牛大力多糖對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的雙向調(diào)節(jié)作用

1、牛大力多糖對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的雙向調(diào)節(jié)作用                          作者：鄭元升，蒲含林，麻建軍【摘要】  目的 從牛大力(Millettia Speciosa Champ.)提取純化多糖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)多糖對(duì)刀豆蛋白A(Con A)刺激引起的小鼠T淋

2、巴細(xì)胞增殖的影響，探討牛大力多糖對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用機(jī)制，為臨床用牛大力治療多種慢性疾病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 提取、純化牛大力多糖，利用CFDA-SE染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)多糖對(duì)Con A刺激引起的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果 終濃度為160 g/mL、 800 g/mL、4 mg/mL、20 mg/mL的多糖對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖呈劑量依賴性抑制,而終濃度為5、25、50、125 g/mL的多糖對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖起促進(jìn)作用,劑量依賴關(guān)系不明顯。結(jié)論 牛大力多糖對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖呈雙向調(diào)

3、節(jié)作用。 【關(guān)鍵詞】  牛大力；多糖；T淋巴細(xì)胞；CFDA-SEAbstract:Objective The polysaccharide was extracted and purified from Millettia Speciosa Champ. Flow cytometry was used to investigated the effects of po

4、lysaccharide on mouse lymphocyte proliferation stimulated by Con A,the mechanism of the effects of polysaccharide on the immune system was explored and theoretical and experimental

5、 evidence for the clinical application of Millettia Speciosa Champ in treating chronic diseases were drawn.Methods  The polysaccharide was extracted and purified from Millettia

6、0;Speciosa Champ,CFDA-SE staining and flow cytometry were used to detect the effects of polysaccharide on mouse lymphocyte proliferation stimulated by Con A.Results  The polysaccha

7、ride has the function to inhibit the proliferation of lymphocyte of mouse depending on its concentration with 160 g/mL,800 g/mL,4 mg/mL,20 mg/mL in substrate,but promotes the&

8、#160;proliferation of T lymphocytes of mice lymph node at the concentrations of 5,25,50,and 125 g/mL,but the dose-dependent effect is not significant.Conclusion The polysaccharide extra

9、cted from Millettia Speciosa Champ has the two-way effects on T lymphocyte proliferation in mice lymph node stimulated by Con A.Key words:Millettia Speciosa Champ.; polysaccharide;

10、 T lymphocyte; CFDA-SE牛大力(Millettia Speciosa  Champ.)又叫山蓮藕、大力薯，豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤(Millettia speciosa  Champ.)的干燥根1，主產(chǎn)于廣東東部。牛大力用藥始載于生草藥性備要2，歷史悠久，性味甘、平，具有補(bǔ)虛潤(rùn)肺、強(qiáng)筋活絡(luò)的功用，臨床主要用來治療肺熱咳嗽、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損、胃潰瘍、慢性肝炎、肺結(jié)核等疾病1。早在20世紀(jì)70年代，牛大力作為壯腰健腎丸、強(qiáng)力健身膠囊的原料已用于中成藥的生產(chǎn)3。目前，對(duì)牛大力免疫活性

11、的研究有過報(bào)道4，但對(duì)其多糖藥理活性尚未見報(bào)道。本文提取、分離、純化牛大力多糖，鑒定多糖主要的理化性質(zhì)，并利用CFDA-SE染色、流式細(xì)胞術(shù)研究多糖對(duì)刀豆蛋白A(Con A)引起的T淋巴細(xì)胞增殖的影響,為闡明其對(duì)免疫系統(tǒng)的影響及臨床治療多種疾病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為牛大力的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。1  材料1.1  動(dòng)物   雄性SPF級(jí)Bal b/c小鼠,45周齡,體質(zhì)量(12±2) g,由中山大學(xué)動(dòng)物所提供(合格證號(hào)00A005)。1.2  試藥與儀器

12、60; 牛大力購(gòu)自廣州天河石牌東百康源大藥房，經(jīng)鑒定為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤(Millettia Speciosa  Champ.)的根；Vy-brantTMCFDA-SE Cell Tracer Kit(c-1288)購(gòu)自美國(guó)Molecular Probes公司；Con A、RPMI-1640、胎牛血清、L-谷氨酰胺、-二巰基乙醇均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；FAC-SCalibur流式細(xì)胞儀,為美國(guó)Becton Dickinson公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠。2 &#

13、160;方法與結(jié)果2.1  牛大力多糖的理化性質(zhì)測(cè)定2.1.1  牛大力多糖的提取和純化  稱取新鮮干燥的牛大力切片800 g，粉碎，用6倍量的水，加熱到90 煮1 h，過濾，再加5倍量的水,煮1 h后過濾，再重復(fù)1次，合并3次的濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，向濃縮液中加入無水乙醇使溶液中乙醇濃度達(dá)到80，析出大量白色絮狀沉淀，48 放置過夜后抽濾。再用適量的水溶解，加入總體積25%的Sevage試劑（三氯甲烷戊醇51），振搖后形成膠狀物，離心除去析出物和乳化層的蛋白，重復(fù)2次操作除盡蛋白。濃縮

14、上清液，裝入分子量范圍為8 00010 000的透析袋中于流動(dòng)的蒸餾水中透析過夜，將透析袋中溶液取出，濃縮后再加入無水乙醇至乙醇的濃度達(dá)到80，48 放置過夜后抽濾。將沉淀依次用丙酮、甲醇洗滌脫色，50 烘干即得到牛大力多糖5。2.1.2  多糖的含量測(cè)定  參照文獻(xiàn)6，7，采用蒽酮硫酸法檢測(cè)粗品中糖含量，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，得到線性回歸方程y=0.0047x-0.0003，計(jì)算得到牛大力多糖的糖含量為96.3。如圖1所示。圖1  蒽酮硫酸法測(cè)定牛大力多糖的糖含量（略）Fig.1 

15、0;Content of polysaccharide in Millettia Speciosa Champ. measured by sulfuric acid-anthrone2.2  牛大力多糖對(duì)Con A刺激引起的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響2.2.1  淋巴細(xì)胞懸液的制備  將Bal b/c小鼠斷髓處死，無菌取小鼠頸部、腋下、腹股溝以及腸系膜的淋巴結(jié),去掉被膜，200目篩網(wǎng)研磨過濾，收集細(xì)胞,用PBS離心(1

16、80×g,10 min)洗滌細(xì)胞2次,PBS重懸。2.2.2  淋巴細(xì)胞CFDA-SE染色  CFDA-SE用DMSO溶解成10 mmol/L的儲(chǔ)存液,-20 保存,臨用前,取適量用PBS稀釋成1 mmol/L的工作液,平衡至室溫備用。調(diào)整淋巴細(xì)胞懸液的密度為107cells/mL,細(xì)胞懸液按10 0001（體積比）加入CFDA-SE工作液后,在室溫條件下避光充分混勻10 min,然后用RPMI-1640完全培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)10%FBS)離心(180×g,10 m

17、in) 洗滌細(xì)胞2次,并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106cells/mL。2.2.3  多糖對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響  將上述經(jīng)CFDA-SE標(biāo)記的淋巴細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,分別設(shè)置空白對(duì)照組,Con A組,Con A多糖溶液實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組中多糖終濃度分別5、25、50、125、160、800 g/mL，4、20 mg/mL,定容至200 L/孔,上述各實(shí)驗(yàn)組Con A的濃度均為5 g/mL。在37 ,5% CO2溫箱培養(yǎng)48 h后對(duì)C

18、FSE熒光強(qiáng)度(FL1)進(jìn)行檢測(cè)。2.2.4  流式細(xì)胞儀檢測(cè)、分析及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)  羧基熒光素乙酰乙酸 (CFDA- SE)是一種染色細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白的熒光染料。本文采用的CFDA-SE標(biāo)記技術(shù)就是利用CFDA-SE隨細(xì)胞每增殖一代,熒光強(qiáng)度的系列減半特征,結(jié)合流式細(xì)胞術(shù),動(dòng)態(tài)追蹤分析細(xì)胞增殖的技術(shù),計(jì)算出增殖指數(shù)(proliferation index,PI),即增殖后的細(xì)胞總數(shù)與增殖前的細(xì)胞總數(shù)的比值),研究T細(xì)胞的增殖8,9。    從FAC-SCalibur流式細(xì)胞儀和CELLQue

19、st軟件獲取數(shù)據(jù)。在前散射(FSC)和對(duì)側(cè)散射(SSC)二維散點(diǎn)圖中劃出淋巴細(xì)胞區(qū)R,分別對(duì)每個(gè)組別的這群細(xì)胞的FL1強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。每管樣品檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞，獲得的數(shù)據(jù)用CELLQuest 軟件分析。統(tǒng)計(jì)方法用t檢驗(yàn),數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。    培養(yǎng)48 h后,空白對(duì)照組經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示細(xì)胞絕大部分處于親代峰,PI分別為1.01，1.00,表明T淋巴細(xì)胞沒有增殖(見圖2A、3A)。而Con A組，T淋巴細(xì)胞除了親代峰,還出現(xiàn)了子代峰 (見圖2B、3B),表

20、明Con A刺激48 h后，T淋巴細(xì)胞增殖顯著。與對(duì)照組相比，子代細(xì)胞熒光強(qiáng)度減半。    加入牛大力多糖作用48 h后,濃度為5、25、50、125 g/mL的多糖均對(duì)Con A刺激引起的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖起促進(jìn)作用，這些實(shí)驗(yàn)組的PI值均高于對(duì)應(yīng)的Con A刺激組，但不呈劑量依賴關(guān)系 (見圖2C 2F) 。而濃度為160 g/mL 、800 g/mL 、4 mg/mL、20 mg/mL的多糖實(shí)驗(yàn)組均對(duì)Co

21、n A刺激引起的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖起抑制作用,PI值均明顯低于ConA刺激組，并且呈劑量依賴性抑制 (見圖3C 3F) 。其中終濃度為160 g/mL 、800 g/mL 、4 mg/mL多糖實(shí)驗(yàn)組顯示親代峰和子一代、子二代峰(見圖3C 3E)。而終濃度為20 mg/mL,只顯示一個(gè)親代峰和一個(gè)微弱的子一代峰，PI值為1.03，接近完全抑制了Con A刺激引起的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖作用(見圖3F)。  圖2  低濃度牛大力多糖對(duì)Con&#

22、160;A刺激引起的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖影響的動(dòng)力學(xué)模型（略）Fig.2  The effects of polysaccharide extracted from from Millettia Speciosa  Champ.at low dose on mouse lymphocyte proliferation stimulated by Con A  

23、  綜上所述，牛大力多糖在終濃度為5、25、50、125 g/mL劑量時(shí)，對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖起促進(jìn)作用，但劑量依賴關(guān)系不明顯，在終濃度為160 g/mL、800 g/mL、4 mg/mL、20 mg/mL劑量時(shí),對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖呈劑量依賴性抑制。圖3  高濃度牛大力多糖對(duì)Con A刺激引起的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖影響的動(dòng)力學(xué)模型（略）Fig.3  The effects of polysaccharide extracted 

24、;from from Millettia Speciosa  Champ.at high dose on mouse lymphocyte proliferation stimulated by Con A表1  低濃度牛大力多糖對(duì)Con A刺激引起的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響（略）Tab.1  The effects of polysaccharide ex

25、tracted from from Millettia Speciosa  Champ.at low dose on mouse lymphocyte proliferation stimulated by Con A3  討論    本實(shí)驗(yàn)采用Con A刺激T細(xì)胞增殖以及牛大力多糖對(duì)Con A刺激引起T細(xì)胞增殖抑制或促進(jìn)作用,均能以CFSE熒光強(qiáng)度的改變表

26、現(xiàn)出來。通過CELLQuest軟件擬合，得到增殖指數(shù)，實(shí)現(xiàn)牛大力多糖對(duì)T細(xì)胞增殖影響的可視化及數(shù)量化、定量化，與傳統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞增殖的方法相比，該方法具有操作簡(jiǎn)單、使用方便、安全無輻射、觀察期長(zhǎng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，具有卓越的優(yōu)越性。表2  高濃度牛大力多糖對(duì)Con A刺激引起的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響（略）Tab.2  The effects of polysaccharide extracted from from Millettia Speciosa  

27、Champ.at high dose on mouse lymphocyte proliferation stimulated by Con A本研究發(fā)現(xiàn)牛大力多糖是牛大力調(diào)節(jié)免疫功能的主要活性成分之一。牛大力多糖對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖具有雙向調(diào)節(jié)作用。T細(xì)胞是整個(gè)免疫應(yīng)答反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞之一,干預(yù)T淋巴細(xì)胞的行為能有效地調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。這為探討牛大力具有抗炎和免疫增強(qiáng)等臨床效應(yīng)提供了線索。研究認(rèn)為肝炎等炎癥都直接或間接地與淋巴細(xì)胞活化與增殖相關(guān)。慢性肝炎的發(fā)病機(jī)制與輔助性T細(xì)胞(Th)等細(xì)

28、胞免疫功能密切相關(guān)10。由于高濃度的牛大力多糖能抑制T淋巴細(xì)胞的增殖，且具有明顯的劑量依賴性效應(yīng)。牛大力可能通過多糖來抑制T淋巴細(xì)胞的增殖,從而抑制Th細(xì)胞的功能來調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫。這或許是牛大力有效治療這些疾病的原因之一。報(bào)道的牛大力治療慢性肝炎的中醫(yī)藥方里,牛大力用量達(dá)到最多1。高劑量的牛大力藥方可能是為了形成一個(gè)較高濃度的多糖溶液。另外，牛大力具有補(bǔ)虛潤(rùn)肺、強(qiáng)筋活絡(luò)、壯身健體的功用，能增強(qiáng)機(jī)體的免疫力與抗病能力8,而低濃度的牛大力多糖能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖。因此推測(cè),牛大力可能通過多糖來促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低濃度牛大力多糖對(duì)T細(xì)胞的促進(jìn)效應(yīng)不具有明顯的劑量依賴關(guān)系。本研究為牛大力對(duì)免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用、對(duì)炎癥的抑制作用及免疫增強(qiáng)等藥理活性提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為臨床上使用牛大力治療肝炎等多種疾病提供了科學(xué)依據(jù)，加深了對(duì)牛大力多糖藥理作用的認(rèn)識(shí)，有利于合理、科學(xué)、有效地使用牛大力治療疾病。目前，以植物藥為主的傳