肌鈣蛋白I的生化特點(diǎn)及其影響測定的因素

1、肌鈣蛋白I的生化特點(diǎn)及其影響測定的因素肌鈣蛋白I的生化特點(diǎn)及其影響測定的因素上海醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)院潘柏申關(guān)鍵詞肌鈣蛋白（cTn ）心肌損傷測定標(biāo)準(zhǔn)化隨著研究和應(yīng)用的發(fā)展，心肌肌鈣蛋白（cTn ）包括心肌肌鈣蛋白I （cTnl）和心肌肌鈣蛋白T（cTnT）已成為臨床診斷心肌損傷的確定標(biāo)志物1,2。由于僅一家生產(chǎn)廠商擁有cTnT生產(chǎn)專利，因此人們對cTnl的生產(chǎn)應(yīng)用興趣大增。目前FDA至少已批準(zhǔn)8家生產(chǎn)廠商的共16種cTnl檢測試劑。在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，這些cTnl檢測試劑的測定值之間存在著差異，不同的cTnl分析方法對同一份標(biāo)本的檢測值最大可相差30余倍4，這使得各種方法的參考范圍、分析干擾、分析變

2、異、診斷窗口期以及診斷和預(yù)后的臨界值等岀現(xiàn)不同程度的差別， 給臨床應(yīng)用和評價(jià)帶來一定困擾。了解cTn特別是cTnl的系列化特別和各種分析測定試劑的特性，將有助于臨床上正確使用這些方法檢測和評價(jià)心肌缺血損傷。1心肌肌鈣蛋白細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和分布1.1心肌肌鈣蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) cTn由三種亞基組成，參與調(diào)節(jié)肌肉收縮活動(dòng)。 其中的肌鈣 蛋白C（TnC）是Ca2+結(jié)合亞基，分子量18kDa，等電點(diǎn)4.1 ； cTnl為抑制亞基，分子量23kDa， 等電點(diǎn)9.87 ; cTnT為原肌球蛋白結(jié)合亞基，分子量 34kDa，等電點(diǎn)5.15。在Ca2+存在的情況下，TnC與Ca2+結(jié)合后構(gòu)型發(fā)生變化，與 cTnl的結(jié)合增

3、強(qiáng)（Ka約 為1.5 X10-8 m-1 ） 5; TnT與TnC -cTnl結(jié)合，但較 TnC -cTnl之間的結(jié)合弱。反之， Ca2+ 濃度低或TnC未與Ca2+結(jié)合時(shí)，TnC和cTnl之間的結(jié)合比較松散。 cTnl-cTnT的結(jié)合相對 較弱（Ka 約為 1.5 X10-5 M-1） 5。1.2心肌肌鈣蛋白的組織含量在心肌內(nèi)cTnl的含量大約為 5mg/g濕重組織，cTnT的含量大致為10.8mg/g濕重組織（相比之下， CK-MB僅1.4mg/g濕重組織 ；cTn主要結(jié)合 于心肌肌纖維中，少量（cTnl的2.8%4.1% ; cTnT的6%8%）在細(xì)胞漿中以游離形 式存在7。這與心肌細(xì)胞

4、缺血損傷后的釋放方式密切有關(guān)。1.3釋放形式 心肌細(xì)胞損傷后，游離cTnT較早釋放形成第一個(gè)峰，隨后結(jié)合于肌纖維中的cTnT逐漸釋放而岀現(xiàn)第二個(gè)峰；由于細(xì)胞液中的含量較少，cTnl釋放通常只有一個(gè)峰8 ocTn 般在心肌損傷后 58h外周血中岀現(xiàn)增高，最高值在1224h,增高可持續(xù)7 10 天（cTnl ）或 10 14 天（cTnT ）。1.4外周血中存在形式外周血中的cTn究竟是以復(fù)合物還是游離形式存在，曾有過許多結(jié)果不同的研究報(bào)道?，F(xiàn)在多認(rèn)為，cTn釋放主要是以 TnC - cTnl - cTnT復(fù)合物形式，隨后降解9。外周血中的cTnl既有游離形式，又有不同復(fù)合物的形式（ cTnl -

5、 TnC、cTnl -cTnT以及cTnT - cTnl - TnC ） 10。在AMI病人中以cTnl - TnC復(fù)合物形式居多數(shù) （90% 以上）4' 10，cTnl - cTnT復(fù)合物僅在不到50%病人的血中被發(fā)現(xiàn)，而且其中的cTnl僅占部cTnl的5%以下11，因此檢測重要性遠(yuǎn)不如cTnl - TnC復(fù)合物；其他形式的cTnl較少10；cTnT游離形式較多見9 o肌鈣蛋白I的生化特點(diǎn)及其影響測定的因素1.5抗體識(shí)別位點(diǎn)（抗原決定簇）不同亞基復(fù)合物的形式使得一種抗cTnl的抗體不能識(shí)別另一結(jié)構(gòu)形式 cTnl的抗原決定簇。有的單克隆cTnl的抗體識(shí)別游離形式cTnl的能力較強(qiáng)；有些

6、則主要以識(shí)別 TnC - cTnl復(fù)合物形式為主4。這使得采用不同抗體的各種試劑檢 測同一標(biāo)本時(shí)岀現(xiàn)檢測結(jié)果不同的現(xiàn)象。2心肌肌鈣蛋白I的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)展，AMl的心肌壞死組織培養(yǎng) 3h后，cTnl的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)都岀現(xiàn)了程度不等的變化12。2.1蛋白水解酶作用 研究發(fā)現(xiàn)，AMl后若血運(yùn)未重新建立，心肌細(xì)胞在3060min內(nèi)壞死，壞死細(xì)胞的溶酶體可釋放多種蛋白水解酶。cTnl較不穩(wěn)定，易受蛋白水解酶作用，在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)迅速降解，但其不同部分受影響的程度有差別。cTnl的中心區(qū)域（第 28位和第110位氨基酸）穩(wěn)定生明顯較高（可能是受TnC的保護(hù)作用）；氨基病和羧

7、基端則對蛋白水解酶作用敏感12。氨基端水解后降解形成-14kDa的片段；羧基端則降解形成-18kDa的片段13。因此，欲提高檢測敏感性和可重復(fù)性，抗體的識(shí)別位點(diǎn)最好位于cTnl的中心區(qū)域。2.2蛋白激酶A磷酸化cTnl的第22位和第23位的絲氨酸易受蛋白激酶A作用發(fā)生磷酸化反應(yīng)14，使cTnl形成四種形式：一種未磷酸化、兩種單磷酸化和一種雙磷酸化結(jié)構(gòu)。 研究發(fā)現(xiàn)，病人體內(nèi)磷酸化形式的cTnl占相當(dāng)數(shù)量。磷酸化可改變cTnl的分子結(jié)構(gòu)形式和抗原性，從而影響某些抗體的識(shí)別15。2.3氧化還原形式 cTnl的第79位和第96位是半胱氨酸，容易發(fā)生氧化或還原反應(yīng)。 這種氧化或還原反應(yīng)了可影響 cTnl

8、的分子結(jié)構(gòu)形式和抗原性，從而影響某些抗體的識(shí)別能 力。3測定校準(zhǔn)品各生產(chǎn)廠商的cTnl校準(zhǔn)品內(nèi)含的cTnl結(jié)構(gòu)形式或含量各不相同，使得測定結(jié)果大相徑庭。甚至使用同一份標(biāo)定cTnl值的人血清進(jìn)行校準(zhǔn)也未能完全消除不同測定系統(tǒng)之間測定值的差異16。因此，有人提議最好采用從人心組織提取的cTnl - cTnT - CTnC復(fù)合物作為校準(zhǔn)品12。4抗凝劑為縮短檢測周轉(zhuǎn)時(shí)間（TAT ），許多檢測方法要求采用血漿或全血，以避免分離血清 所需的時(shí)間。這需要合理選擇適當(dāng)?shù)目鼓铩?.1 EDTA EDTA 是Ca2+螯合劑，可促使 cTnl - TnC復(fù)合物的解離，使游離型cTnl增加，從而影響測定值的真實(shí)性。因此，有些專家認(rèn)為最好避免使用2。4.2肝素cTnl帶有較多正電荷（pl 9.87 ） 5,易于和帶有負(fù)電荷的基團(tuán)形成復(fù)合物。肝素帶有負(fù)電荷，與cTnl結(jié)合形成的復(fù)合物可影響抗原一抗體反應(yīng)，進(jìn)而引起cTnl檢測值降低。但在不同的cTnl檢測試劑中，肝素的干擾程度不等17。為使cTnl的測定更加準(zhǔn)確，以便為臨床提供更加科學(xué)、可靠的