“生物檢驗檢疫”課程實驗教案授課人：陳勇實驗一：病料的采

1、1 / 11生物檢驗檢疫”課程實驗教案授課人：陳勇實驗一：病料的采集及病原菌的分離和培養(yǎng)方法（ 一 ） 病料采集學習目的：了解常見病料的采集部位，掌握病料采集注意事項，學會進行常見病料采集。 一：血液的采集根據檢驗項目及需要血液料的多少，可以選用靜脈采血或心臟采血。（一）靜脈采血 魚是尾靜脈；馬，牛，羊犬，貓一般多在頸靜脈；成年豬在耳靜脈；6個月以內的豬在前腔靜脈；禽 在翅靜脈采血。前腔靜脈的采血術是：豬仰臥，拉直兩前肢使兩前肢向后與體中線平行。手持針管，針頭斜向后內方二） 末梢或小靜脈采血豬羊兔等可穿刺耳邊緣小靜脈。（三） 心臟采血 禽或試驗小動物需要血量較多時可采用本法。 禽的采血：右側臥

2、保定，左側胸部向上，取一個10毫升注射器，接上長約5厘米的針頭，從胸骨脊前端至背部下凹處連接線的中點，垂直或稍向前內方刺入23厘米即可。兔或豚鼠等的采血：在胸部左側觸及心臟跳動處垂直刺入，邊刺邊抽注射器內塞，將血 取出。 二：其他病料采集（一） 乳汁的采集 乳頭及術者的手用新潔爾滅消毒，將最初擠出的乳汁棄去，采1020毫升左右乳汁與滅菌容器中。（二）膿汁，鼻液，水皰液，水腫液的采集 用滅菌棉拭子蘸取膿汁于滅菌試管中。未破的膿腫，水皰液，水腫液等無菌注射器吸取， 注入無菌容器中。尸體剖檢后胸水，心包液，關節(jié)囊液等可用滅菌吸管吸取，置于滅菌容器中（三）糞便的采集 以清潔玻棒挑取新鮮糞便少許（約1克

3、）或用棉拭子自直腸內掏取，置于小瓶內。（四）腸管的采集 用線扎緊一段腸管（約6厘米）兩端，結外剪下置于滅菌容器中。（五）膽汁的采集 整個膽囊置于塑料袋中或以無菌注射器吸取膽汁于滅菌容器中。（六）腦和脊髓的采集 采取腦，脊髓于適當保存液中，或將整個頭割下，包于鋟過0.1%升汞的紗布中，于木箱中送檢。（七）實質臟器的采集選擇典型病變連同一部分正常組織，切下一，二塊，每塊不小于 八）魚體表、鰓表面的采集(二)病原菌的分離和培養(yǎng)一、實驗目的：(1)掌握無菌操作的概念和基本操作技術。(2)了解細菌常用培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件(3)了解平板劃線分離菌種的原理和操作要點二、實驗原理：微生物的接種技術是微生物學研究

4、中的一項最基本的操作技術。在微生物學的科學試驗及發(fā)酵生產中， 都要把一種微生物移接到另一滅過菌的新鮮培養(yǎng)基中，使其生長繁殖并獲得代謝產物。根據不同的接種方 法，如斜面接種、液體接種、平板接種、穿刺接種等。接種方法不同，常有不同的接種工具，如接種針、 接種環(huán)、接種鉤、滴管、移液管、涂布器等。接種的菌種都是與地面呈60度角，向右側或左側胸前窩刺入，進針23厘米即可抽出血液。術后局部常規(guī)消毒。馬牛可在耳尖部采血：局部剪毛，酒精消毒，用18號針頭刺入1厘米左右，血液即可流出。4厘米*2厘米*2厘米。2 / 11純培養(yǎng)的微生物，為了解保純種不被雜種菌 污染，在接種過程中必須進行嚴格的無菌操作。三、實驗材

5、料：燒杯、玻璃棒、天平、電爐、培養(yǎng)基、蒸餾水、接種環(huán)、培養(yǎng)皿(12個)、 試管(20支)、高壓滅菌鍋、無菌操作臺、酒精燈、溫箱四、實驗步驟：1、 配制培養(yǎng)基：用天平稱取瓊脂培養(yǎng)基粉末45克，加入100毫升的蒸餾水，用電爐加熱直至培養(yǎng)基 徹底溶解。2、分裝試管：將溶解的培養(yǎng)基分裝入試管，且分裝入的培養(yǎng)基應不超過試管高度的三分之一，塞上 木塞。3、 滅菌：將裝入培養(yǎng)基的試管、培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿用報紙包扎好，一起放入高壓滅菌鍋，126度滅菌15分鐘，等冷卻后將試管斜放，制成斜面(斜面長度不超過試管長的一半)。4、制平板培養(yǎng)基：將火完菌的培養(yǎng)皿與培養(yǎng)基移至無菌操作臺，在無菌條件下制成平板培養(yǎng)基，待 用。5

6、、取菌種：(1)每個試管中放入1毫升的生理鹽水。分成三組。(2)用接種環(huán)取魚鰓、身體與尾部的細菌，分別放于1號試管中。(3)1號試管取一半帶菌液體放入2號試管中，振蕩，再取一半帶菌液體加入3號試管，振蕩，取一半液體加入4號試管，振蕩。6、 分離細菌：(1)在無菌條件下操作，點燃酒精燈后，左手持皿，底朝下蓋朝上，以無名指和小指托底，用拇指、食指和中指將皿蓋揭開成20左右的角度(角度愈小愈好，以免空氣中細菌進入皿中將培養(yǎng)基污染)。(2) 右手持接種環(huán)于酒精燈上灼燒滅菌，待冷，取帶菌液體于平板培養(yǎng)基上劃線分離 培養(yǎng)。(3) 劃線完畢，燒灼接種環(huán)，將培養(yǎng)皿蓋好，用標簽做好標記，倒置，待培養(yǎng)。7、 培養(yǎng)

7、細菌：將培養(yǎng)皿放入37 C溫箱中培養(yǎng)。五、實驗結果：培養(yǎng)出多個單菌落。3 / 11實驗二 細菌的形態(tài)學鑒定方法（ 一 ） 細菌的形態(tài)學觀察一、實驗目的： 了解細菌的個體形態(tài)和菌落培養(yǎng)特征。二、實驗原理：（一）菌體形態(tài)觀察 細菌個體微小，觀察個體大小、外形、排列、特殊結構時，一般借助普通光學顯微鏡。 細菌的基本形態(tài)可分為三類：球菌、桿菌和螺旋菌。1、球菌 菌體呈球形。 按其分裂的方向和分裂后排列情況不同， 可分為雙球菌、 鏈球菌、 葡萄球菌等。 雙球菌在一個平面上分裂，分裂后菌體成對排列，如腦膜炎雙球菌、肺炎鏈球菌；鏈球菌連續(xù)不斷地 在一個平面上分裂，呈鏈狀排列，如化膿鏈球菌；葡萄球菌是在多個不

8、同角度平面上做不規(guī)則分裂，分裂 后菌體堆積成葡萄串狀，如金黃色葡萄球菌。2、桿菌 菌體呈桿狀或近似桿狀。各種桿菌長短粗細差別很大，短的幾乎呈球形，長的可呈絲狀，桿 菌的兩端形狀在鑒定細菌時具有一定的意義。 大多數桿菌兩端鈍圓， 如大腸桿菌； 有的平切， 如炭疽桿菌； 有的尖細，如梭狀桿菌；有的末端膨大似棒狀，如百喉桿菌；有的呈球桿形，如多殺性巴氏桿菌。桿菌大 多數呈散在排列，也有的呈鏈狀排列，如炭疽桿菌，有些形成側枝稱分枝桿菌，如結核分枝桿菌。3、螺旋菌 菌體彎曲。根據其彎曲的程度和螺旋數，又可分為孤菌、螺菌和彎桿菌。 孤菌的菌體只有一個彎曲呈孤狀， 如霍亂孤菌； 螺菌的菌體有兩個以上彎曲呈螺

9、旋形， 如鼠咬癥螺菌； 彎桿菌呈孤形、螺旋形或S形，如結腸空腸彎桿菌。某些細菌除具有基本結構外，還具有某些特殊結構，如莢膜、鞭毛、芽孢等，通過特殊染色法加以觀 察，對鑒別細菌的種類具有一定意義。（二）菌落性狀觀察 各種細菌在培養(yǎng)基上生長時，常表現出一定的特征，如在特殊培養(yǎng)基內所表現的發(fā)育情況，菌落的 形態(tài)和色素的產生等。這對于細菌菌屬的鑒別，具有重要的意義。細菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，由單個菌細胞固定一點而大量繁殖，經過一定時間（一般為1824小 時）的孵育，在培養(yǎng)基表面出現肉眼可見的細菌集團，這種集團稱為菌落。每一種細菌有它一定的菌落形 態(tài)，其大小、隆起或扁平、表面的性質、光澤、色素的產生、邊

10、緣的形狀等各有特點，所以，菌落的形態(tài) 在識別細菌上有一定的意義。例如葡萄球菌在瓊脂平皿上，由于產生色素的不同，形成各種顏色之圓形而 突起的菌落； 炭疽桿菌形成扁平、 干燥、 邊緣不整齊的波紋狀菌落， 用放大鏡觀察時， 它們呈卷發(fā)樣構造； 腸道桿菌屬的細菌形成圓形、濕潤、黏稠、扁平、大小不等之菌落；巴氏桿菌和豬丹毒桿菌形成細小露珠 狀菌落。觀察菌落形態(tài)特征時，通常先用肉眼觀察，再用放大鏡檢查，必要時用顯微鏡檢查。 觀察的內容和方法主要有以下幾個方面：（1）大小 菌落的大小以毫米來表示，一般不足1毫米者為露滴狀菌落，12毫米者為小菌落，24毫米者為中等大菌落，46毫米或更大者稱為大菌落或巨大菌落。

11、（2） 形狀 菌落的外形有圓形、不整形、樹根形、葡萄葉形等。（3） 邊緣 邊緣有整齊、鋸齒狀、網狀、樹葉狀、蟲蝕狀、放射狀及卷發(fā)狀等。（4） 表面性狀 觀察其是否平滑或粗糙，是否有皺仄狀，蝸旋狀，甚至有子菌落等。(5)隆起度 有隆起、輕度隆起、中央隆起；反之，略有扁平、陷凹或堤狀等。(6)顏色及透明度 有無色、灰白色及產生各種色素者；有無光澤、透明、半透明及不透明等區(qū) 另嘰(7)硬度 有黏液狀、脂狀、干燥或濕潤等。三、實驗器材：解剖鏡四、實驗結果：觀察多種多個單菌落。4 / 11(二)細菌的染色觀察一、實驗原理：(1)簡單染色：只用一種染料使細菌染色，該法可用于觀察細菌的形態(tài)，難于辨別細菌的細

12、胞結構。(2)革蘭氏染色：G+和G-其細胞壁的結構和成分不同，G-菌的細胞壁中含有較多的易被乙醇溶解的類脂質，并且肽聚糖層較薄、 交聯度低，在使用乙醇或丙酮脫色時，因類脂質溶解增加了細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細菌被脫色，再經石炭酸復紅復染后即成紅色。G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高，類脂質含量少，脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。(3) 芽孢染色：細菌的芽孢含水量少，脂肪含量高，芽孢壁較厚，對染料的透性差，不易著色，但 是一旦著色又難以脫色。通常，芽孢染色采用弱堿性染料孔雀綠在加熱條件下進行。染色完畢，用自來水 沖洗。

13、因孔雀綠是弱堿性染料，與菌體結合力較差，因此易被水沖洗掉，而進入芽孢中的孔雀綠卻難以溶 出。水洗后，再用一種呈紅色的堿性染料復染，使菌體和芽孢呈現不同的顏色。二、實驗準備：染色劑的配置：1、堿性美藍染色液甲液：美藍0.3克95%酒精30毫升乙液：0.01%苛性鉀溶液100毫升先配美藍飽和液(甲液)，將美藍放入研缽中，徐徐加入酒精研磨均勻后，把甲、乙兩液混合，越 夜后用濾紙過濾即成。新鮮配制的美藍染色不好，陳舊的染色好。2、革蘭氏染色液(1) 草酸銨結晶紫溶液甲液：結晶紫2克95%酒精20毫升乙液：草酸銨0.8克蒸餾水80毫升將結晶紫放入研缽中，加酒精研磨均勻，然后將完全溶解的乙液與甲液混合即成

14、。(2) 盧戈氏碘液碘1応 碘化鉀2克，蒸餾水300毫升。將碘化鉀放入研缽中， 加入少量蒸餾水，使其溶解, 在放入已磨散的碘片，徐徐加水，同時充分磨勻，待碘片完全溶解后，把余下的蒸餾水倒入， 再裝于瓶中。(3) 稀釋石炭酸復紅溶液取堿性復紅酒精飽和溶液(堿性復紅10克溶于95%酒精100毫升中)1毫升和5%石炭酸水溶液9毫升混合，即成稀釋石炭酸復紅溶液。3、瑞氏染色液取瑞氏染料0.1克，純中性甘油1毫升，在研缽中混合研磨，再加甲醇60毫升，使其溶解，裝入中性瓶中越夜，次日過濾，盛于棕色瓶中，保存于暗處。保存越久，染色越好。4、姬姆薩染色液 取姬姆薩染料0.6克，加入甘油50毫升，置于5560

15、C水浴箱中，2小時后加入甲醇50毫升, 靜置1天以上，過濾后即可使用。三、實驗步驟：一）、一般染色1、美藍染色法經涂片、干燥、固定后，滴加美藍于涂片上， 使之覆蓋涂面， 染色23分鐘，用水沖洗，晾干或用吸水紙輕壓吸干后即可鏡檢，菌體呈藍色。2、革蘭氏染色法經涂片、干燥、固定后滴加適量草酸銨結晶紫液于涂面上（以蓋滿細菌涂面為度），初染1分鐘后水洗。 再滴加盧戈氏碘液覆蓋1分鐘， 水洗（此步水洗可省略） 。加95%酒精脫色約30秒至1分鐘，立即水洗。最后滴加石炭酸復紅稀釋液復染1分鐘，水洗，自干或 用吸水紙吸干后鏡檢。革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。（二）、特殊染色法 對細菌的莢膜、芽孢、

16、鞭毛等特殊結構，因其不易著色，通常采用特殊的莢膜染色法、芽 孢染色法、鞭毛染色法來進行染色。1、莢膜染色法5 / 11（1）希司氏莢膜染色法細菌涂片，甲醇固定后，用一小塊濾紙片覆蓋于涂膜上，滴加結晶紫染液，并置于火焰上略加熱至發(fā)生蒸汽為止（約近1分鐘），傾去染液，除去 濾紙片，再用20%硫酸銅溶液沖洗，待干后鏡檢。菌體呈紫色，莢膜呈淡藍色。（2）駱氏美藍莢膜染色法細菌涂片、固定后，用久貯的駱氏美藍液染色12分鐘，水洗、干燥后鏡檢。菌體呈藍色，莢膜呈淡紅色。2、芽孢染色法固定后的涂膜上滴加5%孔雀綠液微微加熱染色0.51分鐘，到發(fā)生蒸汽為止，待冷后水洗，再滴加沙黃液復染0.5分鐘，水洗、干燥后鏡

17、檢。芽孢成綠色， 菌體呈淡紅色。3、鞭毛染色法取鞭毛菌液，干燥后滴加戶田氏染色液，染色約0.55分鐘，水洗、干燥后鏡檢。菌體呈深紅色，鞭毛呈淡紅色。6 / 11實驗三細菌的生化特性鑒定細菌的生理生化試驗是菌種鑒定的重要依據，通過細菌的生理生化反應了解細菌在不同基質中的各種代謝途徑和產生不同的代謝產物及在菌種鑒定中的重要性，本實驗選做其中的9個實驗，包括硫化氫試驗、靛基質試驗（吲哚實驗）、糖發(fā)酵試驗、乙酰甲基甲醇試驗（V-P試驗）、甲基紅試驗（M.R試驗）、尿素酶 試驗、檸檬酸鹽利用試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗。一、硫化氫試驗1、實驗目的：（1）了解硫化氫產生試驗的用途及原理。（2）學習硫

18、化氫產生試驗的操作技術。2、實驗原理：某些細菌能分解含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸、精氨酸）生成硫化氫，硫化氫遇到鉛（或 鐵、鉍）等重金屬鹽，能形成黑色的硫化鉛（或硫化亞鐵、硫化鉍）沉淀物。由于反應形成的硫 化氫易被氧化，通常采用穿刺接種，以及在培養(yǎng)基中加入硫代硫酸鈉，使硫化氫不致被氧化。3、實驗材料：細菌 培養(yǎng)基酒精棉球酒精燈接種針恒溫箱等4、實驗步驟用穿刺接種法接試驗菌于硫酸亞鐵瓊脂培養(yǎng)基中，37 C培養(yǎng)24天5、實驗結果培養(yǎng)基中有黑色物質者，為硫化氫試驗陽性，否則為陰性。二、 靛基質試驗（吲哚試驗）：1、實驗目的：（1）了解吲哚試驗的反應原理和用途。（2）學習吲哚試驗的操作技術。2、實驗原理：某些細菌具有色氨酸水解酶，能分解