北京百泰克生物技術(shù)有限公司 - 僅用于

1、北京百泰克生物技術(shù)有限公司BioTeke Corporation地址:北京海淀區(qū)留學(xué)人員創(chuàng)業(yè)園(100085電話:010-* 傳真:010-*網(wǎng)址: Email:info 一般實驗室使用,僅用于體外凋亡DNA Ladder快速提取試劑盒 (離心柱型用于快速提取凋亡DNA Ladder目錄號:DP2401(20次 DP2402(50次使用手冊2006年9月,第2版 北京百泰克生物技術(shù)有限公司 Bioteke Corporation【百泰克生物】定貨熱線:010-* Email:info-1-一、試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性試劑盒組成 保存 20次 (DP240150次 (DP2402 裂解/結(jié)合液C

2、B 室溫 6 ml 15 ml 6 ml15 ml漂洗液WB 室溫 第一次使用前按說明加指定量乙醇異丙醇 室溫 3 ml 7 ml 洗脫緩沖液EB 室溫 5 ml 10 ml 吸附柱AC 室溫 20個 50個 收集管(2ml室溫20個50個本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。 注意事項1. 第一次使用前請先在漂洗液WB 中加入指定量無水乙醇,充分混勻,加入后請及時在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇,以免多次加入!2. 結(jié)合液/裂解液CB 低溫時可能出現(xiàn)析出和沉淀,可以在37水浴幾分鐘幫助重新溶解,恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。3. 避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、PH 值變化,各溶液

3、使用后應(yīng)及時蓋緊蓋子。六、疑難解答(Trouble shooting出現(xiàn)的問題可能的原因建議解決方法沒有DNALadder條帶,只見到未凋亡細(xì)胞的基因組條帶細(xì)胞未凋亡或者凋亡細(xì)胞率太低提高凋亡劑的濃度或者延長凋亡誘導(dǎo)時間分離的DNA產(chǎn)量太低加大起始細(xì)胞處理量,按比例擴(kuò)大試劑使用量。確保做了步驟7,以免乙醇?xì)埩艚档拖疵撔?。未見到DNALadder 條帶,也未見到非凋亡細(xì)胞的基因組條帶樣品本身含有DNA量少(如人全血,電泳上樣量太低,可以加大洗脫下來純化DNA的電泳上樣量。DNA彌散,未見Ladder 凋亡晚期,非特異的剪切DNA所致在凋亡較早期時提取DNA Ladder(或者做多個不同時期動態(tài)

4、連續(xù)檢測背景高,DNA Ladder 弱或者不明顯RNA污染太多,影響了觀測將洗脫的純化DNA加入DNsefree的RNase 至終濃度2g/ml,室溫(15-20放置20分鐘降解污染的RNA。二、原理簡介細(xì)胞發(fā)生凋亡時,染色質(zhì)DNA在核小體之間發(fā)生斷裂,最終形成200bp整數(shù)倍的DNA片段,這些DNA片段被提取后,經(jīng)電泳及溴化乙錠染色后形成梯子狀外觀,謂之DNA Ladder。血液和組織培養(yǎng)細(xì)胞在裂解/結(jié)合液中裂解后,釋放出來的DNA片段在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜,再通過一系列快速的漂洗-離心的步驟,將鹽、細(xì)胞代謝物,蛋白等雜質(zhì)去除,最后低鹽的洗脫緩沖液將DNA Ladde

5、r片段從硅基質(zhì)膜上洗脫。三、試劑盒特點1.不需要使用有毒的苯酚等試劑,也不需要乙醇沉淀等步驟。2.本公司獨有的裂解/結(jié)合液配方有效裂解細(xì)胞,使用本試劑盒不需要加入昂貴的蛋白酶K處理,大大降低了使用成本和加快了處理速度。3.節(jié)省時間,簡捷,單個樣品操作一般可在10分鐘內(nèi)完成。四、注意事項(實驗前必須首先閱讀這部分!1.所有的離心步驟均在室溫完成,使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000 rpm的傳統(tǒng)臺式離心機(jī),如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。2.開始實驗前將需要的水浴先預(yù)熱到70備用。3.裂解/結(jié)合液CB含有刺激性化合物,操作時要戴乳膠手套,避免沾染皮膚,眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時,要

6、用大量清水或者生理鹽水沖洗?！景偬┛松铩慷ㄘ洘峋€:010-* Email:info【百泰克生物】定貨熱線:010-* Email:info-5-2-【百泰克生物】定貨熱線:010-* Email:info【百泰克生物】定貨熱線:010-* Email:info-3-4-4. 一般2x106培養(yǎng)細(xì)胞DNA產(chǎn)量為10-20g, 200l 人全血典型產(chǎn)量為3-6g 。5. 一般電泳檢測時典型上樣量為2-3g 純化的DNA ,如果凋亡率低,有可能只見到基因組DNA,而見不到DNA ladder,可以試試加大上樣量。五、操作步驟* 第一次使用前請先在漂洗液WB 中加入指定量無水乙醇!1. 取2X106

7、個細(xì)胞(懸浮細(xì)胞或者組織培養(yǎng)細(xì)胞重懸在200l PBS中或者200l全血(大約含有2X106個細(xì)胞加入200l 裂解/結(jié)合液CB, 立刻劇烈顛倒輕搖,充分混勻。最大細(xì)胞或者全血處理起始量可達(dá)300l,如果起始量介于200l-300l 之間,則需要按比例相應(yīng)提高后面使用試劑量。2. 室溫(15-20放置10分鐘。3. 加入100l 異丙醇,劇烈顛倒輕搖,充分混勻,此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。上述步驟中適當(dāng)力度充分混勻非常重要,混勻不充分嚴(yán)重降低產(chǎn)量,必要時如樣品粘稠不易混勻時可以渦旋振蕩15秒混勻,但不可用手劇烈振蕩,以免剪切DNA 。4. 將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱AC中,(吸附柱

8、放入收集管中10,000 rpm離心30秒,倒掉收集管中的廢液。5. 加入700l 漂洗液WB (請先檢查是否已加入無水乙醇!,12,000 rpm離心30秒,棄掉廢液。6. 加入500l 漂洗液WB,12,000 rpm 離心30秒,棄掉廢液。7. 將吸附柱AC 放回空收集管中,13,000 rpm 離心2分鐘,盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇影響洗脫效率和下游反應(yīng)。 8. 取出吸附柱AC,放入一個干凈的離心管中,在吸附膜的中間部位加100l 洗脫緩沖液EB (洗脫緩沖液事先在 65-70水浴中預(yù)熱, 室溫放置3-5分鐘,12,000 rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中,室溫放置2分鐘,12,000 rpm 離心1分鐘。 洗脫體積越大,洗脫效率越高,如果需要DNA 濃度較高,可