兔軟骨細(xì)胞的分離

1、最新資料推薦兔軟骨細(xì)胞的別離兔軟骨細(xì)胞的別離目的 探討兔軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法.方法 采用膠原酶II分段消化法從 4周齡新西蘭兔的關(guān)節(jié) 軟骨中別離出軟骨細(xì)胞并進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng).每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及其生長(zhǎng)情況.并用甲苯胺藍(lán)異染色進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定.結(jié)果軟骨細(xì)胞形成單層的時(shí)間原代培養(yǎng) 1周左右,傳代培 養(yǎng)約45天,細(xì)胞以圓形或上皮樣細(xì)胞形態(tài)為主.甲苯胺藍(lán)染色證實(shí)細(xì)胞可合成蛋白多糖,異染反響主要集中在細(xì)胞集落樣生長(zhǎng)區(qū),異染程度以原代培養(yǎng)最為顯著.結(jié)論 采用本方法培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞是可行的.軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨破壞過(guò)程中的靶細(xì)胞,研究靶細(xì)胞的變 化是探索關(guān)節(jié)軟骨破壞、病理和治療的重要方法 ,本實(shí)驗(yàn)的目

2、的是建 立體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)體系,為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造條件.1 材料與方法13 動(dòng)物：4周齡健康新西蘭兔.14 軟骨細(xì)胞的別離和培養(yǎng)141軟骨細(xì)胞的別離步驟：I)一只健康4周齡新西蘭兔脫頸處死,備皮,用碘酊酒精背部皮膚消毒 無(wú)菌 操作沿背部中線剪開(kāi)并剝離皮膚,更換手術(shù)器械及手套,以 防碘酊等有機(jī)物污染.(30min) II)游離并用骨剪截取膝關(guān)節(jié),置入無(wú)菌平皿,帶入超凈工作臺(tái)III) 在超凈工作臺(tái)作如下操作：1)先用雙抗的pbs充分漂洗,直到?jīng)]有碘伏的顏色(5min),離斷眼韌帶,內(nèi)外側(cè)副韌帶以及前后交叉韌帶,切開(kāi)膝關(guān)節(jié),刮除關(guān)節(jié)周圍附著的組織如肌肉、脂肪、骨膜、滑膜,pbs液充分漂洗.2) 用尖刀

3、片充分利用軟骨的彈性,削下每個(gè)關(guān)節(jié)外表的軟骨,不要誤帶軟骨下骨和骨膜,一般以不滲血為度.3) 充分漂洗軟骨小塊,更換洗液3次 4) 用眼科小剪刀剪碎至1 mm3大小,用小刮匙把軟骨小塊轉(zhuǎn)移至小錐形瓶中.5) 參加02%1型膠原酶5 ml,置磁力攪拌器上 37c消化45 min,將游離出的帶有酶溶液的軟骨細(xì)胞用懸液吸管吸出,120目尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾.6) 所得濾液放入一無(wú)菌離心管內(nèi),1200 r/min 離心8 min,棄上清, 參加5 ml含有血清的DMEM培養(yǎng)液混勻以終止消化.7) 1200 r/min 離心5 min,棄去上清液,只留下細(xì)胞球,并 參加少量含有血清的培養(yǎng)液吸打后先封口置放.8)

4、 原消化瓶中再參加02%1型膠原酶5 ml,如前法消化45 min,消化后的處理同上.9) 然后把2次消化所得的軟骨細(xì)胞懸液合并在一起,臺(tái)盼 藍(lán)染色檢查死亡細(xì)胞比例,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),并把細(xì)胞懸液稀釋成(23)105 細(xì)胞/ml,接種于培養(yǎng)瓶中.142原代培養(yǎng)：I)將消化所得的細(xì)胞懸液以(2-3)105 最新資料推薦細(xì)胞/ml接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,共 接種3瓶,每瓶加5 ml 的細(xì)胞懸液.II) 把培養(yǎng)瓶置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度37C,飽和濕度,5%CO2, 95% 氣).III) 48 h后視細(xì)胞貼壁情況更換培養(yǎng)液,以后每?jī)商旄鼡Q培養(yǎng)液1次.143 傳代培養(yǎng)：I)當(dāng)?shù)怪蔑@微鏡觀察軟骨

5、細(xì)胞集合成片,長(zhǎng)滿大局部培養(yǎng)瓶壁后,傾去培養(yǎng)液,參加025%夷蛋白酶2 ml,室溫下靜置510 min, II)在倒置顯微鏡下假設(shè)觀察到細(xì)胞重新變成圓形,個(gè)別細(xì)胞開(kāi)始浮游,此時(shí)應(yīng)迅速而輕柔地棄去胰蛋白酶溶液而不使瓶?jī)?nèi)幕胞隨胰蛋白酶溶液流失.III)重新參加新培養(yǎng)液,吹打細(xì)胞使其散開(kāi)形成軟骨細(xì)胞懸液,按前述方法分瓶 培養(yǎng)或凍存以備用.144 軟骨細(xì)胞的組織化學(xué)染色鑒定：I) 傾去培養(yǎng)瓶中 的培養(yǎng)液后用生理鹽水漂洗,置入10%中性福爾馬林中固定 過(guò) 夜.II) 70% 乙醇固定20 min以除去四價(jià)鏤離子,以免阻礙染 色.用004%甲苯胺藍(lán)染色20 min,迅速用無(wú)水乙醇漂洗1次,空氣枯燥,倒置顯

6、微鏡下觀察攝影.2 結(jié)果 21倒置顯微鏡觀察：I)別離培養(yǎng)的原代軟骨細(xì)胞呈圓球形,臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)示活細(xì)胞率約 90溢右.II) 懸浮12 h逐漸開(kāi)始貼壁,24 h后大局部貼壁,首先細(xì) 胞伸出短小的生長(zhǎng)突, 呈扇形；扇形生長(zhǎng)突不斷擴(kuò)大,細(xì)胞的兩 側(cè)或三邊都可伸出生長(zhǎng)突.III) 此時(shí)細(xì)胞在倒置顯微鏡下呈片狀貼附,形態(tài)呈梭形、或三角形、或多角形,胞漿內(nèi)可見(jiàn)折光的顆粒,周圍有細(xì)長(zhǎng)的突起,胞核明顯呈圓形或橢圓形,核仁清楚,原代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞7天即可 長(zhǎng)滿瓶壁,局部區(qū)域呈多層生長(zhǎng).IV) 在集落生長(zhǎng)區(qū)和多層生長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞被分泌的基質(zhì)所包埋,形成肉眼可見(jiàn)的結(jié)節(jié)樣組織.V) 傳代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞一般24 h即可完

7、全貼壁,細(xì)胞伸出 偽足,充分鋪展.VI) 傳一代的軟骨細(xì)胞5天左右即可形成單層,細(xì)胞仍以圓類、類上皮細(xì)胞樣外觀為主.VII) 隨著傳代次數(shù)的增加,細(xì)胞中梭形細(xì)胞增多,分泌和增殖水平下降,傳代周期延長(zhǎng).22甲苯胺藍(lán)染色形態(tài)學(xué)觀察：I)原代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)7天后染色見(jiàn)：?jiǎn)螌由L(zhǎng)區(qū)和多層生長(zhǎng)區(qū)域細(xì)胞正染成淺藍(lán)色,有23個(gè)核仁,核仁呈紫藍(lán)色.集落樣生長(zhǎng)區(qū)和多層生長(zhǎng)區(qū)的中央局部細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)異染成 紫紅色,細(xì)胞核正染成深藍(lán)色,而其邊緣部位異染不及中央?yún)^(qū)域.II)細(xì)胞經(jīng)屢次傳代后主要以單層生長(zhǎng)方式為主,甲苯胺藍(lán)最新資料推薦染色以正染淺藍(lán)色為主.許多細(xì)胞呈核負(fù)染,說(shuō)明軟骨細(xì)胞分泌的蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)與

8、細(xì)胞傳代次數(shù)有關(guān).3. 考前須知i.軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的唯一細(xì)胞成分,只要很好地進(jìn)行機(jī)械解離和化學(xué)解離,注意原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的方法,就能很好地進(jìn)行軟骨細(xì)胞的別離和培養(yǎng).ii. 機(jī)械解離非常重要,往往決定實(shí)9是否成功,解離時(shí)不要誤帶軟骨以外的組織,盡可能把軟骨切碎至小于1mm3大小.iii. 化學(xué)解離主要是用酶法解離,注意消化時(shí)間,時(shí)間太短軟骨細(xì)胞不能充分游離,影響軟骨細(xì)胞的收獲量；時(shí)間太長(zhǎng)死亡的軟骨細(xì)胞數(shù)就會(huì)增多,同樣影響軟骨細(xì)胞的收獲量,不利于培養(yǎng).iv. 換培養(yǎng)液時(shí)間一般來(lái)講,生長(zhǎng)良好的細(xì)胞約兩天左右應(yīng) 更換一次培養(yǎng)液,要特別注意培養(yǎng)液的pH值變化,pH值低于64時(shí)軟骨細(xì)胞會(huì)發(fā)生死亡.

9、v. 常規(guī)的培養(yǎng)方法操作步驟較多,且需要多種酶消化,增加了細(xì)胞污染的可能性4-6.我們的方法是單用n型膠原酶分階段進(jìn)行消化 ,每次消化45 min, 收集一次細(xì)胞,并盡快加含有血清的培養(yǎng)液來(lái)終止消化,并加血清培 養(yǎng)液保護(hù).經(jīng)過(guò)二次45 min消化根本上可完全收獲細(xì)胞.vi. vii. viii. ix. x.然后把二次消化的細(xì)胞集中在一起計(jì)數(shù),分瓶培養(yǎng).由于膠原酶接觸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)軟骨細(xì)胞有毒性作用,所以不能一次 消化23 h或57 h才收獲細(xì)胞.和大多數(shù)軟骨細(xì)胞一樣,兔軟骨細(xì)胞最適pH值為74,所以要經(jīng) 常檢查培養(yǎng)液的pH值,如培養(yǎng)液變黃要及時(shí)換培養(yǎng)液.培養(yǎng)液放置于冰箱中保存后常偏堿性,要用鹽酸

10、及時(shí)調(diào)整.在軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中始終要預(yù)防污染,注意無(wú)菌操作.軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中有兩種轉(zhuǎn)歸 ：一是繼續(xù)維持表型,具 有分泌H型膠原纖維和硫酸軟骨素蛋白CSPG羽水平；二是發(fā)生反分 化,細(xì)胞不僅形態(tài)發(fā)生改變,而且所分泌的膠原纖維不再是H型而成 為I型,CSPG的合成水平也隨之喪失7.我們根據(jù)軟骨細(xì)胞的表型鑒定,認(rèn)為三代以內(nèi)的軟骨細(xì)胞活性較 高,保持軟骨細(xì)胞的表型,是實(shí)驗(yàn)研究的理想細(xì)胞.三代以后的軟骨細(xì)胞逐漸發(fā)生反分化,細(xì)胞體積增大,出現(xiàn)許多指狀突起,胞核增大,細(xì)胞增殖速度明顯減慢,可作為軟骨細(xì)胞退行變的研究模型.所以研究藥物的最正確反響和組織工程軟骨最好選用三代以內(nèi)的軟骨細(xì)胞.一、臺(tái)盼藍(lán)染色：如果細(xì)胞膜不完整、破裂,臺(tái)盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞,細(xì)胞變藍(lán),即 為壞死.如果細(xì)胞膜完整,細(xì)胞不為臺(tái)盼藍(lán)染色,那么為正常細(xì)胞或凋亡細(xì)最新資料推薦此方法對(duì)反映細(xì)胞膜的完整性,區(qū)別壞死細(xì)胞有一定的幫助.用品：1.4%臺(tái)盼藍(lán)母液：稱取4g臺(tái)盼藍(lán),加少量蒸儲(chǔ)水研磨,加雙蒸水至 100ml,用濾 紙過(guò)濾,4度保存.使用時(shí).用PBS稀釋至0.4%.2. 吸管、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、顯微鏡 步驟：1、制備單細(xì)胞懸液.并作適當(dāng)稀釋10 *6細(xì)胞/ml2 、染色：取9mL細(xì)胞懸液移入試管中,力口 1mL0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液,混勻.3、觀察考前須知：臺(tái)盼藍(lán)染細(xì)胞時(shí),時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng).否那么,局部活細(xì)胞也會(huì)著色,