體進(jìn)行連接反應(yīng)，用引物pDC516-f測(cè)序證實(shí)CD40插入序列的正確性。 2.2.3 pDC516-CD40-IgG-GFP質(zhì)粒的構(gòu)建：將GFP片段和pDC516-CD40-IgG 線性載體進(jìn)行連接反應(yīng)，用pDC516-r測(cè)序證實(shí)GFP插入序列的正確性。CD40-IgG-GFP含酶切位點(diǎn)的融合產(chǎn)物為2001bp，編碼667aa（見圖4）。 2.3 重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá) pDC516-CD40-IgG-GFP質(zhì)粒抽提后在紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)到OD值為0.1257。將該質(zhì)粒用Lipofecta

16、mine 2000轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的第4天開始可見零星的細(xì)胞上有GFP表達(dá)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，GFP表達(dá)的細(xì)胞量逐漸增多，第7天左右在熒光顯微鏡下見大量的細(xì)胞有綠色熒光發(fā)生（見圖5）。 3 討論 目前控制免疫排斥主要依靠免疫抑制劑，在臨床上也取得了較好的療效，但長(zhǎng)期使用免疫抑制劑存在增加機(jī)會(huì)性感染和腫瘤的發(fā)生率等副作用。近年來，大量文獻(xiàn)報(bào)道了使用多種生物制劑預(yù)防器官移植后的排斥反應(yīng)的可行性，包括單克隆抗體、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子可溶性受體等在動(dòng)物體內(nèi)和人體實(shí)驗(yàn)中均取得一定的療效。這些制劑最大的優(yōu)點(diǎn)是能阻斷免疫反應(yīng)中的特異性步驟，減少毒副作用，導(dǎo)致人體對(duì)外源臟器的免疫耐受，但是這些生物制劑與傳統(tǒng)的免疫抑

17、制劑一樣需要終身用藥，存在免疫移植的效果不強(qiáng)等問題1。 近年來，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者已經(jīng)嘗試采用基因治療的方法來預(yù)防移植后的排斥反應(yīng)3-5。他們認(rèn)為，細(xì)胞免疫應(yīng)答是移植排斥的主要機(jī)制，而T細(xì)胞的有效活化除了需要抗原信號(hào)（第一信號(hào)）外，同時(shí)也需要第二信號(hào)的協(xié)同作用，否則T細(xì)胞將表現(xiàn)為無反應(yīng)或凋亡。因此阻斷共刺激信號(hào)途徑，防止T細(xì)胞活化，可以誘導(dǎo)免疫無能（immune anergy）。研究表明，作為共刺激通路之一的CD40/CD40L通路與B7/CD28共刺激通路相比可能起著更關(guān)鍵的作用6。 CD40為I型跨膜糖蛋白,主要表達(dá)于B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等；CD40L為33kD的II型跨膜糖

18、蛋白，主要表達(dá)于活化的CD4+T淋巴細(xì)胞，部分活化的CD8+T細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板和巨噬細(xì)胞1。研究認(rèn)為，CD40/CD40L交聯(lián)不僅能調(diào)節(jié)B細(xì)胞的活化，還能夠促進(jìn)APC細(xì)胞表達(dá)CD80、CD86等共刺激分子，這些分子與T細(xì)胞表面的配體CD28、CTLA-4結(jié)合，形成對(duì)T細(xì)胞刺激的第二信號(hào)，從而使T細(xì)胞完全活化。 因此，我們可以通過阻斷CD40/CD40L共刺激通路從而誘導(dǎo)宿主對(duì)移植物的低反應(yīng)性。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，用抗CD40L單克隆抗體阻斷CD40/CD40L之間的相互作用可以延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間7,8，但需要反復(fù)給藥以維持有效血藥濃度，并有引起血栓合并癥的危險(xiǎn)9。Nomura

19、等10在大鼠模型中單次注入CD40Ig重組腺病毒，觀察到移植肝存活時(shí)間超過300 d，并出現(xiàn)了供體特異性耐受現(xiàn)象；劉荷中等11人在移植物抗宿主?。℅VHD）小鼠中注入純化的CD40Ig融合蛋白，顯著延長(zhǎng)了小鼠的平均存活時(shí)間，提示應(yīng)用基因治療的方法阻斷CD40/CD40L通路在移植領(lǐng)域有巨大的開發(fā)前景。 我們克隆了小鼠CD40分子胞外區(qū)和IgG2a分子Fc段的cDNA，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pDC516-CD40-IgG-GFP。其真核表達(dá)載體pDC516來源于AdMax腺病毒載體包裝系統(tǒng)，該系統(tǒng)與目前使用最普及的AdEasy系統(tǒng)相比，具有效率高、有助于重組腺病毒的基因組完整性等特點(diǎn)。本質(zhì)粒的成功構(gòu)

20、建為下一步構(gòu)建腺病毒載體奠定了基礎(chǔ)，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們將構(gòu)建含小鼠CD40Ig的腺病毒注入到動(dòng)物移植模型中，使移植動(dòng)物能夠持續(xù)表達(dá)CD40Ig，從而觀察阻斷CD40/CD40L通路與誘導(dǎo)移植免疫耐受的關(guān)系，探索其潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。 【參考文獻(xiàn)】 1 Guillot C, Guillonneau C, Mathieu P,et al. Prolonged block-ade of CD40-CD40 ligand interactions by gene transfer of CD40Ig results in long-term heart allograft survival and

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22、enovirus-mediated gene transfer of viral interleukin-10 inhibits the immune response to both alloantigen and adenoviral antigenJ. Hum Gene Ther,1997,8(11):1365-1374.4 Olthoff KM,Judge TA,Gelman AE,et al. Adenovirus-medi-ated gene transfer into cold-preserved liver allografts: sur-vival pattern and u

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