實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在甲型流感H1N1檢測中的作用

1、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在甲型流感H1N1檢測中的作用    2011-10-25 1:50:05      作者：王七生 王寧 蔣立立 秦   代寫論文    【摘要】 目的：探討實(shí)時(shí)熒光PCR在甲型流感H1N1檢測中的靈敏性和特異性；方法：選自本地區(qū)50例疑似流感病例，提取咽拭子樣本，核酸分離試劑盒進(jìn)行病毒RNA提取，每份樣本分別使用4種反應(yīng)液（FluA,SWH1,SWFLuA1和RNP）反應(yīng)液進(jìn)行檢測，綜合4種反應(yīng)液的檢測結(jié)果

2、對樣本進(jìn)行判定；結(jié)果：50份標(biāo)本中符合陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)25例，陽性率50%。陽性標(biāo)本送廣西疾控中心復(fù)核，25例樣本復(fù)檢全部符合甲型H1N1病毒核酸特征；結(jié)論 甲型H1N1流感病毒RNA檢測試劑盒，采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對流感病人檢測敏感性高，特異性強(qiáng)，可適用于流感暴發(fā)疫情及臨床重癥病人的快速診斷?！娟P(guān)鍵詞】實(shí)時(shí)熒光PCR；甲型流感H1N1聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）可對特定核苷酸片進(jìn)行指數(shù)級的擴(kuò)增，在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，可以通過凝膠電泳的方法對擴(kuò)增物進(jìn)行定性的分析，也可以通過放射核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描來進(jìn)行定量的分析。所謂實(shí)時(shí)定量PCR就是通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時(shí)檢測從而實(shí)現(xiàn)對起

3、始模板定量及定性的分析，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。各實(shí)驗(yàn)室在開展實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測流感H1N1使用引物探針及技術(shù)要素不規(guī)范影響檢測質(zhì)量，我中心實(shí)驗(yàn)室在2010年7月份對流感疫情中采用北京金豪制藥股份有限公司生產(chǎn)的甲型H1N1流感病毒RNA檢測試劑盒對疑似甲流樣本進(jìn)行應(yīng)急檢測，以檢驗(yàn)試劑質(zhì)量在甲型流感H1N1檢測中的靈敏性和特異性，報(bào)告如下：1材料與方法病毒檢測的標(biāo)本來自本地區(qū)先后發(fā)生的流感樣癥狀疫情,選擇發(fā)病3 d內(nèi),體溫38以上的流感樣疑似病

4、例, 共計(jì)50例流感病例。取200ul咽拭子樣本進(jìn)行核酸提取。采用羅氏公司核酸分離試劑盒按操作程序提取，試劑中陰性對照參與提取，陽性對照不參與提取。1. 3PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)待檢樣本檢測：每份樣本分別使用4種反應(yīng)液（FluA,SWH1,SWFLuA1和RNP）反應(yīng)液進(jìn)行檢測，綜合4種反應(yīng)液的檢測結(jié)果對樣本進(jìn)行判定。采用ABI prism 7500熒光定量PCR檢測儀，熒光信號設(shè)置為：Reporter:FAM Quencher Dyel:NoNE,passive Reference:反應(yīng)總體積為25ul。熒光PCR擴(kuò)增程序步驟逆轉(zhuǎn)錄及變性50°30分鐘，95°3分鐘，95&#

5、176;15秒，50°30秒，72°1分鐘，95°10秒，55°40秒。每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陽性和陰性對照，陰性對照無Ct值或Ct值為0。陽性對照Ct值小于30.0。樣本Ct值37.0報(bào)告該反應(yīng)陽性。2結(jié)果采集臨床診斷流感樣本50例，用實(shí)時(shí)熒光PCR試劑四種探針FluA,SWH1,SWFluA,RNasep進(jìn)行檢測，50份標(biāo)本中符合陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)25例，陽性率50%。陽性標(biāo)本送廣西疾控中心復(fù)核，25例樣本復(fù)檢全部符合甲型H1N1病毒核酸特征。3討論甲型H1N1流感病毒已經(jīng)對人類造成了嚴(yán)重的健康威脅，急需發(fā)展用于快速診斷甲型H1N1流感病毒的實(shí)驗(yàn)室方法。國內(nèi)外用于

6、診斷流感的檢測方法主要有以下幾種：(1)病毒的分離；(2)分子生物學(xué)診斷方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等；(3)免疫學(xué)方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、血凝抑制試驗(yàn)(HI)等。甲型H1N1流感其癥狀與季節(jié)性流感相似，除了在癥狀上的特點(diǎn)之外要在病原學(xué)上進(jìn)行鑒別，以加強(qiáng)對甲型H1N1流感的隔離，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是由美國Applied Biosystems公司推出，是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有靈敏性，特異性，和可靠性更強(qiáng)，能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)，自動化程度高，

7、無污染性，具實(shí)時(shí)和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。Leo Pooh等2發(fā)現(xiàn)PCR檢測方法可檢測早期感染H1N1流感的病人，至少比病毒分離方法敏感500倍。Susanna等3利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對香港第一例感染甲型H1Nl流感的患者進(jìn)行了確診。該方法比傳統(tǒng)的RTPCR敏感性和特異性高，最快可在50min內(nèi)對結(jié)果進(jìn)行判斷，而且該方法可以用不同的解鏈溫度來區(qū)分出H1N1亞型流感病毒和其他H1亞型的流感病毒。因此，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)和美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)推薦使用。我們采用北京金豪股份公司生產(chǎn)的甲型H1N1流感病毒RNA檢測試劑盒。對流感病人檢

8、測結(jié)果表明，該試劑盒敏感性高，特異性強(qiáng)，快速3小時(shí)可獲得檢測結(jié)果，該試劑適用于流感暴發(fā)疫情及臨床重癥病人的快速診斷。參考文獻(xiàn)1 陳繼明, 王志亮, 逄增昌,等1甲型流感病毒熒光RT - PCR檢測方法的設(shè)計(jì)和檢定J.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志, 2005, 1: 206- 208.2Poon LL，Chan KH，Smith GJ，et a1Molecular detection of a novelhuman influenza(H1Nl 1 of pandemic potential by conventional and real-time quantitative RT-PCR assa

9、ysClinical Chemistfy，2009，55(8)：1555-15583Susanna KPL，Kwok?Hung C，Cyril CYY，et a1Confimation of the first Hung Kong case of human 1 infection by novel swine origin influenza A(H1 N1)virus using ultra?rapidreal?time RT?PCRJ Clin Miembiol doi，101128JCM00924-20094甲型H1N1流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)方案（2009年）.    你可能感興趣的論文   &#