改良大豆子葉節(jié)再生體系的研究_圖文

1、V ol 132,N o 12pp 1223-227Feb 1,2006作物學報ACT A AG RONOMICA SI NICA第32卷第2期2006年2月223227頁改良大豆子葉節(jié)再生體系的研究李明春1蔡易1趙桂蘭2財音青格樂1周皓1孫偉1邢來君1,(1南開大學微生物學系、天津市微生物功能基因組學重點實驗室,天津300071;2吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室,吉林公主嶺136100摘要:采用大豆種子萌發(fā)56d 后的子葉節(jié)作外植體,對農(nóng)桿菌介導的大豆遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)及其影響因素進行了研究。結(jié)果表明,將子葉節(jié)與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)60h 后放入含卡那霉素50mg/L 的誘芽培養(yǎng)基上,待苗長至45

2、cm 后放入生根培養(yǎng)基中進行生根,最后移栽到培養(yǎng)土中,效果較好。對大豆遺傳轉(zhuǎn)化再生的主要因素,如大豆基因型、誘導出芽所需激素濃度、卡那霉素篩選壓力等條件做了一系列的研究,建立了一個比較好的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),其轉(zhuǎn)化率達到218%。關鍵詞:大豆;子葉節(jié);轉(zhuǎn)基因植株中圖分類號:S565Improvement of Cotyledon N ode R egeneration System in Soybean(Glycine max LI M ing 2Chun 1,C AI Y i 1,ZH AO G ui 2Lan 2,C AI 2YIN Qing 2G e 2Le 1,ZH OU Hao 1,S U

3、N W ei 1and XINGLai 2Jun 1,3(1Department of M icrobiology ,Nankai University ,T ianjin K ey Laboratory of M icrobiol Functional G enom ics ,T ianjin 300071;2Provincial K ey Open Laboratory on Agro 2Biotechnology ,Jilin Academy of Agricultural Sciences ,G ongzhuling 136100,Jilin ,China Abstract :T ra

4、nsgenic crops such as soybean and cotton have been widely planted nowadays in China 1M any efforts have been made to im prove the quality of soybean ,which is one of the main crops in China 1Although transgenic legume has been put into the spotlight ever since 1984when the first transgenic soybean w

5、as success fully obtained ,setting up an effective trans formation and regeneration system of soybean is still a challenge to investigators 1C otyledon nodes from soybean seeds germ inating for 56d were used in Agrobacterium tumef aciens 2mediated trans formation system as explants to study the fact

6、ors affecting the trans formation rate 1The explants were first in fected withAgrobacterium tumef aciens strain LBA4404containing pBI121by 60hours co 2cultivation 1A fter washed with sterile water ,the explants were then put onto shoot 2inducing medium containing kanamycin for selection 1Then ,the i

7、nduced seedlings in 45centimeters long were trans ferred onto root 2inducing medium 1Finally ,they were transplanted into soil when the roots had formed ,and identified by PCR and S outhern blot 1The trans formation rate was affected by three factors in this process 1H orm one concentration was rega

8、rded as the m ost im portant factor in the regeneration system ,so I BA as the phytohorm one and 62BA as the m itogen ,with different concentrations were used to induce buds and roots formation 1A relatively optimal system with 117mg/L 62BA and 015mg/L I BA was acquired in which the budding percenta

9、ge reached 81%1G enotype of the soybean was regarded as the second im portant factor in the trans formation system 1F our different kinds of soybean cultivars were used to test the in fluences of genotypes on trans formation rate 1Am ong them ,the trans formation percentage of X iaoli D ou was up to

10、 29%,nearly one fold higher than Heinong 101Agrobacterium tumef aciens strain LBA4404could in fect plants and trans fer its gene into the plants 1The process took place in the co 2cultivation period 1S o the co 2cultivation period was also im portant in the trans formation system 160h co 2cultivatio

11、n with weak light was appropriate in our experiment ,and faint mark of colonies could be seen after the co 2cultivation 1T ransgenic plants were m ore resistant to kanamycin than untransgenic ones that could be killed on the medium with基金項目:國家自然科學基金(30200176和天津市重點基金(013802511項目。作者簡介:李明春(1968,女,天津人,博

12、士,教授,主要從事分子微生物學與真菌學的研究。3通訊作者(C orresponding author :邢來君。T el :86222223508506;Fax :86222223508800;E 2mail :xinglaij ey ou 1comReceived (收稿日期:2004212220;Accepted (接受日期:20052052311kanamycin1But high levels of kanamycin w ould also do harm to the transgenic ones1S o,right concentration,about50mg/L in ou

13、r test,was required to differentiate the trans formed and untrans formed plants1In conclusion,main causes that have obvious effects on the trans formation and regeneration rates are the genotype of soybean,the horm one concentration for inducing buds and the kanamycin sensitivity on inducing and liv

14、ability of the buds1 A relatively g ood genetic trans formation and regeneration system has been established,with which the trans formation rate can reach to218%1K ey w ords:S oybean;C otyledon node;T ransgenic plant大豆的遺傳轉(zhuǎn)化研究于1984年被首次報道1,2,目前主要采用農(nóng)桿菌介導法、花粉管通道法、基因槍法和PEG介導法等。在大豆再生體系中,不定芽器官發(fā)生再生體系是目前公認為比

15、較成熟易行的,其外植體內(nèi)已存在的分生組織和有分化潛力的表皮、亞表皮細胞都可作為遺傳轉(zhuǎn)化的靶組織。Cheng等3首先報道用無菌苗的子葉節(jié)為外植體,在含高濃度BA(1050m ol/L的改良B5培養(yǎng)基上誘導叢生芽獲得高頻率的再生植株。隨后Di 等4以卡那霉素為篩選劑將BPM V(Bean P od M ottle Virus外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入大豆,Zhang等5以bar基因作選擇標記基因,用除草劑草苷膦進行篩選獲得轉(zhuǎn)化植株,但該系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化頻率較低。本試驗采用農(nóng)桿菌介導法,轉(zhuǎn)化大豆無菌苗子葉節(jié),進一步研究其遺傳轉(zhuǎn)化再生系統(tǒng),以期為改良大豆農(nóng)藝品質(zhì)性狀提供技術(shù)儲備。1材料與方法111材料11111大豆品

16、種黑農(nóng)10號、吉林35、吉林43和小粒豆等4個優(yōu)良品種由吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室提供。11112菌種和質(zhì)粒根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumef aciensLBA4404,質(zhì)粒pBI121由本實驗室保存,該質(zhì)粒的左右邊界序列間含有一個K an抗性基因和G US基因。11113培養(yǎng)基培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌用YE B培養(yǎng)基,見文獻6,大豆組培用培養(yǎng)基MS B為MS培養(yǎng)基的無機鹽加上B5培養(yǎng)基的維生素,見文獻7。11114生化試劑各種限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程(大連有限公司。PCR用Taq酶,dNTP為上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司產(chǎn)品。寡核苷酸引物由上海生工公司合成。“DIG

17、 DNA Labeling and Detection K it”購自R oche公司。培養(yǎng)基所需的各種氨基酸、抗生素及常規(guī)試劑均為國產(chǎn)。112方法11211農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及制備從保存在4平板上的農(nóng)桿菌中挑取含有表達載體的農(nóng)桿菌單菌落接入含有100mg/L K an的YE B培養(yǎng)基,28振蕩培養(yǎng)(0136×g1820h左右至對數(shù)期,然后用MS液體培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD為014,作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的工程菌液。11212激素水平對大豆子葉節(jié)出芽率的影響誘芽培養(yǎng)基為MS B培養(yǎng)基,附加細胞分裂素62BA和生長素I BA,其中62BA設計了015、111、117三個梯度, I BA設012、015

18、、110三個梯度,采用正交法進行分析。培養(yǎng)4周后計算大豆子葉節(jié)的出芽率。11213不同大豆品種對轉(zhuǎn)化率的影響用方法11211制備的農(nóng)桿菌液浸泡大豆子葉節(jié)外植體15 min,之后以共培養(yǎng)(B5+10mg/L62BA+20g/L Sucrose+0153g/L MES pH518培養(yǎng)基弱光(5490m olm2s1培養(yǎng)60h,最后轉(zhuǎn)入誘芽培養(yǎng)基(MS B +117mg/L62BA+015mg/L I BA+30g/L Sucrose+ 0153g/L MES+50mg/L kanamycin+500mg/L cephalothin pH518,20d后對形成的愈傷組織進行G US染色檢測。1121

19、4G US活性測定大豆細胞中G US基因的表達基本按文獻8測定。大豆組織在含E DT A10 mm ol/L、磷酸鈉緩沖液100mm ol/L、亞鐵氰化鉀015 mm ol/L、高鐵氰化鉀015mm ol/L、011%(W/V XG luc的溶液中37保溫過夜,之后用70%的酒精浸泡除去葉綠素。11215卡那霉素對大豆選擇壓力試驗載體pBI121上的植物篩選標記基因為卡那霉素抗性,設置了0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L和100mg/L6個梯度對大豆子葉節(jié)出芽率和再生芽存活率進行選擇壓力試驗,其中每個梯度接種100個422作物學報第32卷子葉,于2528下培養(yǎng)4

20、周,計算子葉節(jié)的出芽率和再生芽的存活率,出芽率按出芽的子葉節(jié)數(shù)占總子葉節(jié)的比率計算。11216轉(zhuǎn)基因大豆的獲得將無菌小粒豆置萌發(fā)培養(yǎng)基(B 5+012mg/L I BA +20g/L Sucrose +MES 0153g/L ,pH 518培養(yǎng)5d 后,切取子葉節(jié)外植體500個,放入預培養(yǎng)基(B 5+62BA 10mg/L +Sucrose 20g/L +MES 0153g/L pH 518弱光培養(yǎng)36h ,之后用根癌農(nóng)桿菌進行浸染,農(nóng)桿菌OD 600在014左右,浸染15min 后放在濾紙上吸干殘液, 將浸染完畢的大豆子葉節(jié)放入共培養(yǎng)基培養(yǎng)60h ,接著轉(zhuǎn)入誘芽培養(yǎng)基,約20d 后將誘導形成

21、的抗性小苗轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基(MS B +110mg/L 62BA +30g/L Sucrose +0153g/L MES +50mg/L kanamycin +500mg/L cephalothin ,pH 518,待抗性小苗長至5cm 左右時,將其連帶底部少量愈傷組織切下,轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(MS B +015mg/L NAA +20g/L Sucrose +0153g/L MES ,pH 518,待長出發(fā)達的根系后轉(zhuǎn)入土中進一步生長。11217PCR 檢測分別提取轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)基因大豆再生苗的基因組D N A ,方法見文獻9。根據(jù)G US 基因序列設計上游引物52G A AG AG G A T C

22、 C C CG G G TG G T C AG 23及下游引物52CT TG G AC A T TG C A T TG CT T T CG A A AG G A T A 23,于25L 體系中進行PCR 擴增,其反應為942m in ,941m in ,601m in ,722m in ,30個循環(huán),最后725m in ,PCR 產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳。11218S outhern 雜交分別提取轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)基因大豆再生苗的基因組DNA ,按文獻6方法轉(zhuǎn)移至正電尼龍膜上,在紫外交聯(lián)儀中照射5min 。以G US 基因序列為探針,按地高辛標記及顯色試劑盒說明書進行標記和顯色。2結(jié)果與分析211

23、激素水平對大豆子葉節(jié)出芽率的影響由表1可以看出在62BA 和I BA 濃度都較低時,出芽率偏低,這可能是由于激素水平太低,不足以刺激植物細胞分化。而在激素水平升高以后,62BA 和I BA 兩種激素的相對含量成為決定子葉節(jié)出芽率的重要因素,當62BA 濃度遠高于I BA 時,傾向于出芽,而在62BA 濃度接近或低于I BA 時,出芽率下降,且隨著培養(yǎng)時間的增長,在形成的愈傷組織上誘導出根。表1不同激素濃度對大豆子葉節(jié)外植體分化率的影響T able 1The effect of di fferent hormone levels on di fferentiation of soybean ex

24、plants62BA (mg/L I BA (mg/L 出芽數(shù)Budding explants 出根數(shù)R ooting explants 出芽率Budding percentage (%110653070212大豆基因型對轉(zhuǎn)化率的影響4個大豆品種各取200個外植體在農(nóng)桿菌浸染后轉(zhuǎn)至誘芽培養(yǎng)基,培養(yǎng)2周后將子葉節(jié)處形成的少量愈傷組織切下,進行G US 染色,結(jié)果如圖1及表2所示。由表2可以看出測試的4個品種轉(zhuǎn)化率差異較大,轉(zhuǎn)化率最高的小粒豆為29%,幾乎是黑農(nóng)10號的2倍。說明在大豆子葉節(jié)再生系統(tǒng)中,大豆品種的選擇至關重要。圖1大豆子葉節(jié)愈傷組織GU S 染色Fig 11GU S stainin

25、g of cotyledon nodes callus of soybeana :轉(zhuǎn)基因愈傷組織;b :未轉(zhuǎn)化愈傷組織。a :transgenic callus ;b :untrans formed callus 1表2不同大豆品種對轉(zhuǎn)化率的影響T able 2E ffect of di fferent soybean cultivarson transform ation rate of explants品種Cultivar轉(zhuǎn)化數(shù)T rans formed explants轉(zhuǎn)化率T rans formation percentage (%黑農(nóng)10號Heinong 10301510吉林35Ji

26、lin 35432115吉林43Jilin 43422110小粒豆X iaolidou582910213卡那霉素的選擇壓力試驗6個濃度的卡那霉素對小粒豆子葉節(jié)外植體出芽率的影響如圖2所示。最終我們選擇了50mg/L 的卡那霉素抗性作為使用濃度。522第2期李明春等:改良大豆子葉節(jié)再生體系的研究 圖2大豆子葉節(jié)外植體出芽率和再生芽存活率對卡那霉素的敏感性Fig 12Ch anges in induction and livability ofthe buds on k anamycin concentrations214轉(zhuǎn)基因大豆的獲得采用上述系統(tǒng),轉(zhuǎn)化小粒豆子葉節(jié)外植體結(jié)果如表3所示,得到了2

27、18%的轉(zhuǎn)基因苗。表3轉(zhuǎn)基因大豆數(shù)據(jù)統(tǒng)計表T able 3Statistics of transgenic soybeans子葉節(jié)數(shù)C otyledon nodes500抗性再生苗數(shù)Regenerated seedlings with K an resistance 43PCR 陽性苗數(shù)PCR positive seedlings14斑點雜交陽性數(shù)D ot blot positive sam ples14S outhern 雜交陽性數(shù)S outhern blot positive sam ples14215轉(zhuǎn)基因大豆的PCR 檢測待大豆在土中生長一段時間以后,用CT AB 法提取大豆轉(zhuǎn)化再生苗

28、葉片中的總DNA ,以方法11217中的PCR 反應條件進行擴增電泳,如圖3所圖3轉(zhuǎn)基因大豆的PCR 鑒定Fig 13Identification of transgenic soybean by PCR a :未轉(zhuǎn)化大豆的PCR 產(chǎn)物;b :G US 基因PCR 產(chǎn)物;c ,d ,e ,f :轉(zhuǎn)基因大豆的PCR 產(chǎn)物;g :分子量標準D L2000。a :PCR products of untrans formed s oybean ;b :PCR product of G US gene ;c ,d ,e andf :PCR products oftransgenic s oybean ;

29、g :marker (D L20001示。轉(zhuǎn)基因植株中能夠見到一條明顯的亮帶,從分子量看該PCR 產(chǎn)物與G US 基因PCR 產(chǎn)物一致,而未轉(zhuǎn)化植株無此帶。216轉(zhuǎn)基因大豆的Southern 雜交檢測選取PCR 檢測陽性的轉(zhuǎn)基因植株總DNA ,用Hin d 充分酶切后與G US 基因探針進行雜交檢測,用PCR 表現(xiàn)陽性的樣品進行地高辛S outhern 分子雜交,結(jié)果陽性對照和轉(zhuǎn)基因植株顯示特征帶,陰性對照沒有帶(圖4。由于Hin d 僅在G US 基因外的質(zhì)粒上有一個酶切位點,因此從圖4可以看出,轉(zhuǎn)基因植株中的外源基因均為單拷貝。圖4轉(zhuǎn)基因大豆的Southern 雜交鑒定Fig 14Iden

30、tification of transgenic soybean by Southern bolt hybridizationa :未轉(zhuǎn)化大豆;b ,c ,d :轉(zhuǎn)基因大豆;e :陽性對照。a :untrans formed s oybean ;b ,c and d :transgenic s oybean ;e :positive CK 13討論311大豆子葉節(jié)再生系統(tǒng)大豆是公認難轉(zhuǎn)化的植物之一,首例轉(zhuǎn)基因大豆植株誕生于1988年,由M onsanto 公司和Agracetus 公司同時報道9210后大量學者對其遺傳轉(zhuǎn)化再生系統(tǒng)作了深入的研究,然而一直難以獲得令人滿意的結(jié)果。植物基因轉(zhuǎn)化的成

31、功,有賴于建立一個良好的組培再生系統(tǒng),而在這個系統(tǒng)中,大豆子葉節(jié)的出芽率及轉(zhuǎn)化率又是最為重要的因素。影響大豆子葉節(jié)出芽率的諸多因素中,激素水平的選擇至關重要。我們選擇了生長素I BA 、細胞分裂素62BA ,并對其最佳使用濃度作了一系列探索。在很多植物當中都發(fā)現(xiàn)高濃度的細胞分裂素有利于植物細胞的分化,而高濃度的生長素則有利于622作物學報第32卷生根。本實驗結(jié)果與大多數(shù)報道相符2,11,在62BA 濃度較I BA高時,大豆子葉節(jié)愈傷組織傾向于出芽,在兩者濃度接近時,則傾向于生根。在轉(zhuǎn)化率方面我們認為大豆的基因型是最為關鍵的影響因素之一。王嵐等11報道黑農(nóng)35、中作975、合豐35、中作962是

32、在再生方面比Thorne更好的品種,而William82、黑農(nóng)35、中作975、PI361066轉(zhuǎn)化頻率較高。本實驗通過對大豆子葉節(jié)愈傷組織的G US染色檢測發(fā)現(xiàn)吉林小粒豆的轉(zhuǎn)化率最高,吉林35、吉林43次之,黑農(nóng)10最低。吉林小粒豆不僅染色的比率高,單個愈傷組織染出來的體積也大。此外,農(nóng)桿菌與被浸染的植物組織共培養(yǎng)時間也是決定轉(zhuǎn)基因效率的重要因素。共培養(yǎng)時間過短,外源基因轉(zhuǎn)入植物組織的效率太低;而共培養(yǎng)時間太長,農(nóng)桿菌的過度浸染又會極大損害植物組織,造成子葉節(jié)的褐化。經(jīng)過長時間的摸索,在浸染時間為15min,農(nóng)桿菌菌濃OD為014時將共培養(yǎng)時間定為60h,共培養(yǎng)結(jié)束后大豆子葉節(jié)周圍能看到淡淡

33、的菌落。抗生素篩選是取得轉(zhuǎn)基因苗的主要手段,然而過高的選擇壓力會導致轉(zhuǎn)基因苗的死亡,而過低的篩選壓力則會產(chǎn)生大量的抗性苗為后期的檢測帶來不便。本實驗設計了6個篩選梯度,發(fā)現(xiàn)在50100 mg/L的范圍內(nèi)均有理想的抑制效果,最終將K an的濃度定為50mg/L。312MES的加入對培養(yǎng)基pH的穩(wěn)定作用MS B培養(yǎng)基由于緩沖能力比較弱,滅菌后培養(yǎng)基的pH下降幅度較大,在015左右,這對組培非常不利。MES的加入能提高培養(yǎng)基的緩沖能力,穩(wěn)定其pH值,使其滅菌前后的pH值僅差011。313生根培養(yǎng)基發(fā)達的根系對于后期抗性苗移栽的存活極為重要,而相對于組培苗而言,抗性苗轉(zhuǎn)入誘導生根的培養(yǎng)基后時常出現(xiàn)不生

34、根只長高的現(xiàn)象。針對這點采取了以下措施:(1取消生根培養(yǎng)基中的卡那霉素篩選壓力;(2將抑制農(nóng)桿菌生長的頭孢霉素由500 mg/L降低為250mg/L;(3適當降低蔗糖濃度,由30 g/L降為20g/L;(4以濃度為015mg/L的NAA作為生根培養(yǎng)基中的外加成分。最后抗性再生苗取得了100%的出根率,出根時間為20d左右,且形成的根系發(fā)達。314轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測效率目前轉(zhuǎn)基因苗多采用PCR、S outhern雜交等手段進行檢測。但發(fā)現(xiàn)在組培期間,大量抗性苗的基因組通過PCR檢測都能得到陽性的結(jié)果,而進行G US 染色和S outhern雜交時卻只有少數(shù)苗才能得到陽性的結(jié)果,這主要因組培期間

35、依附在植物表面的農(nóng)桿菌污染所造成。而在移入土中一段時間后取新長成的葉片提取基因組進行PCR結(jié)果與G US染色和S outhern雜交的結(jié)果則可保持一致。因此在組培期間對抗性再生苗的檢測應以目的基因產(chǎn)物是否表達和S outhern雜交結(jié)果為準,而在移入土中一段時間后可用較為簡便的PCR方法進行鑒定。R eferences1H orsch R B,Fraley R T,R ogers S G,Sanders P R,Lloyd A,H offmannN1Inheritance of functional foreign genes in plants1Science,1984,223: 49649

36、82H inchee M A W,C onnor2W ard D V,Hewell C A,M cD onnell R E,SatoS J,G asser C S,Fischhoff D A,Re D B,Fraley R T,H orsh R B1 Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium2mediated DNA trans fer1Biotechnol,1988,19:91993Cheng T Y,Saka H,Thanh H V1Plant regeneration from soybeancotyledon node segments in culture1Plant Sci Letter s,1980,19:9199 4Di R,Purcell V,C ollins