微生物的計(jì)數(shù)——血球計(jì)數(shù)板法

1、微生物得計(jì)數(shù)一一血球計(jì)數(shù)板法【摘要】 測(cè)定微生物細(xì)胞數(shù)量得方法很多，有分光光度法、顯微直接計(jì)數(shù)法 與平板計(jì)數(shù)法。分光光度法比較簡(jiǎn)便，易操作，但就是會(huì)使數(shù)據(jù)嚴(yán)重偏大。而平 板計(jì)數(shù)法則會(huì)使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)嚴(yán)重偏小.？ 顯微計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體 得純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，常不易分辨.菌體較大得酵母菌或霉菌抱子可 采用血球計(jì)數(shù)板，一般細(xì)菌則采用彼得羅夫霍澤（Pet r o f Hauss e r）細(xì)菌 計(jì)數(shù)板。兩種計(jì)數(shù)板得原理與部件相同，只就是細(xì)菌計(jì)數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計(jì)數(shù)板下部得細(xì)菌不易瞧滿.本實(shí)驗(yàn)采 用血球計(jì)數(shù)板法，主要目得就是了解血球計(jì)數(shù)板法得構(gòu)造與

2、使用方法， 學(xué)會(huì)用血 球計(jì)數(shù)板對(duì)酵母菌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康门c要求1、了解微生物計(jì)數(shù)常用得三種方法：分光光度法；平板計(jì)數(shù)法；血球計(jì)數(shù)板法。2、了解血球計(jì)數(shù)板得構(gòu)造與使用方法。3、學(xué)會(huì)用血球計(jì)數(shù)板對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。二、基本原理利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，就是一種常用得微生物計(jì)數(shù)方法。此 法得優(yōu)點(diǎn)就是直觀、快速.將經(jīng)過適當(dāng)稀釋得菌懸液（或抱子懸液）放在血球計(jì) 數(shù)板載玻片與蓋玻片之間得計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室得容積 就是一定得（0、1mn2）,所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到得微生物數(shù)目來?yè)Q算 成單位體積內(nèi)得微生物總數(shù)目。由于此法計(jì)得得就是活菌體與死菌體得總與， 故 又稱為總

3、菌計(jì)數(shù)法.血球計(jì)數(shù)板，通常就是一塊特制得載玻片，具上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)。中間 得平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊得平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng) ，每個(gè)方格網(wǎng) 共分九個(gè)大方格，中問得大方格即為計(jì)數(shù)室，微生物得計(jì)數(shù)就在計(jì)數(shù)室中進(jìn)行。計(jì)數(shù)室得刻度一般有兩種規(guī)格，一種就是一個(gè)大方格分成1 6個(gè)中方格， 而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格；另一種就是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而 每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格。但無論就是哪種規(guī)格得計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中得小方格數(shù)都就是相同得，即1 6 X 25=400小方格。A.正1 Hr16X25和25X16睥種模耕實(shí)蕤圖 6血球計(jì)效板的構(gòu)造每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為1 mm則每一大

4、方格得面積為1 m吊，蓋上蓋玻片后, 載玻片與蓋玻片之間得高度為 0.1mm所以計(jì)數(shù)室得容積為0 .1 mm30在計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格得總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格得平均值，再 乘上16或25,就得出一個(gè)大方格中得總菌數(shù)，然后再換算成 1ml菌液中得總菌 數(shù).下面以一個(gè)大方格有2 5個(gè)中方格得計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行計(jì)算： 設(shè)五個(gè)中方格中總菌數(shù)為A,菌液稀釋倍數(shù)為B,那么，一個(gè)大方格中得總菌數(shù)一.3 3因 1ml=1cm = 1000mm,= 50 0 0 0A B （個(gè)）同理，如果就是16個(gè)中方格得計(jì)數(shù)板，設(shè)五個(gè)中方格得總菌數(shù)為 A',則三、實(shí)驗(yàn)材料1）菌種：釀酒酵母菌2）用品：顯微鏡、血球

5、計(jì)數(shù)板、酒精燈、蓋玻片、接種環(huán)、番紅染液、膠 頭滴管。四、實(shí)驗(yàn)方法1、實(shí)驗(yàn)流程圖制備稀釋液一加樣一找計(jì)數(shù)室一計(jì)數(shù)2、實(shí)驗(yàn)步驟1）鏡檢計(jì)數(shù)室：在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板得計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物 ，則需清洗 后才能進(jìn)行計(jì)數(shù).2）將釀酒酵母菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，菌液如不濃 ，可不必稀釋。3）取潔凈得血球計(jì)數(shù)板一塊，在計(jì)數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。然后在顯微鏡下 找到計(jì)數(shù)室。若計(jì)數(shù)室沾有雜質(zhì)或者菌體，要用蒸儲(chǔ)水沖洗計(jì)數(shù)板 ，用濾紙吸干 其上得水分。然后再放到顯微鏡下找到計(jì)數(shù)室。4）將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)兩側(cè)得溝槽內(nèi)沿蓋 玻片得下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體得表面張力充滿

6、計(jì)數(shù) 區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出得多余菌懸液.5）靜置片刻，先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計(jì)數(shù)。由于生 活細(xì)胞得折光率與水得折光率相近，觀察時(shí)應(yīng)減弱光照得強(qiáng)度.6）計(jì)數(shù)時(shí)若計(jì)數(shù)區(qū)就是由16個(gè)大方格組成，按對(duì)角線方位，數(shù)左上、左下、 右上、右下得4個(gè)大方格（即100小格）得菌數(shù)。如果就是25個(gè)大方格組成得計(jì) 數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個(gè)大方格外，還需數(shù)中央l個(gè)大方格得菌數(shù)（即80個(gè)小格）。 如菌體位于大方格得雙線上，計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線不數(shù)下線 ，數(shù)左線不數(shù)右線，以減 少誤差.本實(shí)驗(yàn)采用2 5格X 1 6格得血球計(jì)數(shù)板。計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)數(shù)5個(gè)大方格。7 ）計(jì)數(shù).每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)2 3次（每

7、次數(shù)值不應(yīng)相差過大，否則應(yīng)重新操 作），求出每一個(gè)小格中細(xì)胞平均數(shù)（N）,按公式計(jì)算出每 ml（ g）菌懸液所含酵 母菌細(xì)胞數(shù)量。8 ）測(cè)數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計(jì)數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹 擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，放入盒內(nèi)保存.9）計(jì)算結(jié)果。可用以下公式進(jìn)行計(jì)算(1)1 6格X25格得血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：堂田胞數(shù)/ml= 1 00小格內(nèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)/100X40 0 X 100 00X稀釋倍數(shù)(2) 25格X 16格得血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：細(xì)胞數(shù)/ml= 8 0小格內(nèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)/80 X40 0 X 1000 0X稀釋倍數(shù)五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì) 算 次 數(shù)各大格中細(xì)胞

8、數(shù)大格中 細(xì)胞總 數(shù)稀釋 倍數(shù)總菌數(shù)(CFU/mL 或g)左上右上左下右下中問弟一次323 749 600 0 0000六、結(jié)論與分析1、誤差來源本次試驗(yàn)中我們組用得就是2號(hào)酵母培養(yǎng)液，就是本次試驗(yàn)所用得酵母培養(yǎng)液中 濃度最高得培養(yǎng)液。但就是經(jīng)過老師分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)仍然偏大得一點(diǎn).產(chǎn)生這種誤 差得原因大概如下：酵母細(xì)胞計(jì)數(shù)得誤差分別來源于技術(shù)誤差與固有誤差.其中由于操作人員 不注意細(xì)節(jié)，器材處理、使用不當(dāng)，稀釋不準(zhǔn)確 ，細(xì)胞識(shí)別錯(cuò)誤等因素所造成得 誤差屬技術(shù)誤差；而由于儀器(計(jì)數(shù)板、蓋片、吸管等)不夠準(zhǔn)確與精密帶來得誤 差稱儀器誤差，由于細(xì)胞分布不均勻等因素帶來得細(xì)胞計(jì)數(shù)誤差屬于分布誤差或 計(jì)數(shù)

9、域誤差()。由于時(shí)間得關(guān)系，實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)得次數(shù)太少，難以得到準(zhǔn)確均勻得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 在實(shí)驗(yàn)過程中，操作人員也存在一定得不嚴(yán)謹(jǐn)性，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生誤差。由于沒 有足夠多得平行數(shù)據(jù)，難以用科學(xué)得計(jì)數(shù)方法進(jìn)行結(jié)果得計(jì)算，因此難以得到比 較準(zhǔn)確得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。因此，搞好酵母細(xì)胞計(jì)數(shù)得質(zhì)量控制一般需采用以下措施。1?）避免技術(shù)誤差，糾正儀器誤差？®所用器材均應(yīng)清潔干燥，計(jì)數(shù)板、血蓋片、微量吸管及 刻度吸管得規(guī)格應(yīng)符合要求或經(jīng)過校正。嚴(yán)格操作，從消毒、稀釋、加樣到計(jì)數(shù)都應(yīng)規(guī)范，尤其應(yīng)注意得就是樣品稀釋 要作到充分混勻.必須一次性充滿計(jì)數(shù)室，防止產(chǎn)生氣泡，充入細(xì)胞懸液得量以不超過計(jì)數(shù)室臺(tái)面與蓋玻片之間得矩形

10、邊緣為宜。 2?）縮小計(jì)數(shù)域誤差或分布誤差由于血細(xì)胞在充入計(jì)數(shù)室后呈隨機(jī)分布或，而我們所能計(jì)數(shù)得細(xì)胞分布范圍就 是有限得，由此造成得計(jì)數(shù)誤差稱為計(jì)數(shù)域誤差或分布誤差?？s小這種誤差得有 效方法就就是盡量擴(kuò)大細(xì)胞計(jì)數(shù)范圍與計(jì)數(shù)數(shù)目，一般先進(jìn)行誤差估計(jì)，然后決 定所需計(jì)數(shù)得數(shù)目與計(jì)數(shù)范圍，只要能將誤差控制在允許范圍內(nèi)即可。2、不足之處血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接進(jìn)行測(cè)定。它觀察在一定得容積中得微生物得 個(gè)體數(shù)目，然后推算出含菌數(shù)，簡(jiǎn)便快捷。但就是在計(jì)數(shù)時(shí)包括死活細(xì)胞均被計(jì) 算在內(nèi)，還有微小雜物也被計(jì)算在內(nèi).這樣得出結(jié)果往往偏高，因此適用于對(duì)形態(tài) 個(gè)體較大得菌體或抱子進(jìn)行計(jì)數(shù)。七、思考題1、試述血球計(jì)數(shù)板得計(jì)數(shù)原理。為什么用兩種規(guī)格不同得計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)同一樣品， 結(jié)果就是一樣得？答:每塊計(jì)數(shù)板由H形凹槽分為2個(gè)同樣得計(jì)數(shù)池 計(jì)數(shù)池兩側(cè)各有一支持 柱，將特制得專用蓋玻片覆蓋其上，形成高0、10m m得計(jì)數(shù)池。計(jì)數(shù)池畫有長(zhǎng)、 寬各3、0 mn#方格，分為9個(gè)大方格，每個(gè)大格面積為 1、0mm;容積為0、 1mm,中央大方格用雙線分成25個(gè)中方格，位于正中及四角5個(gè)