WesternBlot操作要點(diǎn)

1、STANDARD OPERATING PROCEDUREISSUED BY制訂人范翠翠REG.No.登記號(hào)Page頁1(2)IRANSLAIED BYIRANSLAIION APPROVED BY翻譯人翻譯批準(zhǔn)APPROVED BYApproved date批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期Valid from生效日期Copy No. 復(fù)印號(hào)To be revised下次修改日期Superseded REG no. 前登記號(hào)SUBJECT/題目周玉坤 Western Blot技術(shù)服務(wù)項(xiàng)目HEADING/ 標(biāo)題TEXT/內(nèi)容Content1. Objective2. Scope3. MaterialsReage n

2、ts In strume nt Con sumable4. Procedure5. Changing historySTANDARD OPERATING PROCEDURE (SOP)ISSUED BYApproved byREG.No.制訂批準(zhǔn)登記號(hào))HEADING/ 標(biāo)題1. Objective2. Scope3. ProcedureTEXT/內(nèi)容鑒定蛋白表達(dá)情況本SOP適用于 Western-Blot試驗(yàn)操作儀器：高壓鍋、玻璃勻漿器、高速離心機(jī)、分光光度儀、 20C低溫冰箱、垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置、恒溫水浴 搖床、多用脫色搖床。試劑：?jiǎn)稳ノ蹌┝呀庖骸?.01mol/L PBS (pH7.3)

3、 12%分離 膠、5%濃縮校、2XSDS上樣緩沖液、電泳緩沖 液、轉(zhuǎn)移緩沖液、封閉液、TBST、TBS、洗脫抗體 緩沖液、顯影液、定影液、一抗(由委托人提 供)、HRP-羊抗鼠二抗、HRP年抗兔二抗、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑、顯影液、定影液。雜品與耗材：各種規(guī)格的吸頭、離心管和加樣器；各種規(guī) 格的燒杯、量筒和平皿等玻璃器材；PVDF膜，乳 膠手套，保鮮膜，搪瓷盤(>20 x 20cm), X-光片 夾，X-光片，玻棒長(zhǎng)短各一根，計(jì)時(shí)器，吸水紙， 試劑配制：1.0mol/L Tris HClTris (MW121.14)30.29g蒸餾水200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至所需點(diǎn)(見下所示)，最

4、后 用蒸餾水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。PHHCl7.4約 17ml7.5約16m7.6約 15ml8.0約 10ml10% SDSSDS10g蒸餾水至100ml50 C水浴下溶解，室溫保存。如在長(zhǎng)期保存中出現(xiàn)沉淀,水浴溶化后，仍可使用STANDARD OPERATING PROCEDURE (SOP)BioHermcsISSUED BY (iss.Dep./name)Approved byREG.No. 01-010-01Page制訂批準(zhǔn)登記號(hào)頁3(12)HEADING/ 標(biāo)題TEXT/ 內(nèi)容10%過硫酸胺(APS)過硫酸胺0.1g超純水1.0ml溶解后，4C保存，保存時(shí)間為1周

5、。1.5mol/L Tris HCl (pH8.8)Tris (MW121.14)45.43g超純水200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至8.8,最后用超純水定容至 250ml，咼溫火菌后室溫下保存。0.5mol/L Tris HCl (pH6.8)Tris (MW121.14)15.14g超純水200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至6.8,最后用超純水定容至 250ml，咼溫火菌后室溫下保存。30% Acr丙稀酰胺(Acr)29g甲叉雙丙稀酰胺(Bic)1g超純水至100ml溶解后，0.45卩m濾膜過濾后4C保存。使用時(shí)恢復(fù)至 室溫且無沉淀。0.01mol/L PBS ( pH 7.2-7.4Na2

6、HPO42.9gKH 2PO40.2gNaCl8gKCl0.2gPage頁4(12)REG.No.登記號(hào)01-010-01HEADING/ 標(biāo)題TEXT/內(nèi)容蒸餾水至1000mlSTANDARD OPERATING PROCEDURE (SOP)ISSUED BY (iss.Dep./name)Approved by制訂批準(zhǔn)12%分離膠和5%濃縮校10mL1%分離4mL 5%濃縮膠超純水3.3ml2.7ml30% Acr4.0ml0.67ml1.5 mol/L Tris HCl(pH8.8) 2.5ml一1.0 mol/L Tris HCl(pH6.8)0.5ml10% SDS100 l40

7、ll10%AP （過硫酸胺）100 Jl40 llTEMED4計(jì)4 ll加TEMED后，立即混勻即可灌膠。還原型2XSDS上樣緩沖液1.0mol/L Tris HCl (pH6.8)0.5mlSDS0.2g溴酚藍(lán)10mg甘油1.0mLDTT , MW154.5）0.39g臨用前取1.0 mol/L貯存液DTT 1.0mL加入4.0mL 2 X SDS loading buffer,混勻后，分裝于1.5ml離心管中，4C保存， 一周內(nèi)用完。DTTDTT5.0gDDW32.4 Ml分成小份，-20度保存。5*Tris-Glyci ne Buffer 電泳液緩沖液Tris (MW121.14)15.

8、1gSTANDARD OPERATING PROCEDURE (SOP)BioHermesISSUED BY (iss.Dep./name) 制訂Approved by 批準(zhǔn)REG.No.Q1-Q1Q-Q1登記號(hào)Page頁5(12)HEADING/ 標(biāo)題TEXT/內(nèi)容甘氨酸（MW75.07）94gSDS5.0g蒸餾水至1000ml溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用35次10*轉(zhuǎn)移緩沖液甘氨酸（MW75.07）14.5gTris（ MW121.14）29gSDS0.5g蒸餾水至500ml溶解后室溫保存，臨用前取200mL甲醇加入800mL轉(zhuǎn)膜 緩沖液中共1000 mL。次溶液可重復(fù)使用35次。TB

9、S緩沖液1 mol/ LTris HCI （pH7.5） 10mlNaCI8.8g蒸餾水至1000mlTBST緩沖液(含Tween20的TBS緩沖液)0.05% Twee n200.25mlTBS500ml混勻后即可使用，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。1*TBST 1LTris base2.422g （MW121.4）Nacl8.775gTwee n200.5ml封閉液（含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液）脫脂奶粉（國產(chǎn)，安怡牌）5gSTANDARD OPERATING PROCEDURE (SOP)BioHermcsISSUED BY (iss.Dep./name) 制訂Approved by 批準(zhǔn)登記T 01

10、-010-01Page頁6(12)HEADING/ 標(biāo)題TEXT/內(nèi)容TBST100mL溶解后4C保存。使用時(shí)，恢復(fù)室溫，用量以蓋過膜面 即可，一次性使用。顯影液一小袋溶于250 mL DDW中，棕色瓶保存。 定影液一盒溶于1000mL DDW，室溫棕色瓶保存。 抗體用封閉液稀釋至一定濃度使用，每張膜需 0.5ml。 ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自碧云天，分A和B兩種試劑。 操作步驟：（一）SDS PAGE 電泳（1）清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦 洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干 凈后立在筐里晾干。（2）灌膠與上樣1玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上

11、準(zhǔn)備灌膠。（操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊，以免漏膠。）2按前面方法配12%分離膠，加入TEMED后立即 搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用 10ml槍吸取5ml膠沿玻璃 放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一 層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開始可快一些，膠 面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板 流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。 加水液封時(shí)要很慢，否則 膠會(huì)被沖變型。）3當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再 等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水STANDARD OPERATING PROCEDURE師(SOP)ISSUED BY (iss.Dep./name)

12、制訂Approved byREG.No. 0101001Page批準(zhǔn)登記號(hào)-頁7(12)HEADING/ 標(biāo)題TEXT/內(nèi)容吸干。4按前面方法配5%的濃縮膠加入TEMED后立即搖 勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮 膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn) 生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收 縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝 固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手 分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。5用水沖洗 下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻 璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一 邊要墊一塊塑料板且有字

13、的一面面向外。）6測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含 52g蛋白的溶液體積即 為上樣量。取出上樣樣品至 0.5ml離心管中，加入5X SDS 上樣緩沖液至終濃度為1xo（上樣總體積一般不超過15門，加樣孔的最大限度可加 221樣品。）上樣前要將樣 品于沸水中煮5min使蛋白變性。7加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要 漫過內(nèi)測(cè)的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將 樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢 加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也 可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電 泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。（3）電泳電泳時(shí)間一般45 h,電壓為40

14、V較好，也可用 60V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。（二）轉(zhuǎn)膜（1）轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備 2張7.08.3cm的濾紙和1張 7.38.6cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時(shí) 定要 戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的硝酸STANDARD OPERATING PROCEDURE (SOP)BioHermcsISSUED BY (iss.Dep./name)Approved byREG.No. 01-010-01Page制訂批準(zhǔn)登記號(hào)頁8(12)HEADING/ 標(biāo)題TEXT/內(nèi)容纖維素膜置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸15min才可使用。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿 里，要使膜浮于水上，

15、只有下層才與水接觸。這樣 由于毛細(xì)管作用可使整個(gè)膜浸濕。若膜沉入水里， 膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會(huì)阻止膜吸水。（2）在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊 海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。（3）將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海 綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（一 手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。）在墊 子上墊一層濾紙，一手固定濾紙一手用玻棒搟去其 中的氣泡。（4）要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕， 要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開 始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板 很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響

16、操作），要避免把分離膠刮破。小心 剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對(duì) 齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿 整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡。在膜上 蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊， 搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行， 要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸， 接觸后會(huì)發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴 手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通。）（5）將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑 面，夾的白面對(duì)槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽 的一邊放一塊冰來降溫。一般用60V轉(zhuǎn)移2 h或 40V轉(zhuǎn)移3 h。STANDARD OPERATING PROCED

17、URE (SOP)BioHermcsISSUED BY (iss.Dep./name) 制訂Approved by 批準(zhǔn)REG.No. 01-010-01Page登記號(hào)頁9(12)HEADING/ 標(biāo)題TEXT/內(nèi)容(6) 轉(zhuǎn)完后將膜取出，可以看到預(yù)染 Marker已經(jīng)轉(zhuǎn)印到膜上了，這個(gè)過程要保證膜的濕潤(rùn)，不能干燥，否則會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的非特異性。膜一：A1 B1 C1 D1 A2 B2 C2 D2 A3 B3 C3 D3120kD86kD47kD36kD26kD20kD膜二:120kD2A1 B1 C1 D1 A2 B2 C2 D2 A3 B3 C3 D386kD47kD36kD26kD20kD1

18、Occludi ng65kD2ZO-1220kD3Claudi n-122kD4Claudi n-422kD5JAM-A36-41kDSTANDARD OPERATING PROCEDURE (SOP)BioHermcsISSUED BY (iss.Dep./name) 制訂Approved by 批準(zhǔn)登記T 01-010-01Page 頁10(12)HEADING/ 標(biāo)題TEXT/內(nèi)容6 PKC80kD7 UGT64kD內(nèi)參B actin42 kD分別將目的蛋白周圍的膜切開，以 DDW沖洗。分別加入相應(yīng)一抗。（三）免疫反應(yīng)（1）將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的 平皿中，室溫下脫色

19、搖床上搖動(dòng)封閉 1h。（2）將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度（在1.5ml離心 管中）；撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實(shí)驗(yàn) 臺(tái)面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將 抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用 濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液 面上，掀動(dòng)膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育12h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩 次，每次10min;再用TBS洗一次，10min。（3）同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵 育12h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩 次，每次10min;再用 TBS洗一次，10min,進(jìn) 行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。（四）化學(xué)發(fā)光，顯影，定影（1）將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合； 1min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸； 1min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包 好，放入X-光片夾中。（2）在暗室中，將1X顯影液和定影液分別到入塑料 盤中；在紅燈下取出 X-光片，用切紙刀剪裁適 當(dāng)大小（比