土壤酶測定方法

1、v1.0可編輯可修改土壤磷酸酶（酸性）一一磷酸苯二鈉比色法（一）試劑1. pH5醋酸鹽緩沖液:A:L醋酸溶液（稀釋至1000ml）B:L醋酸鈉溶液A液+B液稀釋至100ml若使用無水乙酸及乙酸鈉配制 1升 PH為的乙酸鹽緩沖液，則需要無水乙酸及乙酸鈉的量計算如下:無水乙酸用量的計算：無水乙酸的濃度為，則需無水乙酸的體積為X1000/=（毫升）;乙酸鈉用量的計算：查表知，無水乙酸鈉的摩爾質(zhì)量為82,則需無水乙酸鈉的質(zhì)量為X 82X 1=11 （克）。使用無水乙酸及乙酸鈉配制1升 PH為的乙酸鹽緩沖液的方法如下：用量筒量取毫升無水乙酸至1000毫升燒杯內(nèi)，再用 臺秤稱取無水乙酸鈉11克至該燒杯，然

2、后用量筒量取 =996毫升蒸餾水至該燒杯內(nèi)，攪拌至乙酸鈉溶解并 呈均勻的溶液即為1升PH為的乙酸-乙酸鈉緩沖液?；蛘撸毫?ml醋酸鈉液+3ml醋酸液混合即得。2. %磷酸苯二鈉：pH5醋酸緩沖液3.氯代二溴對苯醌亞胺：稱取 2，6-二溴苯醌氯酰亞胺，用10ml 96%乙醇（48ml乙醇+2ml水）溶解，貯存于棕色瓶中，存放在冰箱中，保存的黃色溶液未變褐色之前均可使用。4.酚標準溶液：酚原液-取1g苯酚溶于蒸餾水中，定容至1000ml水中,保存于棕色瓶中。酚工作液-取10 ml酚原液稀釋至1000ml水中，每毫升含酚5.甲苯硫酸鋁溶液，稱取硫酸鋁，定容至 100ml。（二）實驗步驟1. 標線制作

3、取0, 1, 3, 5, 7, 9, 11，13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，加入5ml緩沖液和4滴氯代二溴對苯醌亞胺試劑，顯色后稀釋至刻度，30min后比色測定。以光密度值為縱坐標，濃度為橫坐標繪成標準曲線。2. 樣品測定稱取風干土樣（過20目篩，去除雜質(zhì)），放置于200ml容量瓶（離心管）中, 加甲苯，輕搖15min后，加入20ml %磷酸苯二鈉，仔細搖勻后放置于 37° C恒溫箱中培養(yǎng)24h，后于培養(yǎng)液中加入硫酸鋁溶液過濾。吸取濾液3ml于50ml比 色管中，按標準曲線方法顯色，于波長 578nm處測定顏色的深度，讀取吸光值。對每一土樣，設(shè)置用10mL水代替磷酸苯二鈉基質(zhì)

4、的對照。并作空白無土對照。（三）數(shù)據(jù)計算以24小時每克土壤中釋放出的酚的毫克數(shù)表示。土壤脲酶活性測定:靛酚比色法試驗步驟：試劑：1）甲苯2）10%尿素：稱取10g尿素，用水溶至100ml。3）檸檬酸鹽緩沖液（）：184克檸檬酸和克氫氧化鉀溶于蒸餾水。將兩溶液合并, 用1mol/L NaOH將PH調(diào)至，用水稀釋至1000毫升。4）苯酚鈉溶液（L）：A:克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和毫升丙酮，用乙醇稀釋至 100毫升,存于冰箱中;B： 27克NaOH溶于100毫升水，存于冰箱中。將AB溶液保存在冰箱中。使用前將2溶液各20毫升混合，用蒸餾水稀釋至100 毫升備用。5）次氯酸鈉溶液：用水稀釋試劑

5、，至活性氯的濃度為 %溶液穩(wěn)定。如購買的溶液是含10%舌性氯的，則計算如下：10%*原液體積（配100ml）=%（ 100ml+需加水）6）氮的標準溶液：a精確稱取克硫酸銨溶于水并稀釋至 1000ml，得到1ml含有氮的標準液 標準曲線繪制：吸取配置好的氮溶液10ml，加蒸餾水定容至100ml，吸取稀釋的 標準液1，3，5，7, 9，11，13ml，移至50ml容量瓶，加蒸餾水至20ml，再加入4ml苯酚鈉，仔細混合，加入3ml次氯酸鈉，充分搖蕩，放置20分鐘后顯色,用水稀釋至刻度。1h內(nèi)將著色液在紫外分光光度計上于 578nm處進行比色測定,以標準溶液濃度為橫坐標，以光密度值為縱坐標繪制曲線

6、圖。1）稱取10g（5g）過20目篩的風干土樣于100ml（50ml）三角瓶中。2）向容量瓶中加入2ml （1ml）甲苯（以能全部使土樣濕潤為度）并放置 15分鐘。3）之后加入20ml （ 10ml） 10%尿素溶液和40ml （20ml）檸檬酸緩沖液（），并 仔細混合。4）將容量瓶放入37攝氏度恒溫箱中，培養(yǎng)24h5）培養(yǎng)結(jié)束后，用熱至38攝氏度水稀釋至刻度,仔細搖蕩，并將懸液用致密濾紙過濾于三角瓶中。與此同時，進行以水代替基質(zhì)（10ml 10%尿素用10ml蒸餾水6代替），及無土對照測定。6）顯色：吸取3ml濾液于50ml容量瓶中，加入20ml （10ml）蒸餾水，充分震蕩，然后加入4ml

7、苯酚鈉，仔細混合，再加入 3ml次氯酸鈉，充分搖蕩，放置 20分鐘，用水稀釋至刻度，溶液呈現(xiàn)靛酚的藍色。7） 1h內(nèi)在（靛酚的藍色在1h內(nèi)保持穩(wěn)定）在分光光度計上用1cm液槽，于578nm處將顯色液進行比色測定。8）無土對照：不加土樣，其他操作與樣品實驗相同。以檢驗試劑純度，整個實驗設(shè)置一個對照。9）無基質(zhì)對照：以等體積的水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實驗相同。每個土樣都設(shè)此對照。結(jié)果計算：土壤脲酶活性以24小時后100g 土壤中NH3- N的毫克數(shù)表示。M=（ X樣品一X無土一 X無基質(zhì)）*100*10 式中：Mk土壤脲酶活性值X樣品一一樣品實驗的光密度值在標準曲線上對應的NH3- N毫克數(shù)X無

8、土一一無土對照實驗中的光密度值在標準曲線上對應的NH3- N毫克數(shù)X無基質(zhì)無基質(zhì)對照實驗中的光密度值在標準曲線上對應的NH3- N毫克數(shù)100 樣品定容的體積與測定時吸取量的比值10 酶活性單位的土重與樣品土重之比值若土壤脲酶活性以24小時后100g 土壤中NHJ N的毫克數(shù)表示的話，計算如下:M=a*2a樣品實驗的光密度值在標準曲線上對應的NH3- N毫克數(shù)。2換算成1g 土的系數(shù)。土壤蔗糖還原酶測定方法 酶促反應試劑:1)2)磷酸緩沖液：1/15M磷酸氫二鈉（-2H2O溶于1L蒸餾水）加1/15M磷酸二氫鉀（KH2P0溶于1L蒸餾水中）即成。3)甲苯4）3,5-二硝基水楊酸試劑（DNS試劑

9、）：稱二硝基水楊酸,溶于20ml 2mol/L NaOH和50ml水中,再加30g酒石酸鉀鈉，用水稀釋定容至100ml（保存期不過7天）。三、操作步驟（1）標準曲線繪制：將葡萄糖現(xiàn)在50-58 C條件下真空干燥至恒重，然后稱取 500mg溶于100ml苯甲酸溶液中（5mg還原糖/ml ）,即成標準葡萄糖標液。吸5mg/mL的標準葡糖糖溶液10m仃100ml容量瓶中，定容。從中吸取0、2、 3m1于50m1容量瓶，加DNS式劑3mL混勻，于沸水浴中準確反應5min（從試管放入重新沸騰時算起）,取出立即冷水浴中冷卻至室溫，定容。即為濃度為0ppm2ppm4ppm 8ppm12ppm15ppm 20

10、ppm 30ppm的標準曲線。以空白管調(diào)零在波長 508nm處比色，以0D值為縱坐標，以葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線。（2） 土壤蔗糖酶測定 稱取土壤，置于100mL容量瓶中，注入30ml 8%糖溶液，磷酸緩沖液和1m1甲苯。搖勻混合物后，放入恒溫箱，在37C下培養(yǎng)24h。到時取出，迅速過濾。從中吸取 濾液2-10ml （1ml）（適量，無蔗糖對照吸取20m1）,注入50ml容量瓶中，加3m1DNS 試劑,并在沸騰的水浴鍋中加熱5min,隨即將容量瓶移至自來水流下冷卻 3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水楊酸而呈橙黃色,最后用蒸餾水稀釋至 50m1,并在分光光度計上于508mn處進行比色

11、。（為了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引 起的誤差,每一土樣需做無基質(zhì)對照，整個試驗需做無土壤對照：如果樣品吸光值 超標曲的最大值，則應該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。）（3）結(jié)果計算：蔗糖酶活性以24h后1g 土壤葡萄糖的毫克數(shù)表示。葡萄糖（毫克）=a*4a代表從標準曲線查到的葡萄糖毫克數(shù) 4代表換算成1克土的系數(shù)過氧化氫酶活性測定一一容量法1.試劑配制過氧化氫溶液：將10m130%&過氧化氫用水稀釋至 1L,此溶液不穩(wěn)定,需臨時配置。硫酸:濃硫酸溶于水,再用蒸餾水稀釋至100mlKMnO4溶液:稱取化學純高錳酸鉀,溶于1升蒸餾水中,貯于棕色瓶中,備用。如果知道酶活性很高的話可以適當

12、變化高錳酸鉀濃度2.操作步驟 取5g（2g）過1mn風于土，置于150mL（ 100ml）三角瓶中，并注入10mL（40ml）蒸餾水和% H2O2容液。同時設(shè)置對照,即三角瓶中注入10mL蒸餾水和5mL%過氧化氫溶液,而不加土樣，并作無士對照。將三角瓶放在振蕩機振蕩（120r/min）30min 后,加入5mL L硫酸,以穩(wěn)定未分解的過氧化氫,再將瓶中是懸液用慢速型濾紙過濾，吸取 25mL濾液，用L高錳酸鉀滴定至淡粉色終點。（30s不退色）3. 結(jié)果計算以單位土重消耗的L高錳酸鉀毫升數(shù)（對照與試驗測定的差）表示土壤過氧化氫 酶活性,其計算式為:土壤過氧化氫酶活性（ml KMn04/g干土）=（V0-V）/m式中,V0:為滴定空白（25ml過氧化氫）所消耗的高錳酸鉀毫升數(shù)（m1）V:為滴定試樣所消耗的高錳酸鉀毫升數(shù)（ml） m為烘干土壤重量（g）或者：30min后1g 土壤過氧化氫酶活性=（V0-V）*T（ T為高錳酸鉀滴定度的校