第4章第1節(jié)_葉綠素熒光參數(shù)及意義-v2

1、第四章 葉綠素熒光技術應用第一節(jié) 葉綠素熒光參數(shù)及其意義韓志國，呂中賢（澤泉開放實驗室，上海澤泉科技有限公司，上海，200333）葉綠素熒光技術作為光合作用的經(jīng)典測量方法，已經(jīng)成為藻類生理生態(tài)研究領域功能最強大、使用最廣泛的技術之一。由于常溫常壓下葉綠素熒光主要來源于光系統(tǒng) II 的葉綠素 a，而光系統(tǒng) II 處于整個光合作用過程的最上游，因此包括光反應和暗反應在內(nèi)的多數(shù)光合過程的變化都會反饋給光系統(tǒng) II，進而引起葉綠素 a 熒光的變化，也就是說幾乎所有光合作用過程的變化都可通過葉綠素熒光反映出來。與其它測量方法相比，葉綠素熒光技術還具有不需破碎細胞、簡便、快捷、可靠等特性，因此在國際上得到

2、了廣泛的應用。1 葉綠素熒光的來源藻細胞內(nèi)的葉綠素分子既可以直接捕獲光能，也可以間接獲取其它捕光色素（如類胡蘿卜素）傳遞來的能量。葉綠素分子得到能量后，會從基態(tài)（低能態(tài)）躍遷到激發(fā)態(tài)（高能態(tài)）。根據(jù)吸收的能量多少，葉綠素分子可以躍遷到不同能級的激發(fā)態(tài)。若葉綠素分子吸收藍光，則躍遷到較高激發(fā)態(tài)；若葉綠素分析吸收紅光，則躍遷到最低激發(fā)態(tài)。處于較高激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，會在幾百飛秒（fs，1 fs=1015 s）內(nèi)通過振動弛豫向周圍環(huán)境輻射熱量，回到最低激發(fā)態(tài)（圖 1）。而最低激發(fā)態(tài)的葉綠素分子可以穩(wěn)定存在幾納秒（ns，1 ns=109 s）。A較高激發(fā)態(tài)B熱耗散吸收藍光吸收紅光最低激發(fā)態(tài)能量

3、熒光基態(tài)藍波長紅吸收熒光圖 1葉綠素吸收光能后能級變化（A）和對應的吸收光譜（B）（引自韓博平 et al., 2003）處于最低激發(fā)態(tài)的葉綠素分子可以通過幾種途徑（圖 2）釋放能量回到基態(tài)(韓博平 et al., 2003; Schreiber, 2004)：1）將能量在一系列葉綠素分子之間傳遞，最后傳遞給反應中心葉綠素 a，用于進行光化學反應；2）以熱的形式將能量耗散掉，即非輻射能量耗散（熱耗散）；3）放出熒光。這三個途徑相互競爭、此消彼長，往往是具有最大速率的途徑處于支配地位。一般而言，葉綠素熒光發(fā)生在納秒級，而光化學反應發(fā)射在皮秒級（ps，1 ps=1012 s），因此在正常生理狀態(tài)下

4、（室溫下），捕光色素吸收的能量主要用于進行光化學反應，熒光只占約 3%5%(Krause and Weis, 1991; 林世青 et al., 1992)。在活體細胞內(nèi)，由于激發(fā)能從葉綠素 b 到葉綠素 a 的傳遞幾乎達到 100的效率，因此基本檢測不到葉綠素 b 熒光。在常溫常壓下，光系統(tǒng) I 的葉綠素 a 發(fā)出的熒光很弱，基本可以忽略不計，對光系統(tǒng) I 葉綠素 a 熒光的研究要在 77 K 的低溫下進行。因此，當我們談到活體葉綠素熒光時，其實指的是來自光系統(tǒng) II 的葉綠素 a 發(fā)出的熒光。1第四章 葉綠素熒光技術應用圖 2 激發(fā)能的三種去激途徑（引自韓博平 et al., 2003）L

5、HC，捕光色素蛋白復合體。2 葉綠素熒光的研究歷史在 19 世紀就有了關于葉綠素熒光現(xiàn)象的記載。最初是在 1834 年由歐洲傳教士 Brewster 發(fā)現(xiàn)，當強光穿過月桂葉子的乙醇提取液時，溶液的顏色由綠色變成了紅色。1852 年 Stokes 認識到這是一種光發(fā)射現(xiàn)象，并創(chuàng)造了“fluorescence”一詞。1931 年，德國科學家 Kautsky 和 Hirsch 用肉眼觀察并記錄了葉綠素熒光誘導現(xiàn)象，明確指出暗適應處理的葉片照光后的誘導過程中，葉綠素熒光強度的變化與 CO2 固定呈相反的關系(Kautsky and Hirsch, 1931; Govindjee, 1995)，此后的

6、10 余年中，Kautsky 和他的學生 Franck 就這一現(xiàn)象作了系統(tǒng)的研究(Kautsky and Franck, 1943)。在 Kautsky 研究的基礎上，后人進一步對葉綠素熒光誘導現(xiàn)象進行了廣泛而深入的研究，并逐步形成了光合作用熒光誘導理論，被廣泛應用于光合作用研究。由于 Kautsky 的杰出貢獻，葉綠素熒光誘導現(xiàn)象也被稱為 Kautsky 效應（Kautsky Effect）。從 1960 年代到 1980 年代早期，葉綠素熒光這一生物物理學的技術被廣泛用于光合作用基礎研究，很多重要發(fā)現(xiàn)都與這一技術有關，如光合作用存在兩個光反應的提出(Duysens and Sweers,

7、1963)就是采用的這一技術應用的典型代表。但在那個年代，所有的葉綠素熒光測量都只能在完全遮蔽環(huán)境光的“黑匣子”里進行，這大大限制了葉綠素熒光技術在植物脅迫生理學、生理生態(tài)學和植物病理學等領域的應用。因此在很長一段時間中，葉綠素熒光技術在基礎研究和應用研究的使用中存在一個鴻溝。盡管如此，情況還是在逐步好轉。這是因為雖然葉綠素熒光信號雖然復雜，但確實提供了可靠的、定量的信息，并且可以由越來越小型化的儀器來進行測量。1980 年代中期，德國烏茲堡大學的 Schreiber 提出了葉綠素熒光測量的飽和脈沖理論，并發(fā)明了脈沖-振幅-調(diào)制（Pulse-Amplitude-Modulation）葉綠素熒光

8、儀(Schreiber, 1986; Schreiber et al., 1986)，也就是今天大名鼎鼎的調(diào)制葉綠素熒光儀 PAM。Schreiber 早年師從 Kautsky 的學生 Franck，在后者的指導下很早就開始進行葉綠素熒光研究(Schreiber et al., 1971; Gielen et al., 2007)，并在 1975 年就設計出了科研界第一款便攜式葉綠素熒光儀(Schreiber et al., 1975)。但受限于光電技術的發(fā)展，當時這款熒光儀只能測量葉綠素熒光誘導曲線，不能進行深入的淬滅分析，直到 PAM 的出現(xiàn)才解決了這個問題。調(diào)制葉綠素熒光儀 PAM 和調(diào)

9、制葉綠素熒光測量技術在葉綠素熒光的研究歷史上具有里程碑意義。它采用了調(diào)制技術進行測量，從而可以在有環(huán)境光照（甚至是很強的太陽光）的情況下記錄葉綠素熒光信號；2第四章 葉綠素熒光技術應用它采用了飽和脈沖技術，使得光化學淬滅和非光化學淬滅的測量成為可能。PAM 面世后，很快就替代了傳統(tǒng)的光合放氧和 CO2 同化技術，成為使用最廣泛的光合活性測量技術。早期的調(diào)制葉綠素熒光儀主要在實驗室內(nèi)進行測量，到了 1990 年代發(fā)展到可以非常方便的在野外現(xiàn)場測量。早期的儀器采用光電二極管作為檢測器，只能測量葉片或細胞濃度很高的藻液，后來采用光電倍增管后可以直接檢測大洋海水的葉綠素熒光。隨著技術的發(fā)展，陸續(xù)出現(xiàn)了

10、葉綠素熒光成像測量技術、水下原位葉綠素熒光測量技術、顯微葉綠素熒光測量技術、無線遠程葉綠素熒光測量技術和利用葉綠素對浮游植物進行分類的技術等，這些技術均在藻類學界得到了廣泛的應用。3 調(diào)制葉綠素熒光原理為了更好的理解調(diào)制葉綠素熒光，首先要知道“熒光強度（intensity）”和“熒光產(chǎn)量（yield）”的區(qū)別?！盁晒鈴姸取钡母叩鸵蕾囉诩ぐl(fā)光的強度和儀器的信號放大倍數(shù)，其變化可以達到幾個數(shù)量級的幅度。而“熒光產(chǎn)量”可以理解為固定儀器設置下的熒光強度，其變化不會超過 5-6 倍，是真正包含了光合作用信息的參數(shù)。例如針對一個暗適應處理后的樣品，照射 0.5 µmol m-2 s-1 的測量

11、光后，其熒光產(chǎn)量是非常穩(wěn)定的。假設此時儀器的增益設置為 1，熒光強度為 300 mV；當儀器的增益設置改為 3 后，熒光強度變?yōu)?900 mV。但實際上由于激發(fā)光恒定，樣品發(fā)出的熒光產(chǎn)量是恒定的，只是在不同的信號放大倍數(shù)下檢測到的熒光強度不同而已。理想的熒光儀必須能在不改變樣品狀態(tài)的情況下（即非破壞性）進行生理活性測量，需要滿足如下幾條要求(Schreiber, 1986; Schreiber et al., 1986; Schreiber, 2004)：1）測量光必須足夠低，只激發(fā)色素的本底熒光而不引起光合作用，這樣才能獲得暗適應后的最小熒光 Fo；2）測量光由一系列微秒級的光脈沖組成，這些

12、短光脈沖可以不同的頻率給出。在很低的頻率下，即使單個微秒級光脈沖的強度比較高，也不會引起光合作用；3）用反應迅速、線性范圍大的光電二極管（或光電倍增管）來檢測這些由微秒級測量光脈沖激發(fā)的微秒級熒光脈沖；4）熒光脈沖信號首先由交流耦合放大器放大，然后進一步經(jīng)選擇性鎖相放大器處理，只放大和調(diào)制測量光同頻率的熒光信號，可以有效屏蔽環(huán)境中本身就存在的與葉綠素熒光同波長的背景噪音（這就好比選擇調(diào)頻收音機的某個頻道，就可以在浩如煙海的無線電波噪音中獲得選擇性接收您需要的無線電波，采用調(diào)制技術，可以在大量的環(huán)境光背景噪音中選擇性測量葉綠素 a 發(fā)出的熒光）；5）當打開光化光或飽和脈沖時，可以自動提高測量光頻

13、率，以提高信號采點率，有效記錄一些比較快速的熒光動力學變化（如熒光快速上升動力學）。調(diào)制葉綠素熒光儀有兩大核心技術，一個是上文提到的光調(diào)制技術，有了它才能使得我們在有環(huán)境光的情況下測量葉綠素熒光；另一個就是飽和脈沖技術。所謂飽和脈沖技術，就是提供一個瞬間的強光脈沖，來暫時打斷光系統(tǒng) II 電子傳遞過程。我們已經(jīng)知道，光合機構吸收的光能有三條去激途徑：光化學反應（Photochemistry, P）、葉綠素熒光（Fluroescence, F）和熱耗散（Dissipation, D）。根據(jù)能量守恒原理，假設吸收的光能為常數(shù) 1，得到 1=P+F+D。葉綠素熒光產(chǎn)量可以測量出來，而我們希望得出 P

14、 和 D 兩個參數(shù)。根據(jù)基本的數(shù)學原理，一個等式有兩個未知數(shù)是無解的。此時如果給出一個飽和脈沖，暫時打斷光化學反應過程，則 P=0，這個等式就可以求解了。由此可知，飽和脈沖技術的基本作用就是打斷光合作用，用于求出光化學反應和熱耗散分別用去了多少能量。早期，科研人員只能通過人為加入農(nóng)藥敵草隆（DCMU）來阻斷光系統(tǒng) II 的電子傳遞過程，從而獲得最大熒光 Fm，而這是不可逆的。后來，Schreiber 在“光強倍增”技術(Bradbury and Baker, 1981; Quick and Horton, 1984)的基礎上提出了“飽和脈沖”技術(Schreiber et al., 1986)

15、。飽和脈沖技術的最大優(yōu)點在于，它是暫時阻斷光系統(tǒng) II 的電子傳遞過程，由于持續(xù)時間很短（一般 0.2-1.5 s），因此飽和脈 沖關閉后光合電子傳遞會在極端的時間內(nèi)恢復運轉。所以說這是一種可逆的過程，正是有了飽和脈沖技術，我們才能不破3第四章 葉綠素熒光技術應用壞樣品的完整性就獲得其光合生理參數(shù)。4 葉綠素熒光誘導曲線和典型參數(shù)從 Kautsky 發(fā)現(xiàn)葉綠素熒光誘導現(xiàn)象并提出其與光合作用的關系后，80 多年來利用葉綠素熒光研究光合作用采用的最主要技術就是熒光誘導曲線。那么什么是葉綠素熒光誘導曲線呢？測量葉綠素熒光誘導曲線能獲得哪些生物信息呢？所謂葉綠素熒光誘導，就是將樣品在黑暗的狀態(tài)下適應一

16、段時間，然后照射光化光，觀察樣品的光合機構從暗轉到光下的響應過程。為什么要暗適應呢？在光合電子傳遞鏈上有一個叫做質(zhì)體醌（PQ）的載體，是整個電子傳遞過程的限速步驟，可以通俗的稱之為電子門。在光合膜上 PQ 的數(shù)量與捕光色素吸收的光子數(shù)（微摩爾級）相比是微不足道的。因此光合作用進行時，光系統(tǒng) II 釋放出的電子總是有部分會累積在電子門 PQ 處，這部分處于還原態(tài)（累積電子）的電子門就處于關閉態(tài)，或者說光系統(tǒng) II 的反應中心處于關閉態(tài)。在暗適應過程中，光系統(tǒng) II 無法獲得光能激發(fā)，因此不會繼續(xù)釋放電子，累積在 PQ 處的電子會繼續(xù)往光系統(tǒng) I 傳遞，直到所有電子都傳遞完畢。當 PQ 處不再累積

17、電子后，暗適應就足夠了。暗適應結束后，就可以照光進行熒光誘導了。那么采用什么光進行誘導呢？只要能夠引起光合作用的光也就是波長在 400-700 nm 的可見光，都可以進行熒光誘導，我們給它一個專業(yè)術語叫做光化光（Actinic Light），也有人翻譯為作用光。在光合作用領域，400-700 nm 的光也被稱為光合有效輻射（Photosynthetic Active Radiation, PAR）。光化光可以為人工光，如來自日光燈、鹵素燈或發(fā)光二極管的光，也可以為自然光（直接或間接的太陽光）。但為了使我們的實驗具有可重復性，多數(shù)熒光誘導的測量會采用儀器提供的恒定光強的人工光（新型儀器多以光強穩(wěn)

18、定的發(fā)光二極管為主）來誘導。只有保證測量條件一致，才能對不同材料或不同處理的樣品進行直接比較。圖 3 葉綠素熒光誘導曲線（韓志國 and 呂中賢，未發(fā)表數(shù)據(jù)）SP，飽和脈沖（Saturation Pulse）；AL，光化光（Actinic Light）。Fo，最小熒光；Fm，最大熒光。整個測量過程中調(diào)制測量光需要一直打開。圖 3 是一條典型的葉綠素熒光誘導曲線，其測量步驟如下：1） 樣品首先暗適應處理一段時間，以便累積在 PQ 處的所有電子都被傳走，光系統(tǒng) II 的所有反應中心都處于開放態(tài)。然后打開測量光（Measuring Light, ML），記錄暗適應后的最小熒光 Fo。測量光很弱（一般

19、小于 1 mol m-2 s-1），只激發(fā)色素的本底熒光但不足以引起任何的光合作用。4第四章 葉綠素熒光技術應用2） 緊接著打開一個持續(xù)時間僅有 0.2-1.5 s 的飽和脈沖（Saturation Pulse，SP），測量暗適應后的最大熒光 Fm。飽和脈沖打開后，由光系統(tǒng) II 處釋放的電子迅速將 PQ 全部還原（電子門全部關閉），光化學反應被打斷，光能全部轉化為葉綠素熒光和熱量，熒光迅速達到最大值 Fm。飽和脈沖的強度非常強，高等植物一般要求達到 8000-10000 mol m-2 s-1，藻類一般大于 4000mol m-2 s-1 即可。3） 飽和脈沖關閉后熒光迅速回到 Fo 附近，

20、然后打開光化光（Actinic Light，AL），記錄葉綠素熒光從黑暗轉到光照的響應過程。如上所述，光合作用進行時，總是有部分電子門處于關閉態(tài)。這部分處于關閉態(tài)的電子門本應用于光合作用的能量就轉化為了葉綠素熒光和熱。飽和脈沖關閉后，電子門迅速全部打開。此時打開光化光，光系統(tǒng) II 瞬間釋放出大量電子，導致許多電子門被關閉，因此實時熒光迅速上升。此時，光合器官會迅速啟動調(diào)節(jié)機制來適應這種光照狀態(tài)，光系統(tǒng) I 逐漸從 PQ 處獲取電子。在恒定的光化光強度下，PS II 釋放的電子數(shù)是恒定的，因此隨著時間的延長，處于關閉態(tài)的電子門越來越少，熒光逐漸下降并達到穩(wěn)態(tài)。此時，處于關閉態(tài)的電子門數(shù)量達到動態(tài)平衡，也就是說光系統(tǒng) II 和光系統(tǒng) I 達到了動態(tài)平衡。4） 等熒光曲線達到穩(wěn)態(tài)后關閉光化光，并結束整個測量過程。有時，為了精確的獲得 Fo這個參數(shù)，會在關閉光化光的同時打開一個持續(xù)幾秒的遠紅光（Far-red Light, FL）（圖 3 中未示出），以加快電子從 PQ 向光系統(tǒng) I 的傳遞。根據(jù)圖 3 中的 Fo 和 Fm，可以計算出光系統(tǒng)