質(zhì)粒提取及雙酶切鑒定

1、LOGO質(zhì)粒提取及雙酶切鑒定質(zhì)粒提取及雙酶切鑒定2011年年5月月9日日 主要內(nèi)容主要內(nèi)容實(shí)驗(yàn)?zāi)康募霸韺?shí)驗(yàn)?zāi)康募霸?實(shí)驗(yàn)過程實(shí)驗(yàn)過程2實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果3思考題思考題4一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康募霸矶?、?shí)驗(yàn)原理v質(zhì)粒質(zhì)粒(Plasmid) (Plasmid) ： 獨(dú)立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的獨(dú)立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子，是一種環(huán)狀的雙鏈遺傳因子，是一種環(huán)狀的雙鏈DNADNA分子。分子。 存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。 本實(shí)驗(yàn)采用本實(shí)驗(yàn)采用SDSSDS（十二烷基硫酸鈉）堿裂解法

2、提?。ㄊ榛蛩徕c）堿裂解法提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA。將細(xì)菌懸浮液暴露于高。將細(xì)菌懸浮液暴露于高pHpH值的強(qiáng)陰離子洗滌值的強(qiáng)陰離子洗滌劑中，會(huì)使細(xì)胞壁破裂，染色體劑中，會(huì)使細(xì)胞壁破裂，染色體DNADNA和蛋白質(zhì)變性，將和蛋白質(zhì)變性，將質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA釋放到上清中。在裂解過程中，細(xì)菌蛋白質(zhì)、釋放到上清中。在裂解過程中，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNADNA會(huì)相互纏繞成大型復(fù)會(huì)相互纏繞成大型復(fù)合物，被十二烷基硫酸鹽包蓋。當(dāng)用合物，被十二烷基硫酸鹽包蓋。當(dāng)用K K+ +取代取代NaNa時(shí)，這時(shí)，這些復(fù)合物會(huì)從溶液中有效地沉淀下來。離心除去變性劑些復(fù)合物會(huì)

3、從溶液中有效地沉淀下來。離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNADNA。v 限制性核酸內(nèi)切酶（限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonucleaserestriction endonuclease）是一）是一類能識(shí)別雙鏈中特定堿基順序的核酸水解酶，這類能識(shí)別雙鏈中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)。些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)。v 根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否具有修飾根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為酶活性可分為、型三大類，我們這里用到的是型三大類，我們這里用到的是型。型。v 型限制性內(nèi)

4、切酶它們能識(shí)別雙鏈的特異順序，型限制性內(nèi)切酶它們能識(shí)別雙鏈的特異順序，并在這個(gè)順序內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的片段。并在這個(gè)順序內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的片段。 如如EcoEcoRIRI的識(shí)別順序?yàn)椋旱淖R(shí)別順序?yàn)椋?5 G5 G| |AATTC 3AATTC 3 3 CTTAA 3 CTTAA| |G 5G 5 在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置切割后生成在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置切割后生成 5G AATTC3 5G AATTC3 3CTTAA G5 3CTTAA G5三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑（一）材料（一）材料 大腸桿菌大腸桿菌DH5DH5（含有攜帶插入片段（含有攜帶插入片段gcpgcp的質(zhì)粒的質(zhì)粒PMD19-TPMD19

5、-T）三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑（二）試劑（二）試劑 (1)(1)溶液溶液: : TrisHCl(pH8.0) 25mmol/L TrisHCl(pH8.0) 25mmol/L EDTA(pH8.0) 10mmol/L EDTA(pH8.0) 10mmol/L 葡萄糖葡萄糖 50mmol/L50mmol/L (2) (2)溶液溶液(新鮮配制新鮮配制) :) : NaOH 0.2mol/L NaOH 0.2mol/L SDS 1%(W/V) SDS 1%(W/V) (3)(3)溶液溶液(100ml):(100ml): 5mol/L 5mol/L乙酸鉀乙酸鉀 60ml60ml 冰乙酸冰乙酸 11.5ml(

6、pH4.8)11.5ml(pH4.8) 水水 28.5ml28.5ml (4) (4) 苯酚苯酚 (5) (5) 氯仿：異戊醇（氯仿：異戊醇（24:124:1） (6) (6) 無水乙醇、無水乙醇、70%70%乙醇、醋酸鈉（乙醇、醋酸鈉（pH5.2pH5.2）（三）限制性內(nèi)切酶（三）限制性內(nèi)切酶 1 1）EcoEcoRIRI 識(shí)別順序?yàn)椋鹤R(shí)別順序?yàn)椋? G5 G| |AATTC 3AATTC 3 3 CTTAA 3 CTTAA| |G 5G 5 2 2）XhoIXhoI 識(shí)別順序?yàn)椋鹤R(shí)別順序?yàn)椋? C5 C| |TCGAG 3TCGAG 3 3 GAGCT 3 GAGCT| |C 5C 5四、

7、實(shí)驗(yàn)步驟1. 1. 挑轉(zhuǎn)化后的單菌落接種到含有適當(dāng)抗生素挑轉(zhuǎn)化后的單菌落接種到含有適當(dāng)抗生素(Amp)(Amp)的的LBLB液液體培養(yǎng)基中體培養(yǎng)基中,37,37振蕩培養(yǎng)過夜。振蕩培養(yǎng)過夜。2. 2. 將將1ml1ml的培養(yǎng)物倒入的培養(yǎng)物倒入1.5ml1.5ml的的EPEP管中管中, , 44、12000rpm12000rpm離離心心1min1min。棄去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。棄去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。3. 3. 將細(xì)菌沉淀重懸于將細(xì)菌沉淀重懸于100100l l冰預(yù)冷的溶液冰預(yù)冷的溶液中中, , 吹打沉吹打沉淀至完全混勻淀至完全混勻( (無塊狀懸浮無塊狀懸浮) )。4. 4.

8、加加200200l l新配制的溶液新配制的溶液,立即溫和顛倒離心管立即溫和顛倒離心管5 5次，次，使菌體充分裂解使菌體充分裂解, , 切勿振蕩切勿振蕩! !將離心管放置于冰上將離心管放置于冰上1-1-2min2min。( (不要超過不要超過2min)2min)。5. 5. 加加150150l l用冰預(yù)冷的溶液用冰預(yù)冷的溶液III,III, 反復(fù)溫和顛倒反復(fù)溫和顛倒5 5次次, , 將將管置于冰上管置于冰上3 35min5min。6. 4 6. 4 、12000rpm12000rpm離心離心15min,15min,將上清液約將上清液約400ul400ul轉(zhuǎn)移到另轉(zhuǎn)移到另一離心管中。一離心管中。7

9、. 7. 加加1/21/2體積的苯酚，體積的苯酚，1/21/2體積的氯仿：異戊醇（體積的氯仿：異戊醇（24:124:1）振蕩混勻。振蕩混勻。 4 4 、12000rpm12000rpm離心離心10min10min，將上清液約，將上清液約400ul400ul轉(zhuǎn)移到另一離心管中。轉(zhuǎn)移到另一離心管中。8. 8. 加加2 2倍體積的無水乙醇和倍體積的無水乙醇和1/101/10體積的醋酸鈉沉淀質(zhì)粒體積的醋酸鈉沉淀質(zhì)粒DNA,DNA,振蕩混勻振蕩混勻, ,于于20 20 放置放置15min15min。9.4 9.4 、12000rpm12000rpm離心離心5min5min。小心除去上清液，將附于管。小心

10、除去上清液，將附于管壁的液滴除盡。壁的液滴除盡。10. 10. 加加1ml 701ml 70乙醇溶液洗滌沉淀，乙醇溶液洗滌沉淀，4 4 、12000rpm12000rpm離心離心5min5min。棄去上清液，在空氣中使。棄去上清液，在空氣中使DNADNA沉淀干燥。沉淀干燥。11. 11. 用用2020l l滅菌的蒸餾水溶解滅菌的蒸餾水溶解DNA,DNA,加加1 1l l胰胰RNARNA酶消化酶消化RNA 30minRNA 30min。（二）雙酶切及電泳檢測(cè)I 1.5ulI 1.5ulXhoI 1.5ulXhoI 1.5ul1010Buffer 2ulBuffer 2ulDDW 8ulDDW 8ul五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果v質(zhì)粒電泳圖質(zhì)粒電泳圖 有三條條帶，分別是超螺旋、線性和開環(huán)結(jié)構(gòu)