低濃度HBsAg人群臨床特征及免疫功能測定分析

1、低濃度HBsAg人群臨床特征及免疫功能測定分析                  作者：成軍, 孫長貴, 陳瑜, 許志良, 王國政, 孫關(guān)忠, 李曉軍  【摘要】  目的: 分析慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者高、 低濃度乙型肝炎表面抗原(HBsAg)人群血清雙特異性免疫復合物(TCIC)及外周血淋巴細胞亞群之間的差異, 以了解其臨床特征及與宿主免疫功能。方法: 采用捕捉法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELI

2、SA)和流式細胞術(shù)(FCM)分別測定44例低濃度HBsAg人群(A組)、 82例高濃度HBsAg人群(B組)、 22例健康體檢者(C組)血清TCIC和淋巴細胞亞群, 并進行分析比較。結(jié)果: A組90.9%(40/44)分布于非活動期, 以HBsAg/IgGCIC陽性率最高15.9%(7/44), B組以HBsAg/C3CIC陽性率最高46.3%(38/82); A組血清TCIC陽性率、 (A)值及非活動期的CD3+CD8+均低于B組或相應分期(P<0.01, P<0.05), CD4+/CD8+高于B組相應分期(P<0.01)。結(jié)論: 低濃度HBsAg人群機體TCIC形成和清

3、除能力均較低下, 且存在低劑量誘導的免疫耐受現(xiàn)象。 【關(guān)鍵詞】  免疫復合物; 慢性HBV感染; 乙型肝炎表面抗原; 淋巴細胞亞群; 免疫耐受低濃度乙型肝炎表面抗原(HBsAg)人群在感染性疾病診斷中已越來越引起臨床實驗室及流行病學專家的重視1, 2, 低濃度HBsAg的檢測與報告給臨床實驗室?guī)砹诵碌奶魬?zhàn), 給臨床的診斷和帶來了新的思考, 在流行病學方面, 低濃度HBsAg感染者在人群及慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染人群中的分布、 臨床特征、 血清學表現(xiàn)模式、 血清型、 基因型以及宿主的免疫功能與高濃度HBsAg感染者之間存在怎樣的差異都值得研究和探討, 為此我們對慢性HBV感染人

4、群以HBsAg濃度及自然史3進行分組研究, 采用捕捉法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和流式細胞術(shù)(FCM)分別測定血清雙特異性免疫復合物(TCIC, 包括HBsAg/IgGCIC、 HBsAg/IgACIC、 HBsAg/IgMCIC、 HBsAg/C3CIC)及淋巴細胞亞群(T細胞亞群、 B細胞、 NK細胞), 以了解低濃度HBsAg人群的臨床特征及宿主免疫功能。1  材料和方法1.1  材料  隨機收集日常門診、 住院患者及體檢人群慢性HBV感染者血清標本共148份, 其中低濃度HBsAg血清標本44份(A組, 以衛(wèi)生部臨床檢驗中心提供的HBsAg定值質(zhì)控血清

5、5 g/L為標準, HBsAg含量<5 g/L定義為低濃度, 經(jīng)ELISA篩選后Abbott Axsym免疫分析儀測定低濃度HBsAg含量<72±6.8S/N, 且經(jīng)中和試驗確證), 通過隨訪排除了HBV感染早期或恢復期HBsAg/抗HBs轉(zhuǎn)換階段出現(xiàn)的低濃度HBsAg標本, 根據(jù)自然史3分為非活動或低/非復制期(非活動期)40例、 免疫活動期2例、 免疫耐受期2例; 高濃度HBsAg血清標本共82份(B組, HBsAg含量>79S/N, 非活動期35例、 免疫活動期37例、 免疫耐受期10例); 另收集健康體檢者乙肝病毒血清學標志物(HBV M)全陰性標本22份作

6、為對照(C組); 上述所有受檢者無其他類型肝炎病毒和HIV感染史, A組、 C組及B組的非活動期和免疫耐受期HBV感染者無保肝、 降酶、 免疫調(diào)節(jié)劑和抗病毒藥物應用史, B組的免疫活動期HBV感染者在治療前采集標本或近半年內(nèi)無免疫調(diào)節(jié)劑及抗病毒藥物應用史; 血清標本置于-20保存待測, EDTAK2抗凝靜脈血標本在2 h內(nèi)測定?？谷薎gG、 IgA、 IgM單克隆抗體(mAb)包被酶標板由北京Sun Biomedical Technology Co., Ltd提供, 生物素化鼠抗人C3抗體包被酶標板購置美國Adlitteram Diagnostic Laboratories, Inc., HR

7、P抗HBs(多克隆抗體)及ELISA HBV M試劑由上?？迫A公司提供, 淋巴細胞亞群試劑購自法國Immunotech公司, 美國Abbott Axsym免疫分析儀及其HBV M配套試劑, 美國BioRad 550型酶標儀, 美國Coulter公司EPICSXL型流式細胞儀。1.2  方法1.2.1  血清TCIC測定  參照4進行操作, 其中結(jié)果以HBV M陰性的健康體檢者血清吸光度(A)值(x±2s)作為cutoff值來判斷陽性例數(shù)及記錄陽性結(jié)果的A值(x±s)。122  淋巴細胞亞群測定  取EDTAK2抗凝外周血10

8、0 L分別加入10 L CD3FITC/CD16+56PE/CD19PC5、 CD4FITC/CD8PE/CD3PECy5和同型對照抗體進行標記, 經(jīng)孵育、 溶血、 洗滌后由專業(yè)人員在流式細胞儀上進行CD3+、 CD3+CD4+、 CD3+CD8+、 CD3-CD19+、 CD16+56+百分率測定, CD4+/CD8+比值通過CD3+CD4+、 CD3+CD8+獲得。123  統(tǒng)計學分析  A、 B組各分期及C組之間的年齡比較采用中位數(shù)2檢驗, 性別、 血清TCIC陽性率及(A)值、 淋巴細胞亞群結(jié)果比較分別采用兩樣本的2檢驗或精確概率法和t檢驗, 所有數(shù)據(jù)處理均在SPS

9、S12.01統(tǒng)計軟件包上進行。2  結(jié)果21  臨床特點  A組44例低濃度HBsAg人群中(男28例, 女16例, 年齡1865歲, 中位年齡37歲), B組免疫耐受期年齡(男6例, 女4例, 年齡328歲, 中位年齡14歲)與A組非活動期、 B組非活動期及清除期、 C組之間存在顯著性差異(P<0.05), 其他各組及分期之間年齡、 性別均無統(tǒng)計學意義(P>0.05); 低濃度HBsAg人群90.9%(40/44)分布于非活動期, 呈低濃度表現(xiàn)達9個月8年, 平均1.8年, 其中2例免疫耐受期患者HBV DNA分別達1011copies/L和107c

10、opies/L, 2例免疫活動期患者中, 1例HBV DNA達109copies/L, 1例HBV DNA達106copies/L, ALT在5070 U/L之間, 40例非活動期患者中, 2例HBsAg/抗HBc陽性, 2例HBV DNA達106copies/L; 未發(fā)現(xiàn)低濃度HBsAg家族聚集現(xiàn)象及職業(yè)差別。22  血清TCIC及外周血淋巴細胞亞群測定  對3組人群的血清標本TCIC及外周血淋巴細胞亞群測定結(jié)果見表1、 2。表1  血清標本TCIC測定結(jié)果（略）aP<0.05, cP<0.05 vs非活動期;  bP<0.01,&#

11、160; dP<0.01 vs B組.表2  外周血標本淋巴細胞亞群測定結(jié)果（略）aP<0.05, bP<0.01 vs非活動期; cP<0.05, dP<0.01 vs C組.1         3  討論    將慢性HBV感染人群以HBsAg濃度及史進行分組研究, 對其血清TCIC進行了測定, 結(jié)果表明: 低濃度HBsAg組90.9%分布于非活動期(40/44), TCIC陽性率及A值均明顯低于高濃度HBsAg組, 說明了低濃度H

12、BsAg人群機體免疫復合物形成和清除能力低下。    免疫復合物是機體復雜免疫反應的特定產(chǎn)物, 是機體免疫狀態(tài)的反映4, 免疫復合物的形成既是清除有害抗原的一種保護性反應(如急性肝炎、 急性自限性肝炎), 但在一定條件下形成的免疫復合物又是對機體的一種致病因素(如慢性活動性肝炎), 是引起肝損傷或乙肝慢性化的病理分子基礎(chǔ), 并且TCIC在不同類型的HBV感染中存在異質(zhì)性和具有不同的病理生理意義5, 研究結(jié)果表明TCIC陽性率及A值不但在低濃度HBsAg組和高濃度HBsAg組中存在異質(zhì)性, 同時在低濃度HBsAg組和高濃度HBsAg組之間也存在一定的差異, 這可能是

13、由于B組的非活動期、 免疫活動期、 免疫耐受期相互之間經(jīng)歷過多次轉(zhuǎn)變的結(jié)果, 而低濃度HBsAg組則較長時期處于非活動期或在各分期相互之間較少發(fā)生轉(zhuǎn)變。    通過測定3組人群淋巴細胞亞群發(fā)現(xiàn): 低濃度HBsAg組非活動期的CD3+CD8+低于高濃度HBsAg組非活動期的CD3+CD8+(P<0.05), CD4+/CD8+則相反(P<0.01); 低濃度HBsAg組非活動期的各淋巴細胞亞群與C組無統(tǒng)計學意義, 而高濃度HBsAg組各分期中部分或全部的淋巴細胞亞群與C組存在顯著性差異(P<0.01或P<0.05); 結(jié)果提示, 

14、低濃度HBsAg組非活動期也存在免疫耐受現(xiàn)象, 我們認為屬于低劑量耐受(低濃度HBsAg), 而高濃度HBsAg組免疫耐受期存在的耐受現(xiàn)象6, 7應屬于高劑量耐受(高濃度HBsAg), 高濃度HBsAg組非活動期、 免疫活動期則存在免疫功能紊亂現(xiàn)象。    以往對HBV感染者研究的大多是以HBV無癥狀攜帶者(ASC)、 慢性乙型肝炎(CHB)、 急性乙型肝炎(AH)等臨床診斷進行分組研究的, 我們對低濃度HBsAg人群分析發(fā)現(xiàn), 低濃度HBsAg人群(通過隨訪排除了HBV感染早期或恢復期HBsAg/抗HBs轉(zhuǎn)換階段出現(xiàn)的低濃度HBsAg)應屬于慢性HBV感染范疇,

15、 如果以臨床診斷分型則90%以上屬ASC(均為HBsAg/抗HBs/抗HBc陽性模式, HBV DNA<106copies/L), 10%以下屬CHB, 但對照組(高濃度HBsAg無癥狀攜帶者, HBsAg/抗HBs/抗HBc陽性模式和HBsAg/HBeAg/抗HBc陽性模式并存, 許多患者HBV DNA>108copies/L)與研究組相比, 顯然還存在除HBsAg濃度差異以外的其他差別, 這樣的分組是不的、 不合理的, 得出的結(jié)論也是不正確的, 因此我們將慢性HBV感染人群以HBsAg濃度及自然史進行分組研究, 則排除了上述的分組構(gòu)成比差別和其他干擾因素, 結(jié)果和結(jié)論是準確可靠

16、的。    綜上所述, 低濃度HBsAg人群是HBV感染、 傳播過程中形成的一個特殊的群體, 我們認為低濃度HBsAg的產(chǎn)生并較長時間的存在不僅與機體本身的免疫復合物形成和清除能力低下有關(guān), 還與HBV低抗原濃度誘導機體淋巴細胞(特別是T、 B淋巴細胞)產(chǎn)生完全或不完全的免疫耐受有關(guān)(低劑量誘導免疫耐受)8, 而且還可能與HBV的分子生物學機制(S基因分型、 變異)有關(guān)(另文報告), 研究低濃度HBsAg人群免疫耐受產(chǎn)生的機制及免疫耐受的打破對HBV的感染、 傳播、 清除及預防具有重要的、 特殊的臨床和流行病學意義。【文獻】  1 成 軍, 孫關(guān)忠, 陳

17、 瑜, 等. 高低濃度HBsAg血清中7項乙肝標志物的表現(xiàn)模式分析J. 細胞與分子免疫學雜志, 2001, 17(5): 443-444.2 李金明. 感染性疾病血清學檢驗中應重視對弱反應性標本的確認J. 中華檢驗醫(yī)學雜志, 2006, 29(7): 577-580.3 中華醫(yī)學會肝病分會、 感染病學分會. 慢性乙型肝炎防治指南J. 中華肝臟病雜志, 2005, 13: 881-891.4 劉錫光, 祁自柏, 熊詩松. 肝炎實驗室診斷指南M. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2004: 88-99.5 Michelin MA, Crott LS, Assis Pandochi AI, et al. Influence of the electric charge of the antigen and the immune complex (IC) lattice on the IC activation of human complementJ.