近岸海洋細菌的群體感應(yīng)與生物膜形成關(guān)系

1、第49卷󰀁第6期󰀁2010年11月廈門大學學報(自然科學版)JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)Vol.49󰀁No.6Nov.2010󰀁近岸海洋細菌的群體感應(yīng)與生物膜形成關(guān)系黃妙琴,郭󰀁峰,柯才煥*(廈門大學海洋與環(huán)境學院海洋技術(shù)與工程系,福建廈門361005)摘要:檢測分離獲得的43株海洋細菌的群體感應(yīng)信號分子及生物膜形成能力,評估細菌群體感應(yīng)信號分子與生物膜形成能力之間的關(guān)系.結(jié)果顯示,高絲氨酸內(nèi)酯類化合物活性菌株(10株)中90%的菌株(9株)有很強的生物膜形成能

2、力,且10株中的7株(70%)所形成的生物膜存在明顯的細胞團.具有AI󰀁2活性的菌株中67%的菌株具有較強的生物膜形成能力.結(jié)果中具有AHLs活性的菌株往往形成強的生物膜,并常能形成較大的細胞團.許多不能產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子的菌株也具有較強的生物膜形成能力,可見對于環(huán)境細菌,群體感應(yīng)信號分子的存在特別是AHLs的存在,趨向于是細菌生物膜形成的充分非必要條件.關(guān)鍵詞:AHLs;AI󰀁2;生物膜;群體感應(yīng);弧菌;芽孢桿菌中圖分類號:Q93󰀁󰀁󰀁󰀁文獻標識碼:A󰀁󰀁b

3、3041;󰀁󰀁文章編號:0438󰀁0479(2010)06󰀁0863󰀁08󰀁󰀁20世紀70年代最早在海洋發(fā)光細菌費氏弧菌(Vibriofischeri)中發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)(Quorumsensing,簡稱QS)現(xiàn)象1致病菌所形成的生物膜往往是一些慢性和頑固性疾病難以根治的主要原因5.在海洋環(huán)境中,細菌生物膜是6󰀁7,它是細菌之間信息交流的一種方式,污損生物的重要組成部分,并且能誘導海洋污損動植物的附著變態(tài),與生物污損的形成關(guān)系密切.生物膜形成過程中群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控受到學

4、者的關(guān)注.Davies等8將群體感應(yīng)與生物膜形成聯(lián)系在一起,研究發(fā)現(xiàn)不能產(chǎn)生特定AHLs信號分子的銅綠假單胞桿菌(PseudomonasaeruginosaPA01)突變菌株形成了扁平、均質(zhì)的生物膜,而野生型菌株則形成了有結(jié)構(gòu)的、異質(zhì)化的生物膜.人為添加信號分子后,突變菌株又能形成成熟的生物膜,證實信號分子在銅綠假單胞桿菌生物膜的形成過程中的作用,類似的發(fā)現(xiàn)在革蘭氏陽性菌(Streptococcusmutans)中也有同樣的報道.生物膜與群體感應(yīng)系統(tǒng)之間的關(guān)系的研究主要集中在醫(yī)學上,在環(huán)境中特別是海洋環(huán)境中的單一細菌群體感應(yīng)現(xiàn)象與其生物膜形成能力的關(guān)系未見相關(guān)報道.由于海洋細菌的多樣性,采用模

5、式菌進行研究往往不具有代表性.在本研究中,我們檢測了數(shù)十株近岸海洋細菌的AHLs和AI󰀁2群體感應(yīng)系統(tǒng)與其生物膜形成能力的關(guān)系.研究結(jié)果將為深入了解海洋細菌生物膜形成機制及其生理生態(tài)提供參考.9即細菌產(chǎn)生一些稱為自誘導物(Autoinducer,AI)或信號分子的小分子化學物質(zhì)進入環(huán)境中,并通過感應(yīng)信號分子濃度感知細菌群體的密度,從而調(diào)控特定基因的表達2.已有的研究表明,革蘭氏陰性細菌產(chǎn)生的信號分子為N󰀁乙酰高絲氨酸內(nèi)酯(Acyl󰀁homoserinelac󰀁tones,AHL),革蘭氏陽性細菌則以寡肽類(Autoin♦

6、41;ducingpeptide)為信號分子,這兩種信號分子具有種內(nèi)特異性.除此外,許多革蘭氏陰性和陽性細菌都可以產(chǎn)生一類呋喃酰硼酸二酯(Furanosylbaoratediester,AI󰀁2)的信號分子,與前面兩種信號分子不同,一般認為AI󰀁2是自然狀態(tài)下細菌種間細胞交流的通用信號分子.目前已知群體感應(yīng)系統(tǒng)能夠調(diào)控細菌的多種生物學功能如生物發(fā)光、抗生素合成、致病基因的表達、群游現(xiàn)象和生物膜的形成等3.細菌生物膜存在于生活中的方方面面,它是一些微生物細胞由自身產(chǎn)生的多聚基質(zhì)(主要為多糖)所包圍而形成的,且附著在浸有液體的惰性或生物表面的,常具有結(jié)構(gòu)的聚合體.在

7、自然水環(huán)境的固體表面、臨床醫(yī)學、工業(yè)環(huán)境中都觀察到生物膜的存在4.在污水處理凈化中,生物膜的作用至關(guān)重要,而在醫(yī)學上的一些󰀁󰀁收稿日期:2010󰀁03󰀁16基金項目:國家自然科學基金資助項目(40676081);廈門市科技項目(3502Z20073014)1󰀁材料與方法1.1󰀁菌株及培養(yǎng)基,為本!864!廈門大學學報(自然科學版)󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁ϗ

8、041;󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁2010年實驗室保藏菌株.待測菌株采用16SrRNA基因序列分析法鑒定種類.平板劃線得出菌株單菌落,挑取單菌落進行PCR擴增.采用通用細菌引物27F(5󰀂󰀁AG󰀁AGTTTGATCCTGGCTCAG󰀁3󰀂)和1492R(5󰀂󰀁GGT󰀁TACCTTGTTACGACTT󰀁3󰀂).PCR反應(yīng)體

9、系為25󰀁L,反應(yīng)條件:94 3min;94 30s,50 30s,72 90s,循環(huán)30次;72 延伸10min.反應(yīng)后,經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖電泳,檢測擴增片斷大小和特異性.擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后,送廈門閩博生物技術(shù)有限公司測試.序列在GenBank中利用BLAST進行比對.除本實驗室分離的待測菌外,銅綠假單胞桿菌由丹麥TimTolker󰀁Neilson教授贈送;根癌膿桿菌(AgrobacteriumtumefaciensJZA1)KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410),Ti󰀁由南京農(nóng)業(yè)大學朱軍教授惠贈;哈維氏弧菌(Vibri

10、oharveyi)BB170(luxN:Tn5:sensor1,sensor2)、哈維氏弧菌BB120為ATCC保藏菌株.待測菌上清液與AHLs檢測菌株根癌膿桿菌KYC55共培養(yǎng),根據(jù)根癌膿桿菌KYC55產(chǎn)生的󰀂󰀁半乳糖苷酶的活性來測定AHLs的量.采用Bassler等10以哈維氏菌構(gòu)建的生物發(fā)光檢測菌哈維氏弧菌BB170來定量AI󰀁2活性,此檢測系統(tǒng)通過將哈維氏弧菌BB170與待測菌株的上清液共培養(yǎng),根據(jù)哈維氏弧菌BB170的發(fā)光強度來定量待測菌株產(chǎn)生AI󰀁2的量.哈維氏弧菌BB120為野生株,能夠產(chǎn)生AHLs和AI♦

11、41;2,在AI󰀁2檢測實驗中,以哈維氏弧菌BB120的上清液誘導哈維氏弧菌BB170的發(fā)光值為陽性對照.待測菌株均在2216E(蛋白胨5g,酵母浸粉1.0g,磷酸高鐵0.1g,pH7.0,1000mLLyma和Flem󰀁ing配方人工海水基1311-+國)測其在600nm的吸光值(OD600),然后測定菌液的󰀂󰀁半乳糖苷酶活性,其測定方法參照Miller14的方法:在2mL的離心管中依次加入檢測菌液0.2mL,Zbuffer(Na2HPO4!7H2O16.1g,NaH2PO4!H2O5.5g,KCl0.75g,MgSO4!7H2

12、O0.245g,󰀂󰀁mer󰀁captoethanol2.7mL,pH7.0,蒸餾水1000mL,4 保存)0.8mL,質(zhì)量分數(shù)為0.05%的十二烷基硫酸鈉10󰀁L,氯仿15󰀁L,震蕩10s,加入4mg/mL鄰硝基苯󰀁 󰀁D󰀁吡喃葡萄糖苷(ONPG)0.1mL,開始記時,當溶液變黃時,加入1mol/LNa2CO30.6mL中止反應(yīng),記錄時間為T(如果溶液沒變黃,120min后停止實驗),將終止的反應(yīng)液離心(10000r/min,3min),取上清測其420nm處的吸光值

13、(OD420),根據(jù)酶活力的定義,按照以下公式計算󰀂󰀁半乳糖苷酶活性:Millerunits=420,OD600TV式中T以min為單位,V代表反應(yīng)中的菌液的體積.已有相關(guān)報道8明確銅綠假單胞桿菌PA01能夠產(chǎn)生AHLs活性,因此在本實驗以其為陽性對照菌.此外在實驗中還以10󰀁mol/LN󰀁(󰀂󰀁Ketocaproyl)󰀁DL󰀁homoserinelactone(Sigma,美國)為陽性對照,以新鮮的2216E培養(yǎng)液為陰性對照.AHLs活性測定改良Zhu等15的方法.

14、1.2.2󰀁AI󰀁2活性檢測檢測方法參考文獻16,簡述如下:哈維氏弧菌BB170在AB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),用新鮮的AB培養(yǎng)液按1#5000稀釋,在白色不透明的96孔板(Costar,Corning,美國)孔內(nèi)分別加入180󰀁L的哈維氏弧菌BB170稀釋液和20󰀁L待測菌的上清液,以2216E培養(yǎng)液為陰性對照,哈維氏弧菌BB120的上清液為陽性對照.將96孔板置于30 中培養(yǎng),用酶標儀(Genios󰀁DNA,Tecan,瑞士)檢測哈維氏弧菌BB170的發(fā)光值,實驗結(jié)果為5h的化學發(fā)光值.以哈維氏弧菌BB120的無菌上清

15、液為陽性對照,新鮮的2216E培養(yǎng)基為陰性對照.AI󰀁2活性測定參考Bassler等的研究17,以哈維氏弧菌BB120誘導BB170的發(fā)光值為AI󰀁2活性100%,實驗數(shù)據(jù)給出的AI󰀁2活性值是待測菌誘導哈維氏弧菌BB170的發(fā)光值與哈維氏弧菌BB120誘導的哈維氏弧菌BB170的發(fā)光值的百分比值.1.3󰀁細菌成膜能力檢測采用結(jié)晶紫染色法在96孔板中檢測細菌生物膜的形成能力,挑取單菌落至液體2216E中過夜培1L9618)中培養(yǎng),AT培養(yǎng)基12用于培養(yǎng)根癌膿桿菌KYC55菌株及AHLs活性檢測,AB培養(yǎng)用于培養(yǎng)哈維氏弧菌BB170

16、菌株及AI󰀁2活性檢測,培養(yǎng)及實驗檢測溫度一般控制在30 .1.2󰀁細菌群體感應(yīng)信號分子檢測待測菌上清液制備方法:待測菌株分別接種到液體2216E培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)24h,收集菌液,6000r/min,離心5min,取上清,用0.22󰀁m孔徑的針筒過濾器(Millex󰀁GP,Millipore,美國)過濾除菌即得到純上清液并分裝成小份,-20 無菌保存?zhèn)溆?1.2.1󰀁AHLs活性檢測將100󰀁L待測菌上清液添加入接種有檢測菌根癌膿桿菌KYC55的AT培養(yǎng)基(900󰀁L)中,28 振

17、,(第6期󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁黃妙琴等:近岸海洋細菌的群體感應(yīng)與生物膜形成關(guān)系!865!孔板孔中,30 下培養(yǎng)20h,用酶標儀(680XR,Bio󰀁Rad,美國)測600nm處的吸光值,即為懸浮菌的OD600值,棄去培養(yǎng)液,甲醛溶液固定5min,洗去固定液,加入質(zhì)量分數(shù)為0.1%的結(jié)晶紫水溶液50󰀁L染色5min,棄去染色液,用去離子水洗至液體無色,倒

18、置微生物鏡(DMIL,LeicaMicrosystems,德國)觀察生物膜的結(jié)構(gòu)并拍照,自然干燥后,加200󰀁L無水乙醇洗脫,測600nm處的吸光值,以O(shè)D600值評估生物膜量,實驗設(shè)3個平行組.󰀁變形桿菌亞門中有3株屬于紅細菌目(Rhodobacteraceae),其中有1株玖瑰桿菌(Ro󰀁seobactersp.),赤細菌(Erythrobactersp.)、副球菌(Paracoccussp.)、短波單胞菌(Brevundimonassp.)各有1株;!󰀁變形桿菌亞門有8個屬,弧菌(Vibriosp.)12株,交替假單胞菌(P

19、seudoalteromonassp.)3株,希瓦氏菌(Shewanellasp.)3株,假單胞菌(Pseudomonassp.)2株,鹽單胞菌(Halomonassp.)2株,交替單胞菌(Alteromonassp.)、產(chǎn)微球莖菌(Mi󰀁crobulbifersp.)、發(fā)光桿菌(Photobacteriumsp.)各1株;革蘭氏陽性菌中芽孢桿菌(Bacillussp.)11株,喜鹽芽孢桿菌(Halobacillussp.)1株.2.2󰀁細菌群體感應(yīng)信號分子檢測如表1所示,有10株菌的AHLs活性大于300Millerunits,分布在2個類群,1株為 b

20、3041;變形桿菌亞門,9株為!󰀁變形桿菌亞門.具有AHLs活性的菌株分別來自弧菌(7株),鹽單胞菌(1株),希瓦氏菌(1株),玖瑰桿菌(1株).弧菌中58.3%的菌具有AHLs活性,2󰀁結(jié)果與分析2.1󰀁細菌分離及菌種鑒定以細菌16SrRNA基因序列測定并與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源性比較,比對結(jié)果如表1所示.分離出的43株菌可分為3個類群,6株 󰀁變形桿菌亞門( 󰀁Proteobacteria),25株!󰀁變形桿菌亞門(!󰀁Pro󰀁teobacteria),1

21、2株革蘭氏陽性菌(Gram󰀁positive).在表1󰀁待測菌16SrRNA基因序列測定及AHLs活性、AI󰀁2活性、生物膜形成力檢測結(jié)果Tab.1󰀁Theresultsof16SrRNAgeneaffiliation,activityofAHLsandAI󰀁2,biofilm󰀁formingcapacityof43isolates序列相似菌株16SrRNA基因比對結(jié)果度最高菌株序列號Alpha󰀁proteo󰀁bacteriaABI2SP2󰀁10SP2

22、󰀁12SP2󰀁11SP2󰀁7SP2󰀁5Gammap󰀁roteoba󰀁cteriaANFCu1Alteromonassp.EF061420973110.91.790.43+氧化亞銅防污涂料表面海水室內(nèi)培養(yǎng)海水生物膜海綿體內(nèi)防污涂料表面ParacoccushomiensisPseudovibriodenitrificansBrevundimonasdiminutaErythrobactersp.RoseobactergallaeciensisRhodobacteralesbacteriumDQ34223

23、9AY486423DQ857897DQ985049AY881240AB294975969999989898414524234551983.43.612.21.761.190.890.371.771.180.370.170.460.381.050.99+ND+鮑體內(nèi)海綿體內(nèi)海綿體內(nèi)海綿體內(nèi)海綿體內(nèi)海綿體內(nèi)相似率/AHLs%活性AI󰀁2%生物膜(OD600)懸浮菌細胞團(OD600)直徑活性/形成能力來源󰀁󰀁SW2BFI1Halomonassp.Halomonassp.EU781513EU78151399100386565.51

24、30.950.44ND+SP1󰀁4ANF3PelagiobactervariabilisPhotobacteriumganghwenseAB167354AY960847989920211.320.450.91+ND!866!󰀁續(xù)表1廈門大學學報(自然科學版)󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁

25、;󰀁󰀁󰀁2010年序列相似菌株AB02BFI316SrRNA基因比對結(jié)果PseudoalteromonasrubraPseudoalteromonassp.度最高菌株序列號FJ457186FJ457244相似率/AHLs%99100活性2325AI󰀁2%13.34.5生物膜(OD600)1.170.74活性/形成能力懸浮菌細胞團(OD600)0.790.55直徑+ND來源󰀁󰀁鮑體表室內(nèi)培養(yǎng)海水生物膜防污涂料表面氧化亞銅防污涂料海水近岸天然生物膜近岸天然生物膜三丁基錫涂料表面海水?？w內(nèi)牡蠣體內(nèi)鮑體表

26、石莼表面海水海水海水?？w內(nèi)室內(nèi)培養(yǎng)海水生物膜海葵體內(nèi)牡蠣體內(nèi)ANF1ANFCu2SW5BF4BF5ANFT󰀁BTSW6AN2OYOABO1ULSW1SW2SW3AN7BFI4Pseudoalteromonassp.PseudomonaspseudoalcaligenesPseudomonassp.ShewanellaalgaeShewanellaalgaeShewanellasp.VibriogallicusVibrionatriegensVibrioparahaemolyticusVibriosp.Vibriosp.Vibriosp.Vibriosp.Vibriosp.Vi

27、briosp.Vibriosp.AM179825EU440977FJ416144DQ386137DQ386137EU563344AJ440009FM999825EU170469EU854943AF500207FJ457400FJ457474FJ457568FJ457568FJ45756899100%999910010010010099100999910010010010026841342518883442985546035542253042633119611.614.710.717.328.316.415.226.031.027.013.313.015.320.522.613.71.080.4

28、01.661.731.771.180.771.771.691.690.531.801.741.081.761.870.460.390.490.440.640.520.440.850.820.540.650.400.760.570.900.98NDND+ND+ND+ND+AN4OYO4Gram󰀁positivesABO1SP1󰀁3SP2󰀁10SP1󰀁2SP1󰀁8SP1󰀁6BFI2Vibriosp.Vibriosp.FJ457334EF587970991004167471289.021.01.701.7

29、20.500.41+BacillusmegateriumBacillusmegateriumBacilluspumilusBacilluspumilusBacillussp.Bacillussp.Bacillussp.FJ685764AB334764AB308441EU221329DQ084469EU281636FJ6609331009999999999100302434972427285.019.412.535.520.418.511.51.530.430.340.390.350.370.390.42+NDNDNDNDNDND鮑體內(nèi)海綿體內(nèi)海綿

30、體內(nèi)海綿體內(nèi)海綿體內(nèi)海綿體內(nèi)室內(nèi)培養(yǎng)海水生物膜海綿體內(nèi)海綿體內(nèi)海綿體內(nèi)海綿體內(nèi)海綿體內(nèi)SP2󰀁8SP1󰀁10SP2󰀁4SP1󰀁1SP2󰀁3Bacillussp.Bacillussp.Bacillussp.Bacillussp.Halobacillussp.DQ305286EU373352DQ985053EU107757AY505519999999999933233253315.728.217.00.590.671.260.340.430.990.260.32NDND+ND+108.30.2347.11.25b

31、3041;注:+表示細胞團直徑在1020󰀁m,+表示細胞團直徑大于20󰀁m,ND表示細胞團直徑小于10󰀁m或者不存在細胞團.第6期󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁黃妙琴等:近岸海洋細菌的群體感應(yīng)與生物膜形成關(guān)系!867!󰀁󰀁圖1󰀁4株菌的生物膜結(jié)構(gòu)圖󰀁󰀁Fig.1

32、83041;Thebiofilmfromfourstrainsbyinvertedmicroscope弧菌屬細菌SW1、AN4、OYO4的AHLs活性均超過4000Millerunits,與銅綠假單胞桿菌PA01(4449Millerunits)相當,具有較強的AHLs活性.本實驗中具有AHLs活性的菌株只存在于革蘭氏陰性中,所有革蘭氏陽性菌均不具有AHLs活性.細菌AI󰀁2活性檢測結(jié)果見表1,以菌株哈維氏弧菌BB120誘導哈維氏弧菌BB170的發(fā)光值為100%活性,表1給出的是各實驗菌株誘導哈維氏弧菌BB170的發(fā)光值占BB120誘導BB170的發(fā)光值的百分比.在43株菌中A

33、I󰀁2活性大于20%的菌有15株,占待測菌數(shù)的34.9%,在3個類群中都有發(fā)現(xiàn),包括 󰀁變形桿菌亞門(1株),!󰀁變形桿菌亞門(9株),革蘭氏陽性菌(5株),分別來自于短波單胞菌(1株),弧菌(7株),希瓦氏菌(1株),產(chǎn)微球莖菌(1株),芽孢桿菌(5株).弧菌AN4、芽孢桿菌SP1󰀁1的AI󰀁2活性分別達到89.0%、108.3%,具有較強的AI󰀁2活性.AI󰀁2活性在10%20%之間的菌株有20株, 󰀁變形桿菌亞門2株,!󰀁變形桿菌亞門13株,革蘭

34、氏陽性菌5株.誘導發(fā)光強度大于10%的菌株共有35株,占總菌數(shù)的81.4%.陰性對照(僅添加2216E培養(yǎng)基)誘導菌株哈維氏弧菌BB170的發(fā)光值為0.48%.2.3󰀁細菌生物膜形成能力檢測h,用結(jié)晶紫染色法測定其生物膜形成能力,反映生物膜量的OD600值見表1,28株菌的生物膜的結(jié)晶紫染色洗脫液OD600值超過1.0,其中有17株菌的OD600值大于1.5,視為成膜能力強的菌株.這17株菌分屬于 󰀁變形桿菌亞門2株,!󰀁變形桿菌亞門14株,革蘭氏陽性菌1株.用倒置顯微鏡觀察待測菌在微孔板內(nèi)形成的生物膜結(jié)構(gòu),有18株菌所形成的細胞團的直徑大于20

35、󰀁m,包括弧菌7株,芽孢桿菌3株,假單胞菌、交替單胞菌、交替假單胞菌、希瓦氏菌、玖瑰桿菌、鹽單胞菌、產(chǎn)微球莖菌、副球菌各有1株.17株生物膜形成能力強菌中有14株菌所形成的細胞團的直徑大于20󰀁m,另外3株菌(希瓦氏菌1株,弧菌2株)所形成的細胞團的直徑在1020󰀁m之間.圖1顯示的是倒置顯微鏡拍攝的4株細菌在96孔板中所形成的生物膜.與菌BFI1、SP1󰀁1的生物膜相比,菌株AN4和SP1󰀁4所形成的生物膜表面不均一,團聚現(xiàn)象明顯,并不是均勻平鋪在基底表面.2.4󰀁群體感應(yīng)信號分子與生物膜形成能力

36、的相關(guān)性細菌群體感應(yīng)信號分子與生物膜形成能力的關(guān)系匯總見表2.表中把󰀂󰀁半乳糖苷酶的活性值大于300Millerunits的菌株定為AHLs活性強的菌株,AI󰀁2時為A󰀁10%!868!廈門大學學報(自然科學版)󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁表2󰀁細菌群體感應(yīng)信號分子與生物膜形成能力關(guān)系󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁ϗ

37、041;󰀁󰀁󰀁2010年󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁Tab.2󰀁Therelativitiesbetweenquoun󰀁sensingsingalmoleculesandbiofilm󰀁formingcapacity󰀁󰀁󰀁(株)類型AHLs群體感應(yīng)信號分子活性強(10)c弱(33)dAI󰀁2強(15)e弱(28)f生物膜形成能力強a90%(9)58%(19)67%(10)63

38、%(18)弱b10%(1)42%(14)33%(5)36%(10)>2070%(7)33%(11)53%(8)36%(10)細胞團直徑/󰀁m201010%(1)18%(6)13%(2)18%(5)<1020%(2)48%(16)34%(5)46%(13)󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁注:a.生物膜的結(jié)晶紫染色洗脫液OD6001.0;b.生物膜的結(jié)晶紫染色洗脫液OD600<1.0;c.󰀂󰀁半乳糖苷酶的活性值大于300Millerunits;d.無AHLs活性;e.AI&#

39、983041;2活性大于20%;f.AI󰀁2活性小于20%.的菌株AI󰀁2活性較弱或者無AI󰀁2活性.生物膜的結(jié)晶紫染色洗脫液OD600大于1.0的菌株定為生物膜形成能力較強的菌株,而小于該值定為生物膜形成能力相對較弱的菌株.本文10株具有AHLs活性的菌株均為革蘭氏陰性菌,其中90%的菌株具有強的生物膜形成能力,僅有1株菌的生物膜形成能力較弱,這10株菌中細胞團直徑大于20󰀁m的菌株達到70%,只有2株菌的細胞團直徑小于10󰀁m.對于幾乎沒有AHLs活性的菌株來說,生物膜的形成能力菌相對分散,且形成的細胞團的直徑

40、也大小不一.AI󰀁2活性普遍存在于本實驗所檢測的菌株(誘導發(fā)光強度大于10%的菌株占總菌數(shù)的81.4%),相比與AHLs活性,AI󰀁2活性與其生物膜形成能力之間的相關(guān)性較低,在不同的AI󰀁2活性菌中生物膜形成能力強的菌株分布的概率是類似的,但是所形成的細胞團直徑的大小存在著差異.在AI󰀁2活性大于20%的15個菌株中細胞團直徑大于20󰀁m的菌株達到53%,只有15%的菌株細胞團直徑小于10󰀁m,而在無AI󰀁2活性的菌株中,細胞團直徑小于10󰀁m的菌株達到63%,僅25

41、%的菌株形成大的細胞團.本實驗中生物膜形成能力強的17株菌(洗脫液OD600值大于1.5)中有15株菌(88.2%)具有AHLs活性或AI󰀁2活性或者兩者都有.圖2是AHLs活性、AI󰀁2活性及生物膜成膜能力的菌株分布示意圖,由圖可知,具AHLs活性菌株大都為成膜能力強的菌株;與AHLs活性菌株相比,AI󰀁2活性菌株只有一半左右的菌株成膜能力強;同時具有AHLs及AI󰀁2活性的菌株(4株)均具有較強的生物膜形成能力.可見,AHLs活性與成膜能力具有很強的相關(guān)性,而AI󰀁2活性與成膜能力之間的相關(guān)性相對目前主要采用檢

42、測菌產(chǎn)生特征性的變化檢測群體感應(yīng)信號分子的存在和濃度,該方法操作簡便,費用較低且能進行高通量檢測.如McClean等19采用轉(zhuǎn)座子構(gòu)建的紫色桿菌突變株CV026,通過紫色素的產(chǎn)生來檢測AHLs的存在;大腸桿菌(pKDT17)可以確定長鏈AHLs的存在20;Farrand等21構(gòu)建根癌膿桿菌NT1(pZLR4),它對酰基側(cè)鏈C󰀁3羰基取代的AHLs敏感性強.但是以上這些生物檢測菌對不同酰基側(cè)鏈長度以及不同取代基的AHLs分子具有不同程度的敏感性,如CV026不能檢測側(cè)鏈長度大于10個碳原子的AHLs,大腸桿菌(pKDT17)不能檢測短鏈AHLs17和3󰀁羥基AHL

43、s.Zhu等進一步構(gòu)建根癌膿桿菌KYC55(pJZ384)(pJZ410)(pJZ372),通過󰀂󰀁半乳糖苷,AI󰀁2活性及生物膜成膜能力的菌株分布󰀁圖2󰀁AHLs活性、示意圖A.AHLs活性菌株,共有10株;B.AI󰀁2活性菌株,共有15株;C.生物膜形成能力強(OD6001.0)的菌株,共28株󰀁Fig.2󰀁TheschematicdiagramoftheactivityofAHLs,AI󰀁2andbiofilm󰀁forming3&

44、#983041;討󰀁論第6期󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁黃妙琴等:近岸海洋細菌的群體感應(yīng)與生物膜形成關(guān)系!869!多,而且檢測靈敏度很高,對某些AHLs的最低檢測濃度達到5nmol/L.本文采用根癌膿桿菌KYC55檢測AHLs的存在,最大程度排除由于生物檢測菌自身的局限性而產(chǎn)生的假陽性或者假陰性結(jié)果,因此得到的結(jié)果可靠性較高.另一方面,在迄今為止所發(fā)現(xiàn)的能產(chǎn)生AI♦

45、41;2的菌株中,AI󰀁2的生物合成途徑及合成過程的中間體都是一樣的,且都需要LuxS蛋白的參與22,因此可用PCR擴增luxS基因的核心序列間接檢測菌株是否具有AI󰀁2活性.目前通用的AI󰀁2檢測方法是通過把待測菌上清液與菌株哈維氏弧菌BB170共培養(yǎng),根據(jù)哈維氏弧菌BB170的發(fā)光情況來檢測是否具有AI󰀁2活性,該方法能夠直接檢測AI󰀁2的存在.群感效應(yīng)的存在與生物膜息息相關(guān).這是因為,在群感效應(yīng)過程中,細菌的密度(這里的密度,指的是三維空間分布密度,即單位體積中的細胞個數(shù))往往要達到很高,而自然情況下,懸浮細

46、菌往往至多只能達到1010mL,一般小于10mL,在成熟生物膜中的細菌則可達到1011mL-1以上.此外,如果水體是開放性的,信號分子必然會很快地擴散到水體中,難以發(fā)揮其作用.而生物膜的存在方式是細菌的聚集體,大量細胞被胞外多聚物所包被有利于將信號分子保持在細23菌個體周圍.Huang等從天然生物膜中分離了68株菌,并在21株菌中檢測到AHLs活性,該文作者認為在天然生物膜形成過程中,AHLs起著重要的作用.本實驗中具有AHLs活性的菌株往往形成強的生物膜,并能形成較大的細胞團.一般認為AHLs具有種內(nèi)特異性,細菌通過分泌AHLs調(diào)控自身的生物膜的形成.另一方面,信號分子AI󰀁

47、2更普遍存在于本實驗所檢測的菌株中,相對于AHLs,菌株AI󰀁2信號分子活性與其生物膜形成能力之間的相關(guān)性較低.但是考慮到自然環(huán)境中復(fù)雜的多菌種生物膜及AI󰀁2的種間非特異性,AI󰀁2信號分子在調(diào)控混合生物膜中起著重要的作用.McNab24等研究表明AI󰀁2對Streptococcusgordonii和Porphyromonasgingivalis的混合生物膜的形成是必需的.我們推測在自然環(huán)境中,細菌向外分泌AI󰀁2信號分子,影響其它屬的細菌共同形成生物膜.生物膜的形成受外界環(huán)境、細菌本身(鞭毛、纖毛、胞外聚合物、

48、群體感應(yīng))等因素共同影響,本實驗中許多不能產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子的菌株也具有較強的生物膜形成能力,可見對于環(huán)境細菌,群體感應(yīng)信號系統(tǒng)的存在,特別是AHLs系統(tǒng)的存在趨向于是細菌生物膜形成的充分非必要條件.分析本實驗中兩個優(yōu)勢種群弧菌和芽孢桿菌群體感應(yīng)信號分子與生物膜形成能力之間的相關(guān)性.在弧89-1-1道,本實驗所檢測的12株弧菌中的11株能產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子,且在這11株弧菌中只有1株菌的生物膜的形成能力較弱(OD600=0.53)其余都具有較強的生物膜形成能力,進一步證實在弧菌屬細菌中AHLs與生物膜形成之間的密切關(guān)系是普遍存在.芽孢桿菌屬細菌的生物膜普遍存在于自然環(huán)境中,但是在我們所分離

49、檢測的所有11株芽孢桿菌屬細菌中,除2株菌生物膜形成能力較強外(OD600>1.0),其余菌株生物膜形成能力相對較弱,考查其信號分子活性,只有2株菌的AI󰀁2活性小于10%,芽孢桿菌屬細菌群體感應(yīng)信號分子AI󰀁2可能不能調(diào)控自身的生物膜形成.本實驗中其他屬的細菌株數(shù)較少,實驗所獲得的數(shù)據(jù)不能較準確地判斷其他屬的群體感應(yīng)信號分子與生物膜形成能力之間的相關(guān)性.本文采用生物方法檢測海洋細菌的群體感應(yīng)信號分子的活性,但測定各菌株分泌的AHLs的具體種類可經(jīng)過反相C18薄層色譜(TLC)或者HPLC進一步檢測,這將是我們后續(xù)的工作.致謝:感謝南京農(nóng)業(yè)大學朱軍教授贈送

50、菌株根癌膿桿菌,感謝丹麥TimTolker󰀁Neilson教授贈送銅綠假單胞桿菌.25參考文獻:1󰀁HastingsJW,NealsonKH.BacterialbioluminescenceJ.AnnuRevMicrobiol,1977,31:549󰀁595.2󰀁MillerMB,BasslerBL.QuorumsensinginbacteriaJ.AnnuRevMicrobiol,2001,55:165󰀁199.3󰀁FederleMJ,BasslerBL.Interspeciescommunica

51、tioninbacteriaJ.JClinInvest,2003,112(9):1291󰀁1299.4󰀁DaveyME,O󰀂TooleGA.Microbialbiofilms:fromecolo󰀁gytomoleculargeneticsJ.MicrobiolMolBiolRev,2000,64(4):847󰀁867.5󰀁MortonL,GreenwayD,GaylardeCC,etal.Considerationofsomeimplicationsoftheresistanceofbiofilms

52、tobio󰀁cidesJ.InternationalBiodeterioration&Biodegrada󰀁tion,1998,41(3/4):247󰀁259.6󰀁WieczorekSK,ToddCD.Inhibitionandfacilitationofsettlementofepifaunalmarineinvertebratelarvaebymi󰀁crobialbiofilmcuesJ.Biofouling,1998,12(1):81󰀁118.7󰀁QianPY,LauS

53、C,DahmsHU,etal.Marinebiofilmsasmediatorsofcolonizationbymarinemacroorganisms:im󰀁plicationsforantifoulingandaquacultureJ.MarBio󰀁technol(NY),2007,9(4):399󰀁410.8󰀁DaviesDG,ParsekMR,PearsonJP,etal.Theinvolve󰀁mentofcell󰀁to󰀁cellsignalsinthedevelopment

54、ofabacte󰀁rialbiofilmJ.Science,1998,280(5361):295󰀁298.9󰀁LiYH,TangN,AspirasMB,etal.Aquorum󰀁sensingsignalingsystemessentialforgeneticcompetenceinSisJ.!870!廈門大學學報(自然科學版)󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁b

55、3041;󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁2010年JBacteriol,2002,184(10):2699󰀁2708.10󰀁BasslerBL,WrightM,ShowalterRE,etal.Intercellu󰀁larsignallinginVibrioharveyi:sequenceandfunctionofgenesregulatingexpressionofluminescenceJ.Molecu󰀁larMicrobiology,2006,9(

56、4):773󰀁786.11󰀁LymanJ,FlemingRH.CompositionofseawaterJ.JMarRes,1940,3(2):134󰀁146.12󰀁FuquaWC,WinansSC,GreenbergEP.Quorumsens󰀁inginbacteria:theLuxR󰀁LuxIfamilyofcelldensity󰀁re󰀁sponsivetranscriptionalregulatorsJ.JBacteriol,1994,176(2):269

57、83041;275.13󰀁GreenbergEP,HastingsJW,UlitzurS.Inductionoflu󰀁ciferasesynthesisinBeneckeaharveyibyothermarinebacteriaJ.ArchivesofMicrobiology,1979,120(2):87󰀁91.14󰀁MilerJH.ExperimentsinmoleculargeneticsM.NY:ColdSpringHarbor,1972.15󰀁ZhuJ,ChaiY,ZhongZ,etal.Agrobacte

58、riumbioassays󰀁trainforultrasensitivedetectionofN󰀁acylhomoserinelactone󰀁typequorum󰀁sensingmolecules:detectionofau󰀁toinducersinMesorhizobiumhuakuiiJ.ApplEnvironMicrobiol,2003,69(11):6949󰀁6953.16󰀁SuretteMG,BasslerBL.QuorumsensinginEscherich𘀀

59、1;iacoliandSalmonellatyphimuriumJ.ProcNatlAcadSciUSA,1998,95(12):7046󰀁7050.17󰀁BasslerBL,GreenbergEP,StevensAM.Cross󰀁speciesinductionofluminescenceinthequorum󰀁sensingbacteri󰀁umVibrioharveyiJ.JBacteriol,1997,179(12):4043󰀁4045.18󰀁O󰀂TooleGA

60、,PrattLA,WatnickPI,etal.Geneticap󰀁proachestostudyofbiofilmsJ.MethodsEnzymol,1999,310:91󰀁109.19󰀁MccleanKH,WinsonMK,FishL,etal.QuorumsensingandChromobacteriumviolaceum:exploitationofviolaceinproductionandinhibitionforthedetectionofN󰀁acylho󰀁moserinelactonesJ.Micr

61、obiology,1997,143(12):3703󰀁3711.20󰀁PearsonJP,PassadorL,IglewskiBH,etal.AsecondN󰀁acylhomoserinelactonesignalproducedbyPseudo󰀁monasaeruginosaJ.ProcNatlAcadSciUSA,1995,92(5):1490󰀁1494.21󰀁FarrandSK,QinY,OgerP.Quorum󰀁sensingsystemofAgrobacteriumplasmids:analysisandutilityJ.Meth󰀁odsE